過表達STAT1與CD74CD44促進結腸癌細胞粘附和遷移的相關性

徐瑞敏 陳志康 甘惠玲 陳澤倫

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過表達STAT1與CD74CD44促進結腸癌細胞粘附和遷移的相關性

徐瑞敏 陳志康 甘惠玲 陳澤倫

目的 探討信號轉導和轉錄激活子1(STAT1)與CD74/CD44在結腸癌中異常表達與腫瘤轉移的相關性。方法 培養結腸癌細胞株Ls-174-T，待其生長至對數生長期，傳至第3代收集腫瘤細胞，各細胞分為3份。1份行RT-PCR、Western blotting方法檢測STAT1與CD74/CD44表達情況；1份檢測定量粘附細胞數；1份以劃痕實驗檢測細胞遷移能力。統計分析比較STAT1與CD74/CD44在結腸癌細胞中的異常表達情況及與腫瘤遷移和粘附能力的相關性。結果 RT-PCR、Western blotting結腸癌組織中STAT1與CD74/CD44的蛋白及mRNA表達顯著高于正常結腸組織，兩組相比具有統計學差異(P<0.05)。MTT法檢測結果顯示，不同作用時間(0、6、12、24、48 h)不同劑量STAT1與CD74/CD44過表達質粒(0.000、0.001、0.010、0.060、0.100 mg/ml)干預后，結腸癌細胞體外粘附能力明顯加強，與對照組(0.000 mg/ml各組)相比，差異有統計學意義；Transwell結果顯示，不同作用時間(0、6、12、24、48 h)不同劑量STAT1與CD74/CD44過表達質粒(0.000、0.001、0.010、0.060、0.100 mg/ml)干預后，結腸癌細胞體外遷移能力隨著時間及劑量的增加而明顯加強，與對照組(0.000mg/ml各組)相比，差異有統計學意義。結論 STAT1與CD74/CD44在結腸癌細胞中高表達，從而調節結腸癌細胞粘附和遷移能力的作用，表明STAT1與CD74/CD44在結腸癌發生進展中可能與腫瘤的侵襲和轉移密切相關。

轉錄激活子1(STAT1)；CD74/CD44；結腸癌細胞；細胞粘附；遷移

(ThePracticalJournalofCancer,2017,32:1094～1098)

近年來，我國結腸癌的發病率不斷的上升，而且有年輕化的趨勢，腫瘤呈現局部侵襲性，且極易發生轉移。基于STAT1與CD74/CD44的基本功能以及兩者對腫瘤發生共促進關系的研究，我們推斷STAT1與CD74/CD44亦很可能對結腸癌細胞具備同樣的生物學效應，即STAT1與CD74/CD44能夠通過其受體調控結腸癌細胞的粘附和遷移，進而影響結腸癌的侵襲和轉移[1-2]。本研究為明確STAT1與CD74/CD44對結腸癌細胞粘附和遷移力的影響，以期探討其在結腸癌形成中的作用機制。

1 材料與方法

1.1 主要儀器、試劑、細胞

胎牛血清(杭州四季青生物工程有限公司)，結腸癌細胞Ls-174-T(中國科學院細胞庫)，DMEM、胰酶、EDTA(GIBCO公司，美國)TaqMix(東盛生物公司)，培養基(美國GIBCO公司)，MTT試劑盒(北京中杉金橋生物技術有限公司)，Transwell 24孔培養板(美國 Corning 公司)，10 cm2培養皿、96孔板(美國 Corning 公司)。STAT1與CD74/CD44過表達質粒(美國 PeProtech 公司)避光4 ℃保存，倒置相差顯微鏡(OLYMPUS，日本)，超凈工作臺SCW-HS-840型 (蘇州市長春電子儀器廠)，培養箱(Queue systems TM2711美國)，深低溫冰箱(SANYO，AltraLow日本)，全能型高性能臺式冷凍離心機(Heaeus，BiofugeStratos德國)，蒸汽高壓消毒箱(Tuttnauer，2540MK美國)。

