HSPC238對Hela細(xì)胞增殖和侵襲能力的影響

鐘裕恒 黃 湘 梁 睿 楊海鑫 歐錦留

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·基礎(chǔ)研究·

HSPC238對Hela細(xì)胞增殖和侵襲能力的影響

鐘裕恒 黃 湘 梁 睿 楊海鑫 歐錦留

目的 探討高表達(dá)和干擾HSPC238對Hela細(xì)胞增殖和侵襲能力的影響。方法 將pcDNA3.1-HSPC238高表達(dá)和pLL3.7-HSPC238干擾載體分別瞬時轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞，然后采用EdU增殖和Transwell侵襲實驗，檢測HSPC238對Hela細(xì)胞增殖和侵襲能力的影響。結(jié)果 與對照組相比，轉(zhuǎn)染了pcDNA3.1-HSPC238質(zhì)粒的Hela細(xì)胞增殖和侵襲能力下降，轉(zhuǎn)染了pLL3.7-HSPC238質(zhì)粒的Hela細(xì)胞增殖和侵襲能力增強(qiáng)，以上結(jié)果均有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。結(jié)論 HSPC238高表達(dá)時能抑制Hela細(xì)胞的增殖和侵襲，干擾HSPC238時促進(jìn)Hela細(xì)胞的增殖和侵襲。

HSPC238；Hela細(xì)胞；增殖；侵襲

(ThePracticalJournalofCancer,2017,32:1045～1047)

HSPC238(又叫 RN181)，由LOC51255基因編碼，含有153個氨基酸，具有E3泛素連接酶活性。我們前期實驗研究發(fā)現(xiàn)HSPC238在CIN中低表達(dá)[1]，且隨著CIN級別升高，染色程度降低，但在宮頸癌中表達(dá)未有降低[2]。那究竟HSPC238在宮頸癌中扮演著什么角色，高表達(dá)和干擾HSPC238對宮頸癌Hela細(xì)胞的增殖和侵襲能力有什么影響，將在本文中探索。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

宮頸癌Hela細(xì)胞存于本實驗室，pcDNA3.1質(zhì)粒，pcDNA3.1-HSPC238質(zhì)粒，pLL3.7質(zhì)粒，pLL3.7-HSPC238質(zhì)粒由本實驗室構(gòu)建保存，凱基試劑盒(KGA331-50),胎牛血清(Hyclone，Hyclone SV30087.02)，DMEM-高糖培養(yǎng)基(GIBCO)，青鏈霉素(碧云天)，matrigel膠(BD公司，356234)，PBS磷酸鉀緩沖液等。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)和質(zhì)粒轉(zhuǎn)染

將Hela細(xì)胞接種于細(xì)胞培養(yǎng)板，在合適條件下培養(yǎng)24 h。當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到80%時，依照LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑說明將PcDNA3.1空質(zhì)粒、PcDNA3.1-HSPC238質(zhì)粒、pLL3.7陰性對照載體和pLL3.7-HSPC238干擾載體分別轉(zhuǎn)染至Hela細(xì)胞。然后在相同條件下培養(yǎng)48 h，待用。

1.3 Western blot實驗

樣品處理后上樣，每個樣本設(shè)3個復(fù)孔，GAPDH作為內(nèi)參，然后電泳，轉(zhuǎn)膜，加一抗(1∶500)反應(yīng)1.5 h,最后加入用辣根過氧化物酶標(biāo)記的相應(yīng)二抗，發(fā)光顯色。

1.4 EdU實驗檢測細(xì)胞增殖能力

Hela細(xì)胞爬片至所需的生長密度，取EDU工作液(組分A)500 μl/樣，混合等體積的培養(yǎng)基。加入細(xì)胞爬片中，37 ℃孵育 2 h。去除培養(yǎng)基后加入1 ml 3.7%中性甲醇至細(xì)胞爬片上，室溫孵15 min。用3%BSA洗滌細(xì)胞2次，加入1 ml 0.5%PBST每孔，室溫孵育20 min，去除洗滌液。加入0.5 ml 配置好的 Click-iT反應(yīng)混合液至每個孔，室溫避光孵育30 min，實驗重復(fù)3次。

