易普利姆瑪對(duì)Lewis肺癌小鼠體內(nèi)PTHrP表達(dá)的影響及與癌細(xì)胞衰老的關(guān)系

劉雯雯 方寧遠(yuǎn)

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易普利姆瑪對(duì)Lewis肺癌小鼠體內(nèi)PTHrP表達(dá)的影響及與癌細(xì)胞衰老的關(guān)系

劉雯雯 方寧遠(yuǎn)

目的 建立Lewis肺癌小鼠模型，觀察Ipilimumab對(duì)荷瘤小鼠體內(nèi)PTHrP及MCT1表達(dá)的影響并探討與癌細(xì)胞衰老的關(guān)系。方法 取C57BL/6小鼠共30只，建立Lewis肺癌小鼠模型，隨機(jī)分為對(duì)照組、低劑量處理組、高劑量處理組，每組10只。開(kāi)始給藥，給藥劑量與方法：低濃度Ipilimumab處理組3 mg/kg，高濃度Ipilimumab處理組 5 mg/kg，共給藥5次，對(duì)照組給予等量生理鹽水。采用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)3組中PTHrP、MCT1的表達(dá)。結(jié)果 3組動(dòng)物細(xì)胞PTHrP蛋白的分泌及MCT1的陽(yáng)性表達(dá)率高度一致，且隨Ipilimumab濃度的增高而增高，第3組表達(dá)水平較第2組和第1組明顯升高，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，第2組表達(dá)水平較第1組明顯升高，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。且2個(gè)指標(biāo)陽(yáng)性表達(dá)率均與細(xì)胞衰老相關(guān)基因βGal的表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān)性(P<0.05)。結(jié)論 Ipilimumab處理后的荷瘤小鼠通過(guò)上調(diào)PTHrP、MCT1的表達(dá)，延緩癌細(xì)胞的衰老，最終引起癌細(xì)胞侵襲或轉(zhuǎn)移。

肺癌；易普利姆瑪；甲狀旁腺激素相關(guān)蛋白；單羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1；細(xì)胞衰老

(ThePracticalJournalofCancer,2017,32:1052～1055)

Ipilimumab是1種單克隆抗體，是新型的T細(xì)胞增強(qiáng)劑及免疫系統(tǒng)激活劑。本研究主要采用免疫組化法對(duì)不同劑量Ipilimumab處理的3組動(dòng)物細(xì)胞進(jìn)行PTHrP、MCT1檢測(cè)，探討其在肺癌中表達(dá)的相關(guān)性及與癌細(xì)胞衰老的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物及細(xì)胞株

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為近交系C57BL/6小鼠，雄性，體質(zhì)量16～18 g，清潔級(jí)，購(gòu)于上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，飼養(yǎng)于上海交通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，室溫20 ℃，濕度 (60%±5%)，飼料及墊料均經(jīng)消毒處理。實(shí)驗(yàn)前小鼠適應(yīng)環(huán)境飼養(yǎng)1周。Lewis肺腺癌細(xì)胞株(LLC，為C57BL/6小鼠源性肺腺癌細(xì)胞)購(gòu)自上海中科院細(xì)胞生物研究所。瘤細(xì)胞培養(yǎng)于高糖完全培養(yǎng)液中。Ipilimumab購(gòu)于香港華特藥房，廠家百時(shí)美施貴寶公司。即用型快速免疫組化MaxVisionTM檢測(cè)試劑盒購(gòu)于福州邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司。細(xì)胞衰老β-半乳糖苷酶(SA-β-gal)染色試劑盒購(gòu)自北京碧云天公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組及動(dòng)物腫瘤模型的建立

無(wú)菌條件下對(duì)2只C57BL/6小鼠進(jìn)行右側(cè)腋下皮下注射細(xì)胞懸液0.2 ml(Lewis肺腺癌細(xì)胞株)，注意觀察小鼠生長(zhǎng)狀況。接種10天后，脫頸處死Lewis肺癌小鼠，放入75%酒精浸泡消毒10min，在超凈臺(tái)上分離瘤體，用生理鹽水洗凈后剪碎，研磨，染色，計(jì)算活細(xì)胞數(shù)>95%，調(diào)整腫瘤細(xì)胞懸液濃度為1×107/m1瘤細(xì)胞，繼續(xù)皮下接種5只小鼠，每只接種0.2 ml，飼養(yǎng)于SPF級(jí)環(huán)境，如此皮下接種2次后接種30只小鼠。皮下接種后14天，可以觸及皮下直徑約10 mm腫塊，隨機(jī)分為對(duì)照組、低劑量處理組、高劑量處理組，每組10只。開(kāi)始給藥，給藥劑量與方法：低濃度Ipilimumab處理組3 mg/kg，高濃度Ipilimumab處理組5 mg/kg，共給藥5次，對(duì)照組給予等量生理鹽水。