1.2 細胞培養與傳代[3]

含10%胎牛血清及雙抗的DMEM培養基對結腸癌細胞Ls-174-T進行培養，置于37 ℃ 5%CO2的孵箱中。傳代時機選擇在細胞密度達到70%以上的時候進行，首先對培養基清洗后，細胞消化采用含0.02%EDTA的胰蛋白酶，2～3 min對消化后的細胞加入同體積的含血清培養基終止消化，采用倒置顯微鏡觀察細胞以了解消化情況，對貼壁細胞進行吹打，并通過5 min 10 000 r/min的離心分離，去除上清，對細胞懸液進行計數，之后接種到新的培養瓶當中繼續培養有待下一次傳代。

1.3 分組及干預方法

待細胞貼壁生長至密度為70%～80%時，在不同作用時間(0、6、12、24、48 h)分別予以不同濃度的STAT1與CD74/CD44過表達質粒(美國 PeProtech 公司)(0.000、0.001、0.010、0.060、0.100 mg/ml)，給藥作用結腸癌細胞Ls-174-T。

1.4 RT-PCR(半定量逆轉錄聚合酶鏈反應)方法

提取總RNA。取2 μg總RNA行逆轉錄cDNA，反應體系為20 μl。吸取逆轉錄產物2 μl，分別加入18 sRNA、以構建好的引物進行PCR反應。反應條件均為95℃預變性5 mins，94 ℃變性30 s，60 ℃30 s，72 ℃60 s，72 ℃7 mins，循環30次。PCR產物溴化乙錠1.5%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像分析系統下進行觀察并拍攝電泳圖像。以18sRNA作為內參照，進行PCR產物的半定量分析，測量各電泳條帶之吸光度積分值(A值)。

1.5 Western blotting方法

取細胞提取100mg總蛋白。SDS-PAGE凝膠電泳，半干法轉膜，加STAT1與CD74/CD44一抗(1∶500)，4 ℃孵育過夜；辣根過氧化物酶標記的二抗(1∶1 000)37 ℃孵育1h。ECL光化學法顯色，用彩色圖像分析系統測定吸光度。

1.6 測定STAT1與CD74/CD44對結腸癌細胞粘附能力的影響[4]

取P3代細胞1×104細胞/孔接種至96孔板中，細胞貼壁后，棄掉原有培養基，分別加入含(0.000、0.001、0.010、0.060、0.100 mg/ml)STAT1與CD74/CD44過表達質粒培養基100 μl進行培養，而設置對照組，只加等量的含胎牛血清培養基，在不同作用時間(0、6、12、24、48 h)，加入20 μL 濃度為5 g/L MTT 試劑，37 ℃孵育4 h，棄掉原有培養基，再加入150 μl DMSO之后，持續振蕩混勻10 min，通過490 nm吸光度的酶標儀進行檢測，參考OD值以表示粘附細胞的數量，按照以下公式計算，細胞粘附抑制率=(1-加藥值/空白值)×100%，實驗數據重復3次取平均值。

1.7 STAT1與CD74/CD44對結腸癌細胞體外遷移的影響[5]

取各組P3代結腸癌細胞于種板前1天，12 h無血清饑餓處理，常規消化、離心收集細胞，(含0.2% FBS)低血清DMEM培養液混懸成5×105/ml密度的單細胞懸液。并把Transwell培養池放入24孔培養板中，100 μg/ml STAT1與CD74/CD44過表達質粒培養基100 μl進行培養，下室內加入含10% FBS500 μl的DMEM培養液，上室內加入(約5×104細胞)100 μl細胞懸液，置于37 ℃孵箱，5% CO2環境內。各組分別于培養0、6、12、24、48 h后，PBS洗2次，用棉球小心擦去上室內細胞，運用4%多聚甲醛固定30 min以后，PBS洗2次，30 min 0.1 %結晶紫染色之后，PBS洗2次，以去掉多余染料，最后顯微鏡下觀察拍照。若在小室內有多余水分需要采用棉簽吸掉，用十二烷基硫酸鈉(SDS)1% 500 μl 30 min溶解細胞。完全溶解之后，取100 μl的細胞裂解液，再次放入96孔板細胞培養板中，通過570 nm酶標儀測定吸光值以了解細胞體外遷移能力。

