幾種食用地衣提取物抑制幽門螺桿菌活性研究

任梅蓉++王立松++王欣宇+陳曉華

門螺桿菌（Helicobacter. Pylori，H.P）是革蘭陰性細菌，與慢性胃炎和消化性潰瘍關系十分密切，與胃癌的發生有很大的關聯。20世紀90年代以來，國內外學者已經研究出一些治療幽門螺桿菌的治療藥物，但目前這些藥物治療方案中仍存在許多問題，主要表現在藥物治療費用高，藥物嚴重的副作用，治療效果不穩定，易產生耐藥性等。地衣是共生菌 （子囊菌或擔子菌）與共生藻（藍藻、綠藻）經過漫長的生物演化過程共生聯合形成的一類具有高度遺傳穩定性的生物有機體。由于地衣共生的特殊性，地衣能夠產生許多獨有的次生代謝產物，這些獨有的產物往往有特殊的活性（3-5）。近年來，地衣代謝物生物活性研究在國際上已經受到了越來越多的關注，但其在幽門螺桿菌活性抑制方面的研究鮮有報道。為了探討地衣提取物對幽門螺桿菌體外抑制作用，我們選用了云南少數民族常食用的5種地衣，進行體外藥物敏感、抑菌濃度和殺菌濃度的測定。

材料與方法

材料。（1）地衣 紅雪茶（Lethariella cladonioides）、條衣（Everniastrum cirrhatum）、鹿石蕊（Cladonia rangiferina）、長松羅（Usnea longissima）和青蛙皮（Labaria orientalis）均由中國科學院植物研究所標本館提供。

（2）試劑 BHIA（腦心浸液固體培養基，Oxoid，Basingstoke，UK），selective supplement（Oxoid，Basingstoke，UK），微需氧發生袋（法國梅里埃），馬血清（上海越研生物科技有限公司），實驗所用其它試劑均為分析純。

方法。（1）菌種活化及培養。H. Pylori菌種由江南大學食品科學與工程重點實驗室提供。經快速尿素酶、涂片革蘭染色、氧化酶和觸酶鑒定為陽性后，傳代培養為實驗菌株。采用微需氧袋達到微需氧條件（85%氮氣、10%二氧化碳和5%氧氣），Hp菌株接種于含有8%馬血清的腦心浸液培養基中于37℃孵育72小時天，洗下菌落，采用比濁法計數，配置成含菌濃度為3*109/ml 的菌液。

（2）地衣提取物制備。將粉碎后的地衣樣品用8倍體積丙酮和甲醇浸泡24小時，提取3次，合并提取液，旋轉蒸發濃縮得到100mg/ml濃度的實驗母液，置于冰箱中待用。倍比稀釋法配制藥物溶液，濃度分別為100mg、50mg、25mg、12.5mg和6.25mg/ml。取無菌6mm濾紙片，于上述藥液中浸泡過夜，干燥備用。

（3）地衣提取物抑制H.p活性篩選。制備好的H.p菌懸液用L型玻棒均勻涂布在培養基上，將前一天制備好的含有1mg提取物的6mm濾紙片放于培養基上，培養72小時，培養方法同前，觀察抑菌圈大小，取抑菌圈直徑的平均值。

（4）藥物敏感性試驗。將含有不同濃度梯度提取物的紙片放于已涂布H.p的培養基上，在微需氧環境中培養72小時后，觀察抑菌圈大小，參考相關文獻制定藥敏結果判定標準，可分為高度敏感：抑菌圈直徑>15mm；中度敏感：10mm<抑菌圈直徑<15mm；低度敏感：抑菌圈直徑<10mm，不敏感：無抑菌圈。統計時，將無效、低敏算作耐藥，中敏和高敏定位為敏感。

（5）MIC值測定。在藥敏實驗的基礎上進行最低抑菌濃度的測定（2）：用培養基將藥物濃度分別稀釋為： 120、60、30、15、6.75、3.75、1.8 mg/ml。分別接種H.p，在相同培養條件下，培養72小時，取出，觀察細菌在在不同濃度的藥物平板上生長情況，以小于5個菌落的最低濃度為最小抑菌濃度。

實驗結果與分析

地衣樣品提取物抑制H.p活性初篩結果。五種地衣不同溶劑的提取物中：紅雪茶和長松蘿的丙酮提取物，長松蘿、鹿石蕊、青蛙皮的甲醇提取物均由不同抑制H.Pylori作用；條衣丙酮和甲醇提取物、紅雪茶甲醇提取物、鹿石蕊及青蛙皮丙酮提取物均無抑菌活性。

H.p對提取物敏感性實驗結果。紅雪茶的丙酮提取物為100mg時抑菌圈直徑最大，高達15.5mm，高度敏感；為50mg時抑菌圈直徑為10.6mm，中度敏感；長松蘿丙酮提取物為100mg時，抑菌圈直徑為10.3mm，中度敏感；其余的提取物為低度敏感或無敏感性。

MIC測定結果。5種提取物MIC比較見圖。結果表明：這5種提取物都對供試菌有不同程度的抑制作用：紅雪茶丙酮提取物對H.p的抑菌活性最強，MIC為7.5mg/ml，長松蘿丙酮提取物對H.p的MIC為15mg/ml，鹿石蕊甲醇提取物對H.p的MIC為30mg/ml，長松蘿和青蛙皮甲醇提取物的MIC均為60 mg/ml。

討論

H.p的臨床治療方案通常可分為質子泵抑制劑或鉍劑加上克拉霉素、甲硝唑、阿莫西林和四環素等抗生素中的2-3種的三聯或四聯療法，其較高的治愈率已經達到共識（1）。 但隨著對H.p根除治療的開展，H.p耐藥性以及藥物副作用等問題逐漸凸顯出來。因此尋找新的天然抗菌藥物是研究人員需要迫切解決的問題。

生存環境獨特的物種，由于受到其他物種的競爭壓力和外部環境的影響，極可能產生特殊的防御能力，因而更容易產生結構新穎的活性次生代謝產物。地衣藻菌共生的獨特生存方式使其產生了地衣專有的化學物質，但一直以來，由于實驗條件、技術、對地衣代謝物質認識的局限性及地衣自身生長緩慢難以得到大量原料的限制，地衣次生代謝物及活性的研究非常緩慢。

本實驗采用體外微生物敏感性測定方法，評價和比較了5種云南食用地衣對H.p體外抑菌效果。實驗結果表明，5種地衣的不同溶劑提取物對H.p有一定的抑菌效果，抑菌活性依次為：紅雪茶（丙酮）>長松蘿（丙酮）>鹿石蕊（甲醇）>長松蘿（甲醇）=青蛙皮（甲醇）。其中，紅雪茶（丙酮）的MIC最小，為7.5mg/ml， 有望進一步進行開發與利用。

本實驗結果除了為研究地衣提取物抗菌活性和機理提供了理論依據，為高原地衣生物活性的研究進行數據積累和資料儲備，篩選具有良好生物活性和潛在商用及醫用價值的地衣物種外，還可為H.p攜帶者提供一個通過飲食來預防疾病發生的思路。

基金項目：

云南省教育廳科學研究基金項目（項目編號：2013Y111）