洋蔥AcPME基因的克隆及序列分析

孫亞玲++陳立++孫雨晴++楊妍妍++吳雄++曹辰興++霍雨猛

摘要：以洋蔥花蕾為試材，通過RACE試驗獲得了AcPME基因的全長cDNA序列，GenBank登錄號為JF913196.1。該基因DNA序列包含2 786個堿基，4個外顯子，3個內含子，cDNA序列長度為2 228 bp，編碼序列長度為2 001 bp，編碼666個氨基酸。生物信息學分析顯示AcPME蛋白存在明顯的信號肽和跨膜區域（SP/TM）、PMEI結構域和PME結構域，在PME家族分類中屬于第Ⅰ類，即含有一個長的N末端前區域（PRO-region）。氨基酸同源比對與系統進化分析表明，AcPME蛋白與水稻、玉米、高粱等單子葉植物的同源蛋白具有較高的一致性。三維結構模式圖顯示該蛋白具有一個明顯的凹溝，4個果膠結合位點氨基酸殘基（T423、Q453、R565和W567），2個活性位點氨基酸殘基（D476和D497）。本研究為洋蔥AcPME基因的結構域蛋白互作及功能研究奠定了基礎。

關鍵詞：洋蔥；果膠甲酯酶（PME）；克隆；序列分析

中圖分類號：S633.201文獻標識號：A文章編號：1001-4942（2017）06-0007-07

AbstractThe sequence of AcPME gene was obtained through rapid amplification of cDNA ends （RACE） based on the sample of onion flower bud. The GenBank accession number was JF913196.1. The AcPME genomic DNA consisted of 2 786 bases with 4 exons and 3 introns. The cDNA length was 2 228 bp with a 2 001 bp ORF and encoded 666 amino acids. The bioinformatic analysis showed that the AcPME protein consisted of a signal peptide and transmembrane domain （SP/TM）， a PMEI structural domain and a PME structural domain， which belonged to type I with a long N terminal PRO-region in the PME families. The amino acid homologous alignment and phylogenetic tree analysis exhibited that there were higher identities between AcPME and PME of homologous monocotyledons such as rice， maize and sorghum. The three-dimensional structure map showed AcPME protein had an obvious shallow cleft， 4 amino acid residues （T423， Q453， R565 and W567） binding to substrate and 2 residues （D476 and D497） involved in catalysis. The research laid a foundation for the biological functions of AcPME protein and the interactions between PMEI and PME domains.

KeywordsOnion； Pectin methylesterase （PME）； Cloning； Sequence analysis

果膠甲酯酶（pectin methylesterase，PME）是催化果膠復合物中甲酯化的D-半乳糖醛酸單元去甲酯化的一類細胞壁蛋白，根據其保守的結構域該酶組成了一個巨大的基因家族。在分類上依據其N端前區域的長短及有無，分為兩種類型，Type Ⅰ和Type Ⅱ，它們在植物不同的生長發育階段及不同生理過程中通過作用于細胞壁而發揮作用[1]。已有的研究發現，果膠甲酯酶參與了多種生理過程，如果實成熟、器官脫落、小孢子發育、花粉管伸長、種子萌發、抗病性、形成層細胞分化等[2-5]。

植物花粉管的發育是植物生殖發育的重要環節，花粉管壁和其他部位的細胞壁不同，由單層果膠組成，沒有纖維素和胼胝質等成分，所以果膠甲酯酶基因在花粉和花粉管的生長發育中至關重要[6]。在擬南芥花藥發育過程中，約有20 000個基因在花粉中表達，但其中僅有約10%的基因為花粉特異性表達[7]。迄今為止，研究者們已對油菜[8]、矮牽牛[9]、玉米[10]、紫花苜蓿[11，12]、亞麻[13]、煙草[14]、擬南芥[15]和白菜[16，17]等植物的花或花粉特異表達的PME基因進行了研究。

本課題組在研究洋蔥育性相關基因差異表達的過程中，發現了一個大小約為350 bp的片段始終只在可育材料中出現[18]。我們回收測序此片段，并做序列比對結果顯示，該基因片段編碼蛋白具有果膠甲酯酶結構域，屬于果膠甲酯酶超家族成員，該片段代碼為AcPME3031（GenBank Accession GU384209）。本研究以洋蔥AcPME基因部分片段GU384209為切入點，通過RACE試驗獲得AcPME基因的全長cDNA序列，以利對其進行后續的生物信息學分析研究。

1材料與方法

1.1試驗材料

洋蔥育性恢復系12-10（S， MsMs）花蕾采自山東省農業科學院蔬菜花卉研究所實驗基地，用液氮速凍后，儲存于-80℃超低溫冰箱中。