1.8 統計學方法

2 結果

2.1 結腸癌細胞Ls-174-T的體外形態學變化

培養24 h后，鏡下可見大量圓形、折光性強的有核細胞懸浮在培養基上，換液后可見部分結腸癌細胞已從正常細胞中爬出，貼壁生長，呈長梭形，7天左右細胞長滿瓶底，呈旋渦狀生長。傳至第3代顯微鏡下可見細胞可見生長旺盛、形態均一，呈旋渦狀、梭形生長。通過Giemsa染色后顯示胞質豐富，細胞呈梭形，細胞核染成紫紅色，染色藍紫色。

2.2 細胞表面抗原免疫熒光鑒定

P3代細胞表面抗原CD34表達陰性、表面抗原CD44、CD105表達陽性。符合結腸癌細胞Ls-174-T表型特征。

2.3 MTT法測定STAT1與CD74/CD44對結腸癌細胞粘附能力的影響

MTT法檢測結果顯示，STAT1與CD74/CD44過表達質粒不同濃度干預不同時間后，結腸癌細胞體外粘附能力明顯加強，與對照組(0.000 mg/ml)相比，差異有統計學意義，見表1。

表1 MTT法測定STAT1與CD74/CD44對結腸癌細胞粘附能力的影響

注：①為與0.000mg/ml相比，P<0.05。

2.4 STAT1與CD74/CD44對結腸癌細胞體外遷移的影響

Transwell結果顯示，經不同濃度STAT1與CD74/CD44過表達質粒干預不同時間后，結腸癌細胞體外遷移能力明顯加強，與對照組(0.000 mg/ml)相比，差異有統計學意義，見表2。

表2 STAT1與CD74/CD44對結腸癌細胞體外遷移的影響

注：①為與對照組(0.000 mg/ml)相比，P<0.05。

2.5 兩組治療前后STAT1與CD74/CD44mRNA表達水平比較

RT-PCR檢測結果顯示：STAT1與CD74/CD44mRNA表達水平觀察組顯著高于對照組，兩組相比具有統計學差異(P<0.05)，見表3。

表3 兩組STAT1與CD74/CD44mRNA表達水平比較

注：①為與對照組相比，P<0.05；②為與治療前比較，P<0.05。

2.6 兩組治療前后STAT1與CD74/CD44蛋白表達水平比較

Western blotting結果顯示：STAT1與CD74/CD44蛋白表達水平觀察組顯著高于對照組，兩組相比具有統計學差異(P<0.05)，見表4。

表4 兩組STAT1與CD74/CD44蛋白表達水平比較

注：①為與對照組相比，P<0.05；②為與治療前比較，P<0.05。

3 討論

結腸癌是我國常見的消化道惡性腫瘤之一，位于全世界癌癥發病率排行的第三位。多年來其發病率保持逐年上升的趨勢。結腸癌的復發和轉移，是影響患者治療效果和預后的首要因素[6]。近年來，隨著分子生物學技術的飛速發展和廣泛應用，結腸癌的分子遺傳學特性和其復發轉移相關的生物學模式逐步被發現和了解。結腸癌的轉移和復發是1個多因素作用的復雜過程。雖然廣大醫學和科研工作者進行了充分且細致的研究，但是目前對于結腸癌的轉移和復發，仍然缺乏有效且可靠的方法檢測以及預測疾病的轉歸[7]。對于結腸癌相關的基因表達的研究，不僅可以闡明結腸癌的發生、發展、轉移及復發的機制，而且對臨床上結腸癌的早期診斷、分子生物學分型、復發及轉移的早期檢測以及治療評估有著重要的意義[8-9]，而對于轉移復發的結腸癌，發現并闡明其分子表面標志物的表達模式，對復發及轉移性結腸癌的靶向分子治療也具有重要的應用價值[10]。因此尋找生物學靶標對于疾病的診治至關重要，本研究為探求該病的侵襲機制，尋找靶點基因與疾病的相關性，對該病的治療和預后判斷提供一定的指導價值[11]。