1.5 Transwell檢測細(xì)胞侵襲能力

收集對數(shù)期細(xì)胞，計數(shù)2×106/ml細(xì)胞，用無血清DMEM培養(yǎng)基重懸，取100 μl(1×105個)Hela細(xì)胞懸液，加入配置好的Transwell小室上室，在下室加入700 μl完全培養(yǎng)基。在37 ℃,5%CO2孵育72 h后，取出小室，用棉簽擦去上室的細(xì)胞，4%多聚甲醛固定15 min，PBS洗滌一次，結(jié)晶紫染色10 min，檢測細(xì)胞并拍照統(tǒng)計，實驗重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 Western blot實驗結(jié)果

與對照組相比，轉(zhuǎn)染了pcDNA3.1-HSPC238質(zhì)粒的Hela細(xì)胞其HSPC238表達(dá)增強(qiáng)，轉(zhuǎn)染了pll3.7-HSPC238載體的Hela細(xì)胞其HSPC238表達(dá)減弱。

2.2 EdU實驗結(jié)果

采用兩樣本t檢驗統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，與轉(zhuǎn)染pcDNA3.1空質(zhì)粒組(83.00±6.55)相比，轉(zhuǎn)染了pcDNA3.1-HSPC238質(zhì)粒的Hela細(xì)胞增殖能力降低(18.00±2.00)，P<0.05，差異有統(tǒng)計學(xué)意義；采用兩樣本t檢驗法統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，與轉(zhuǎn)染pLL3.7空載體組(27.00±3.61)相比，轉(zhuǎn)染了pLL3.7-HSPC238載體的Hela細(xì)胞增殖能力增強(qiáng)(73.33±5.51)，P<0.05，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2.3 Transwell實驗結(jié)果

圖1為Transwell侵襲實驗結(jié)果。采用兩樣本t檢驗法統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，與轉(zhuǎn)染pcDNA3.1空質(zhì)粒組相比(83.00±6.55)，轉(zhuǎn)染了pcDNA3.1-HSPC238質(zhì)粒的Hela細(xì)胞侵襲能力下降，穿過小室基底膜到達(dá)下室的細(xì)胞明顯減少(18.00±2.00)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與轉(zhuǎn)染pLL3.7空載體組相比(74.67±7.64)，轉(zhuǎn)染了pLL3.7-HSPC238載體的Hela細(xì)胞侵襲能力增強(qiáng)，穿過小室基底膜到達(dá)下室的細(xì)胞明顯增加(109.00±6.00)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

1為mpty組，2為pcDNA3.1組，3為pcDNA3.1-HSPC238組，4為pLL3.7組，5為pLL3.7-HSPC238組。

3 討論

HSPC238(又叫 RN181)，由LOC51255基因編碼，含有153個氨基酸，屬于C3HC4型鋅指蛋白。自從2008年我們課題組關(guān)注該轉(zhuǎn)錄因子以來，我們對HSPC238進(jìn)行了系列研究，我們通過免疫組化染色發(fā)現(xiàn)HSPC238在肝癌中表達(dá)降低，并且能夠通過MAPK途徑抑制肝癌細(xì)胞的增殖和侵襲[3]。當(dāng)HSPC238過表達(dá)時可以延緩肝癌細(xì)胞的細(xì)胞周期[4]，并且可以上調(diào)RB蛋白(論文正在投稿中)，進(jìn)一步通過激光共聚焦，co-IP和pull down實驗研究發(fā)現(xiàn)，HSPC238可以與四種腫瘤相關(guān)蛋白(MT2A、HO-1、RPS27A和Ubb)相互作用[5]，并且可以影響它們的mRNA和蛋白水平[6]。HSPC238不僅在肝癌中起作用，還在胃癌[7]、大腸癌[8]的生長機(jī)制中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。HSPC238在消化系統(tǒng)的多種組織中都起作用，我們想要知道它在其他系統(tǒng)是否起著同樣的作用，所以將目光投向了高發(fā)病率的宮頸癌。