1.3 PTHrP、MCT1、βGal的檢測(cè)

標(biāo)本經(jīng)固定、脫水、包埋、切片、染色，按即用型快速免疫組化MaxVisionTM試劑盒說(shuō)明步驟操作檢測(cè)MCT1、PTHrP 表達(dá)。標(biāo)本用PBS漂洗2次，室溫下固定，加入X-Gal染色液，調(diào)節(jié)pH為6.0，孵育48 h，鏡下觀察，陽(yáng)性物質(zhì)為藍(lán)色沉淀，采用Image.ProPlus圖文分析系統(tǒng)，隨機(jī)選取100個(gè)細(xì)胞，測(cè)定每個(gè)細(xì)胞中陽(yáng)性著色面積與該細(xì)胞總面積的百分比，取其均值作為 SA-β-Gal 陽(yáng)性表達(dá)結(jié)果。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 PTHrP、MCT1組織化學(xué)檢測(cè)結(jié)果

3組動(dòng)物細(xì)胞PTHrP、MCT1的陽(yáng)性表達(dá)趨勢(shì)一致，且隨Ipilimumab濃度增高而增強(qiáng)(表1)：第3組表達(dá)水平較第2組和第1組明顯升高，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；第2組表達(dá)水平較第1組明顯升高，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且兩者陽(yáng)性表達(dá)情況呈顯著正相關(guān)(相關(guān)系數(shù)0.486,雙側(cè)顯著性P=0.006<0.01)。

2.2 βGal組織化學(xué)檢測(cè)結(jié)果

βGal作為細(xì)胞衰老的常用指標(biāo)，會(huì)隨著細(xì)胞的老化而表達(dá)增強(qiáng)。從蛋白水平檢測(cè)了βGal的變化，以驗(yàn)證3組細(xì)胞的衰老情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：與第1組相比，第2組和第3組細(xì)胞中兩種蛋白的表達(dá)水平明顯下降(P<0.05)，且第3組兩種蛋白的表達(dá)水平明顯低于第2組(P<0.05) (表2)。PTHrP、MCT1的陽(yáng)性表達(dá)情況與βGal的陽(yáng)性表達(dá)情況呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.01)。

表1 3組細(xì)胞 PTHrP、MCT1、βGal 表達(dá)情況

表2 細(xì)胞 PTHrP、MCT1、βGal 表達(dá)三組組間比較( LSD 檢測(cè))

3 討論

易普利姆瑪(Ipilimumab)是1種細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原4(CTLA-4)的抑制劑，與CTLA-4特異性的結(jié)合，上調(diào)T淋巴細(xì)胞活化增殖[1]，滲入腫瘤中發(fā)揮抗癌作用。2011年美國(guó)食品藥品管理局年批準(zhǔn)了Ipilimumab用于惡性黑色素瘤的免疫治療。臨床治療中，Ipilimumab單獨(dú)或聯(lián)合其他藥物在治療惡性黑色素瘤方面均取得了較好療效[2]，近年來(lái)Ipilimumab治療肺癌取得良好療效的研究也有報(bào)道[3]。Ipilimumab治療肺癌的推薦劑量也經(jīng)歷了諸多實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證[4]，在我們的實(shí)驗(yàn)選取的處理劑量為3 mg·kg-1、5 mg·kg-1。Ipilimumab通過(guò)活化免疫系統(tǒng)殺傷腫瘤細(xì)胞，故不可避免地引起免疫相關(guān)性不良反應(yīng)，近期研究[5]發(fā)現(xiàn)接收Ipilumumab治療的轉(zhuǎn)移性黑色素瘤患者可出現(xiàn)副腫瘤綜合征及惡病質(zhì)相關(guān)，其機(jī)制不明。