腫瘤的發生發展是1個復雜的過程，腫瘤患者死亡的主要原因則是腫瘤的轉移和侵襲作用。而此過程機制非常復雜，可將其概括為三步說，即蛋白降解酶、腫瘤細胞的遷移、腫瘤細胞的粘附作用[12]。細胞適度的粘附和遷移能力是機體生命活動與防御機制所必需的，但是，粘附和遷移能力的增強或改變均是導致腫瘤侵襲以及轉移的重要因素。當腫瘤細胞的侵襲及粘附能力發生改變，可與局部微環境脫離并降解局部基質，并在遷移能力也異常的情況下，運動至鄰近的組織或穿過基底膜和細胞外基質，到達更遠的部位建立繼發腫瘤，最終導致腫瘤的轉移。體外試驗研究表明，腫瘤細胞的遷移速度與其轉移能力呈正相關。

信號轉導子和轉錄激活子1(STAT1)是1種重要的核轉錄因子，在干擾素信號傳導通路的研究中被發現[12]。STAT1可以在細胞受到外界信號刺激下激活，并直接入核，激活相應的靶基因的轉錄。STAT1由750個氨基酸組成，其分子量約為91kDa，可分為6個結構域：N端保守序列，螺旋區、DNA結合域、鏈接區、SH2結構域及C端轉錄活性域[3]。其DNA結合域可識別的DNA序列堿基數較短，因此可以激活多個靶基因的表達。已有大量研究證明STAT1參與調控與細胞發生、發展、分化和凋亡相關的功能性基因及細胞因子基因的表達。STAT1在原發性肝細胞癌、肺癌和乳腺癌等惡性腫瘤細胞中均存在異常表達的情況。其下游的信號通路對腫瘤的發生、發展及轉移亦起到了重要的作用。STAT1在結腸癌中的表達已有文獻報道。然而其在結腸癌細胞中起到的作用尚未完全闡明。

CD74是1類分子表面標志物，是HLA Ⅱ復合物的γ亞基。已有研究證明CD74在乳癌、肝癌及白血病細胞等多種腫瘤細胞表面表達[1]。CD74在免疫細胞中，可以特異性地與細胞因子MIF結合，并在CD44的共刺激下，激活胞內ERK1/2的磷酸化，進而由MAPK通路調控多種轉錄因子的表達。既往有研究證實，MAPK信號通路是STAT家族多種分子基因表達的調控信號通路；而CD74/CD44共刺激信號可能與STAT1存在循環正反饋的雙向調控機制；CD74與STAT1的表達存在一定的相關性。有研究者采用高壓液相色譜聯合質譜分析的方法，對淋巴結轉移的三陰性乳腺癌的中STAT1和CD74的表達進行了初步的分析，提示淋巴結轉移的TNBC細胞更傾向于高表達STAT1，并且其表達水平與CD74的表達水平顯著相關；轉染過表達CD74質粒的三陰性乳腺癌細胞株同時會上調STAT1的表達[13]。但已發現的各類腫瘤細胞當中，STAT1具有能升高細胞周期蛋白D1水平，具有促細胞增殖功能的作用，從而進一步促進腫瘤的侵襲和生長遷移；CD74/CD44還可上調血管內皮生長因子的表達，促進腫瘤血管生成間接刺激腫瘤生長和轉移。因此，STAT1與CD74/CD44對腫瘤的發生和發展是多方面多層次影響的，其主要通過自身分泌、相關受體、胞內相關因子等環節影響腫瘤細胞的遷移和粘附以及凋亡和分化能力，進而影響腫瘤的發生發展以及侵襲和轉移[14]。但是其具體調控機制及信號傳導，尚不清晰。