我們的前期研究發(fā)現(xiàn)，HSPC238蛋白在宮頸癌中并未像是在肝癌組織中那樣低表達(dá)，而是在宮頸上皮內(nèi)瘤變組織中表達(dá)降低。我們對這1現(xiàn)象很好奇，推測HSPC238在宮頸癌中的作用是否會像是TGF-β1一樣[9]，在宮頸上皮內(nèi)瘤變組織和宮頸癌組織中起著相反的作用，即在宮頸上皮內(nèi)瘤變組織中起抑制生長，在宮頸癌中起促進(jìn)生長的作用。所以本次實驗研究高表達(dá)和干擾HSPC238對宮頸癌Hela細(xì)胞增殖和侵襲能力的影響，我們發(fā)現(xiàn)高表達(dá)HSPC238能抑制Hela細(xì)胞的增殖和侵襲，干擾HSPC238可以促進(jìn)Hela細(xì)胞的增殖和侵襲。本次研究結(jié)果表明高表達(dá)HSPC238并未像高表達(dá)TGF-β1一樣，在宮頸癌細(xì)胞增殖和侵襲中起促進(jìn)作用，而是起抑制作用。而和我們前期在肝癌中的研究對比時發(fā)現(xiàn)，高表達(dá)HSPC238在宮頸癌細(xì)胞和肝癌細(xì)胞中同樣可以抑制細(xì)胞增殖和侵襲，但是為什么HSPC238蛋白在宮頸癌中并未像是在肝癌組織中那樣低表達(dá)？通過查閱文獻(xiàn)我們發(fā)現(xiàn)，1個蛋白在癌組織中高表達(dá)不一定預(yù)示它有促癌作用，如P53在很多癌組織中高表達(dá)[10]，給人們留下1個P53是促癌基因的假象，然而事實上，野生型p53是1個具有非常重要功能的抑制基因。所以HSPC238在宮頸癌中的表達(dá)量與所起的作用不是存在必然關(guān)系的，另外，由于宮頸癌和肝癌的微環(huán)境不同，在宮頸癌中高表達(dá)的HSPC238是否出現(xiàn)了基因突變，影響了其本該有的抑癌功能，還有待我們的進(jìn)一步的探索。

[1] Brophy TM,Raab M,Daxecker H,et al.RN181,a novel ubiquitin E3 ligase that interacts with the KVGFFKR motif of platelet integrin alpha(IIb)beta3〔J〕.Biochem Biophys Res Commun，2008,369(4):1088-1093.

[2] 鐘裕恒，黃 湘，陳敬林,等.HSPC238在宮頸上皮內(nèi)瘤變和宮頸癌中的表達(dá)與意義〔J〕.中國免疫學(xué)雜志,2016,17(2):235-238.

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(編輯：吳小紅)

The Effect of HSPC238 on the Proliferation and Invasion of Hela Cells

ZHONGYuheng,HUANGXiang,TANJiayu,etal.ChongzuoTraditionalChineseMedicalHospital,Chongzuo,532200

Objective To investigate the effect of up-regulation and down-regulation of HSPC238 on the proliferation and invasion of Hela cells.Methods PcDNA3.1-HSPC238 vector and PLL3.7-HSPC238 vector was transiently transfected into Hela cells respectively.We tested the proliferation and invasion of Hela cells by EdU proliferation assay and transwell assay.(P<0.05).Results Compared with the control group,the proliferation and invasion ability of Hela cells increased after transfected with PcDNA3.1-HSPC238 vector,decreased after transfected with PLL3.7-HSPC238 vector.Conclusion When upregulated,HSPC238 could inhibite the proliferation and invasion of Hela cells.When downregulated,it can promote the proliferation and invasion of Hela cells.

HSPC238；Hela cell；Proliferation；Invasion

國家自然科學(xué)基金(編號：81101534)；廣東省醫(yī)學(xué)科研基金項目(編號：A2013875)

532200 南方醫(yī)科大學(xué)附屬中山博愛醫(yī)院

黃 湘

10.3969/j.issn.1001-5930.2017.07.001

R737.33

A

1001-5930(2017)07-1045-03

2016-08-08

2017-05-04)