細(xì)胞衰老是機(jī)體中常見(jiàn)生物學(xué)現(xiàn)象，是指細(xì)胞脫離細(xì)胞周期喪失增殖能力后進(jìn)入的1種相對(duì)穩(wěn)定的狀態(tài)，是正常細(xì)胞的必然歸宿。研究表明腫瘤細(xì)胞具有衰老障礙而表現(xiàn)出無(wú)限增殖的能力，這也就是機(jī)體出現(xiàn)惡病質(zhì)的原因。腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)在1種缺氧的環(huán)境中，上調(diào)糖酵解和適應(yīng)酸中毒是腫瘤由原位癌轉(zhuǎn)變?yōu)榍忠u性癌的關(guān)鍵因素。MCT1是單羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)泵家族(MCTs)家族中一員，主要存在于多種腫瘤細(xì)胞中，參與乳酸的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)，加速腫瘤細(xì)胞的代謝，調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的凋亡。研究證實(shí)[6]晚期腫瘤可高表達(dá)MCT1，但對(duì)于肺癌的相關(guān)研究比較少。PTHrP作為1種分泌蛋白，可調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)周期，改變癌細(xì)胞的增殖率、調(diào)節(jié)凋亡傾向，改變腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移[7]、影響肺癌癥患者的生存率[8]。

PTHrP、MCT1指標(biāo)均可調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞衰老逃逸，參與腫瘤細(xì)胞侵襲，Ipilumumab治療后病人也會(huì)出現(xiàn)惡病質(zhì)狀態(tài)，那么Ipilumumab、PTHrP、MCT1 3者關(guān)系如何？該研究主要采用免疫組化法對(duì)3組經(jīng)不同劑量Ipilumumab處理后的動(dòng)物細(xì)胞進(jìn)行PTHrP、MCT1檢測(cè)，探討其在肺癌中表達(dá)的相關(guān)性及與細(xì)胞衰老的關(guān)系。

細(xì)胞經(jīng)歷DNA損傷、端粒功能下降、癌基因激活后首先出現(xiàn)細(xì)胞衰老，細(xì)胞衰老便成為抑制正常細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵條件，這可對(duì)抗細(xì)胞的無(wú)限增生而對(duì)機(jī)體起到保護(hù)作用。細(xì)胞繞過(guò)衰老途徑是其永生化及癌變的必要條件。衰老逃逸參與腫瘤惡化、發(fā)展，并成為今后預(yù)測(cè)腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的因素之一。細(xì)胞衰老存在多種標(biāo)志物，現(xiàn)在應(yīng)用最廣、特異性比較高的為β-半乳糖苷酶[9]。之前研究表明腫瘤細(xì)胞在發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移后可大量分泌PTHrP，而衰老相關(guān)指標(biāo)β-Gal表達(dá)明顯下降，表明腫瘤細(xì)胞發(fā)生了衰老逃逸，那么PTHrP和腫瘤細(xì)胞衰老逃逸之間關(guān)系如何，PTHrP是通過(guò)什么途徑引起腫瘤細(xì)胞衰老逃逸的呢？PTHrP是一種分泌蛋白，在胎兒及成人的肺組織及肺癌組織中都有表達(dá)，在肺的發(fā)育、肺的生理功能、肺損傷及肺癌細(xì)胞的侵襲性上均有重要作用。研究表明PTHrP通過(guò)影響細(xì)胞生長(zhǎng)周期而改變癌細(xì)胞的增殖率、調(diào)節(jié)凋亡、阻止腫瘤血管生成等，從而調(diào)節(jié)腫瘤的進(jìn)展、腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移、改變腫瘤對(duì)治療的敏感性，并在不同方面影響腫瘤的病理發(fā)生，影響肺癌患者的生存率。大多研究提示在肺癌中PTHrP的表達(dá)是1個(gè)有益的預(yù)后因子，如Hastings 等觀察兩株肺腺癌細(xì)胞株，轉(zhuǎn)染PTHrP 后肺癌細(xì)胞的DNA合成受抑制，肺癌細(xì)胞的增殖率下降，肺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)速度減慢。Yamada[10]和Bhatia[11]也分別在實(shí)驗(yàn)中用抗PTHrP抗體治療腫瘤患者，均降低了骨轉(zhuǎn)移的發(fā)生率，并增加了腫瘤細(xì)胞的凋亡。但也有研究顯示PTHrP的過(guò)度表達(dá)可能與機(jī)體的惡病質(zhì)狀態(tài)有關(guān)。早在 2000 年就有研究指出PTHrP 的表達(dá)與細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化有關(guān)，PTHrP、P53可能在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中共同發(fā)揮作用。2012年王小虎等人的研究也指出胃腺癌組織高表達(dá)PTHrP，中低分化組織表達(dá)陽(yáng)性率較高[12]。近期多項(xiàng)研究表明PTHrP能促進(jìn)乳腺癌、前列腺癌、非小細(xì)胞肺癌的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移[13]，亦是骨溶解最重要的調(diào)節(jié)因子之一。 腫瘤細(xì)胞是生長(zhǎng)在相對(duì)低氧的環(huán)境中，增加糖酵解、適應(yīng)酸中毒是腫瘤由原位癌轉(zhuǎn)變?yōu)榍忠u性癌的必備條件。糖酵解越旺盛，腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)越快、侵襲性越強(qiáng)，往往迅速?gòu)?fù)發(fā)，預(yù)后更差。MCT1表達(dá)予腫瘤細(xì)胞膜，負(fù)責(zé)將乳酸轉(zhuǎn)運(yùn)出細(xì)胞，加速糖酵解過(guò)程，延緩腫瘤細(xì)胞衰老，增加腫瘤細(xì)胞侵襲。在我們的實(shí)驗(yàn)中觀察到經(jīng)高劑量Ipilumumab處理后的腫瘤細(xì)胞，β-Gal表達(dá)明顯下降，表明細(xì)胞衰老被抑制，腫瘤細(xì)胞大量繁殖，而這一過(guò)程有PTHrP分泌的逐漸增多，同時(shí)伴隨MCT1表達(dá)的明顯升高，且兩者升高具有顯著的正相關(guān)性。從中我們猜測(cè)高劑量Ipilumumab處理后的腫瘤細(xì)胞分泌大量PTHrP蛋白，通過(guò)MCT1途徑，提高腫瘤細(xì)胞的高代謝，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、分化等，從而有效的抑制其衰老，最終從原位癌轉(zhuǎn)變成浸潤(rùn)癌，使機(jī)體最終成為惡病質(zhì)狀態(tài)。 在腫瘤高發(fā)的當(dāng)今，免疫治療為晚期腫瘤患者帶來(lái)了新的希望，但免疫治療尚缺乏相應(yīng)的分子標(biāo)記來(lái)篩選最佳適用患者，同時(shí),目前臨床研究發(fā)現(xiàn)免疫治療的近期毒性較小,但其遠(yuǎn)期毒性仍未可知，如在我們的動(dòng)物試驗(yàn)中就發(fā)現(xiàn)Ipilumumab處理后腫瘤細(xì)胞處于衰老逃逸狀態(tài)，機(jī)體最終成為惡病質(zhì)狀態(tài)。但我們的實(shí)驗(yàn)有一定局限性，如樣本數(shù)量少，僅限于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。