本研究為探討結腸癌形成過程中觀察STAT1與CD74/CD44的表達情況以及其對結腸癌細胞粘附和體外遷移能力的影響。研究結果顯示，RT-PCR、Western blotting分子生物學檢測結果顯示結腸癌細胞中STAT1與CD74/CD44表達顯著高于正常結腸組織細胞；通過STAT1與CD74/CD44過表達質粒預處理細胞后，觀察發現不同劑量的STAT1與CD74/CD44過表達質粒對結腸癌細胞遷移和粘附能力具有一定的差異性，劑量越高其細胞遷移和粘附能力越強；同時隨著干預事件的延長，結腸癌細胞的遷移和粘附能力也隨之增強。推斷STAT1與CD74/CD44過表達質粒亦很可能對結腸癌細胞具備同樣的生物學效應，即STAT1與CD74/CD44過表達質粒能夠通過其受體調控結腸癌細胞的粘附和遷移，進而影響結腸癌的侵襲和轉移。

綜上所述，濃度和時間是對結腸癌細胞株具有不同的轉移和侵襲能力，隨著時間和濃度的增加，其遷徙和粘附能力逐漸增強。我們推測，STAT1與CD74/CD44過表達質粒可能通過其促進細胞凋亡和促侵襲的作用對結腸癌的發生發展發揮調控作用。本研究闡明了STAT1與CD74/CD44過表達質粒對結腸癌細胞粘附作用和侵襲作用的分子相關性，但是其主要的發病機制有待于深入的研究，同時通過本研究也為結腸癌的臨床診斷和預后判斷提供了新的策略方法，確定了STAT1與CD74/CD44與結腸癌的相關性，以此作為抗腫瘤治療分子靶點，或可為臨床治療結腸癌及結腸癌的轉移提供新的、有良好前景的方法。

[1] Popovici V,Budinska E,Tejpar S,et al.Identification of a poor-prognosis BRAF-mutant-like population of patients with colon cancer〔J〕.J Clin Oncol,2012,30(12):1288-1295.

[2] Perez-Villamil B,Romera-Lopez A,Hernandez-Prieto S,et al.Colon cancer molecular subtypes identified by expression profiling and associated to stroma,mucinous type and different clinical behavior.〔J〕.BMC Cancer,2012,12:260.

[3] Merlos-Suárez A,Barriga FM,Jung P,et al.The intestinal stem cell signature identifies colorectal cancer stem cells and predicts disease relapse〔J〕.Cell Stem Cell,2011,8(5):511-524.

[4] Salazar R,Roepman P,Capella G,et al.Gene expression signature to improve prognosis prediction of stage Ⅱ and Ⅲ colorectal cancer〔J〕.J Clin Oncol,2011,29(1):17-24.

[5] Oh SC,Park YY,Park ES,et al.Prognostic gene expression signature associated with two molecularly distinct subtypes of colorectal cancer〔J〕.Gut,2012,61(2):1291-1298.

[6] Mettu RK,Wan YW,Habermann JK.A 12-gene genomic instability signature predicts clinical outcomes in multiple cancer types〔J〕.Int J Biol Markers,2010,25(4):219-228.

[7] Peng J,Wang Z,Chen W,et al.Integration of genetic signature and TNM staging system for predicting the relapse of locally advanced colorectal cancer〔J〕.Int J Colorectal Dis,2010,25(11):1277-1285.

[8] Kennedy RD,Bylesjo M,Kerr P,et al.Development and independent validation of a prognostic assay for stage Ⅱ colon cancer using formalin-fixed paraffin-embedded tissue〔J〕.J Clin Oncol,2011,29(35):4620-4626.

[9] Sveen A, Gesen TH,Nesbakken A,et al.ColoGuidePro:a prognostic 7-gene expression signature for stage Ⅲ colorectal cancer patients〔J〕.Clin Cancer Res,2012,18(21):6001-6010.

[10] Tsuji S,Midorikawa Y,Takahashi T,et al.Potential responders to FOLFOX therapy for colorectal cancer by Random Forests analysis〔J〕.Br J Cancer,2012,106(1):126-132.

[11] Kinsella RJ ,Khri A,Haider S,et al.Ensembl BioMarts:a hub for data retrieval across taxonomic space〔J〕.Database (Oxford),2011,2011:bar030.

[12] Merlos-Suarez A,Barriga FM,Jung P,et al.The intestinal stem cell signature identifies colorectal cancer stem cells and predicts disease relapse〔J〕.Cell Stem Cell,2011,8(5):511-524.

[13] Aceto N,Sausgruber N,Brinkhaus H,et al.Tyrosine phosphatase SHP2 promotes breast cancer progression and maintains tumor-initiating cells via activation of key transcription factors and a positive feedback signaling loop〔J〕.Nat Med,2012,18(4):529-537.

[14] Biagi JJ,Raphael MJ,Mackillop WJ,et al.Association between time to initiation of adjuvant chemotherapy and survival in colorectal cancer:a systematic review and meta-analysis〔J〕.JAMA,2011,305(22):2335-2342.

(編輯：吳小紅)

Overexpression of STAT1 and CD74CD44 to Promote Adhesion and Migration of Colon Cancer Cells

XURuimin,CHENZhikang,GANHuiLing,etal.XiangyaHospital,CentralSouthUniversity,Changsha,410008

Objective To investigate the signal transducer and activator of transcription 1 (STAT1) and CD74 / CD44 expression in colon cancer cells with abnormal tumor metastasis.Methods Cultured colon cancer cell line Ls-174-T,let it grow to a logarithmic growth phase,the third passage collected tumor cells,each cell was divided into 3 parts.A line of RT-PCR,Western blotting method was used to detect STAT1 and CD74/CD44 expression;a quantitative detection of adherent cells;a scratch test to detect cell migration.Statistical analysis and comparison of STAT1 and CD74 / CD44 in colon cancer cells and abnormal expression correlated with tumor migration and adhesion ability.Results The expression of STAT1 and CD74 / CD44 protein in colorectal cancer tissues was significantly higher than that in normal colorectal tissues (P<0.05).MTT assay test results showed that different time (0,6,12,24,48 h) and different doses of STAT1 and CD74/CD44 over-expression plasmid (0.000,0.001,0.010,0.060,0.100 mg/ml) intervention colon cancer cells In vitro adhesion significantly strengthened with the control group (0.000 mg/ml in each group),the difference was statistically significant;Transwell results showed that different time (0,6,12,24,48 h) and different doses of STAT1 CD74/CD44 over-expression plasmid (0.000,0.001,0.010,0.060,0.100 mg/ml) after the intervention of colon cancer cells in vitro migration with increasing dose and time and significantly strengthened with the control group (0.000 mg/ml in each group),the difference was statistically significant.Conclusion STAT1 and CD74/CD44 is highly expressed in colon cancer cells,thereby regulating the role of colon cancer cell adhesion and migration,indicating that STAT1 and CD74 / CD44 may be associated with tumor invasion and metastasis in colon cancer progression.

Signal transducer and activator of transcription 1(STAT1);CD74 / CD44;Colon cancer cell;Cell adhesion;Migration

410008 中南大學湘雅醫院(徐瑞敏，陳志康)；570000 海南省農墾總醫院(徐瑞敏，甘惠玲，陳澤倫)

陳志康

10.3969/j.issn.1001-5930.2017.07.016

R735.3+5

A

1001-5930(2017)07-1094-05

2016-08-08

2017-04-10)