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(編輯：吳小紅)

Effect of Lpilimumab on the Expression of PTHrP in Lewis Lung Cancer Mice and Its Relationship with the Aging of Cancer Cells

LIUWenwen，F(xiàn)ANGNingyuan.RenjiHospitalAffiliatedtoShanghaiJiaotongUniversitySchoolofMedicine，Shanghai,200127

Objective To establish Lewis lung cancer mice model,and observe the effect of ipilimumab on PTHrP and MCT1 in tumor bearing mice and its relationship with cancer cell senescence.Methods A total of 30 Lewis mice which was established Lewis lung cancer mice model were divided into the control group,low dose treatment group and high dose treatment group,and each group with 10 cases.Start to give medicine,dosage and methods:low concentration ipilimumab treatment group 3mg/kg,high concentration ipilimumab treatment group 5mg/kg,a total of 5 times,the control group to give the same amount of normal saline.The expression of PTHrP and MCT1 in the 3 groups was detected by immunohistochemistry.Results The positive expression of PTHrP protein secretion and MCT1 in the 3 groups of animal cells rate highly consistent and tend to increase with the increasing of the concentration of ipilimumab,2 indicators in expression in group 3 than in group 2 and group 1 expression increased significantly,there had statistical difference (P<0.05);in group 2 expression than in the group 1 expression was significantly increased,there had statistical difference (P<0.05).And the positive expression rate of the 2 indicators were significantly negative correlated with the expression of cell senescence associated gene Gal,and the results were statistically significant (P<0.05).Conclusion Ipilimumab treatment of tumor bearing mice by up regulation of MCT1,PTHrP expression,delay the aging of cancer cells,and eventually cause cancer cell invasion or metastasis.

Lung cancer;Lpilimumab;PTHrP;Single carboxylic acid transporter 1;Cell senescence

200025 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院

10.3969/j.issn.1001-5930.2017.07.003

R734.2

A

1001-5930(2017)07-1052-04

2016-08-19

2017-04-20)