白介素-17基因多態(tài)性與肺結(jié)核易感性的相關(guān)性研究

邱美華 盛云峰 崔巖飛 鮑志堅(jiān) 楊盛婭

白介素-17基因多態(tài)性與肺結(jié)核易感性的相關(guān)性研究

邱美華 盛云峰 崔巖飛 鮑志堅(jiān) 楊盛婭

肺結(jié)核；白介素-17；基因多態(tài)性；易感性

肺結(jié)核是全球死亡率最高的傳染病，全球大約1/3人口感染過(guò)結(jié)核分枝桿菌（MTB），然而感染者中大約僅有5%～10%發(fā)展為臨床肺結(jié)核[1]。由此認(rèn)為個(gè)體在結(jié)核分枝桿菌易感性方面存在差異。結(jié)核易感性與遺傳、年齡、性別、環(huán)境、營(yíng)養(yǎng)、吸煙、卡介苗（BCG）接種等高危因素有關(guān)。其中遺傳因素是影響結(jié)核易感性的重要因素，可以影響宿主與MTB間的平衡關(guān)系，導(dǎo)致不同的感染結(jié)局[2]。此前國(guó)內(nèi)研究報(bào)道HLACw、蛋白酪氨酸磷酸酶非受體型（PTPN22）、白介素（IL）-22等基因多態(tài)性與肺結(jié)核易感性存在一定相關(guān)性[3-5]。IL-17主要來(lái)源于Th17細(xì)胞，近年研究發(fā)現(xiàn)，IL-17在防御MTB方面發(fā)揮重要作用[6]。國(guó)內(nèi)較少有關(guān)IL-17基因單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphisms，SNPs）與肺結(jié)核易感性的研究報(bào)道。本文著重探討IL-17基因多態(tài)性與肺結(jié)核發(fā)病之間的關(guān)系，并初步探討IL-17在肺結(jié)核發(fā)病中的免疫調(diào)節(jié)作用。

1 資料與方法

1.1 臨床資料選擇2012年10月—2015年10月在浙江省結(jié)核病診療中心就診的肺結(jié)核患者（病例組）100例，男61例，女39例，平均年齡（42.8±12.1）歲，平均病程3.8個(gè)月。對(duì)照組為同期在我院健康體檢者100名，男58名，女42名，平均年齡（43.6±11.8）歲。兩組研究對(duì)象的年齡（t=0.473，P=0.636）和性別構(gòu)成（χ2=0.187，P=0.666）差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。肺結(jié)核診斷標(biāo)準(zhǔn)：中華醫(yī)學(xué)會(huì)結(jié)核病學(xué)分會(huì)制定的《肺結(jié)核診斷和治療指南》關(guān)于肺結(jié)核的診斷標(biāo)準(zhǔn)[7]，并排除結(jié)核性胸膜炎和肺外結(jié)核。對(duì)照組入組標(biāo)準(zhǔn)：無(wú)肺結(jié)核臨床表現(xiàn)，無(wú)胸部影像學(xué)檢查異常。兩組研究對(duì)象均為漢族，無(wú)合并其他傳染病、慢性病、腫瘤和自身免疫性疾病。所有研究對(duì)象均簽署知情同意書(shū)。

1.2 方法通過(guò)發(fā)放問(wèn)卷調(diào)查表獲得研究對(duì)象的發(fā)病危險(xiǎn)因素，問(wèn)卷調(diào)查內(nèi)容包括：性別、年齡、吸煙史、飲酒史、居住地、肺結(jié)核患者接觸史、肺結(jié)核疾病家族史、卡介苗接種史等。肺結(jié)核患者根據(jù)《肺結(jié)核診斷和治療指南》[7]予以“2個(gè)月異煙肼-利福平-乙胺丁醇-吡嗪酰胺/4個(gè)月異煙肼-利福平-乙胺丁醇”的初治方案。

1.2.1 抽提外周血DNA抽取兩組肘靜脈血液10 mL置于EDTA抗凝靜脈管中，并放置于-80℃冰箱內(nèi)備用。采用GenEluteTM Blood Genomic DNA Kit（SIGMA，NA2010-1KT）試劑盒，根據(jù)說(shuō)明書(shū)抽提基因組DNA，提取完成的DNA按體積比1：10以TE緩沖液稀釋后作為工作濃度存放于-20℃冰箱備用。

1.2.2 基因多態(tài)性分析PCR反應(yīng)引物利用Primer Premier 5軟件設(shè)計(jì)，由上海Invitrogen生物公司合成。IL-17F位點(diǎn)rs763780C/T所用引物為：FP：GCTGAGTGGATATGCACCTCTT，RP：GTTGGAGAAG GTGCTGGTGA，探針為：P-C：FAM-CATCCACCGTG TGCA-MGB，P-T：VIC-CATCCACCATGTGCA-MGB。IL-17A位點(diǎn)rs2275913G/A所用引物為：FP：TAGGA ACATGAATTTCTGCCCT，RP：TCAGGGGTGACACCA TTTTG，探針為：P-G：FAM-TCCTTCAGAAGGAGA G-MGB，P-A：VIC-TCCTTCAGAAGAAGAG-MGB。TaqMan PCR體系為（20μL）：DNA模版1μL、濃度500nmol/L的上下游引物各1μL、DNA酶-free水 6μL、1X qPCR master Mix 10μL，TaqMan探針T/A（250nM）0.5μl，TaqMan探針C/G（250nM）0.5μL（Huirui Biotechnology Co，Ltd，上海，中國(guó)）。PCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5min，進(jìn)入循環(huán)后，95℃變性10s加上60℃退火45s，共40個(gè)循環(huán)。DNA酶-free水作為陰性對(duì)照。每個(gè)樣本做3個(gè)重復(fù)。

1.2.3 lL-17檢測(cè)采用ELISA方法測(cè)定，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，以標(biāo)準(zhǔn)品濃度作橫坐標(biāo)，OD450作縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，根據(jù)樣品的OD450值在標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)圖上查出相應(yīng)樣本的濃度。對(duì)每個(gè)樣本做3個(gè)復(fù)孔，取其平均值。分別測(cè)定對(duì)照組、病例組治療前和治療后6個(gè)月的IL-17水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。兩組間SNP位點(diǎn)等位基因、基因型頻率比較均采用χ2檢驗(yàn)，對(duì)SNP位點(diǎn)基因型進(jìn)行Hardy— Weinberg遺傳平衡檢驗(yàn)。計(jì)量資料以表示，兩樣本均數(shù)的比較采用t檢驗(yàn)。對(duì)肺結(jié)核發(fā)病危險(xiǎn)因素進(jìn)行Logistic多因素回歸分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 危險(xiǎn)因素與肺結(jié)核發(fā)病間的多因素分析經(jīng)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，肺結(jié)核家族史、結(jié)核接觸史及卡介苗接種史是肺結(jié)核患者發(fā)病高危因素（P<0.05），見(jiàn)表1。

表1 危險(xiǎn)因素與肺結(jié)核發(fā)病的分析（例）

2.2 兩組研究對(duì)象IL-17 SNPs等位基因頻率與基因型分布兩組基因型和等位基因的分布頻率均符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律（P>0.05）。rs763780的T等位基因頻率與C等位基因比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=3.996，P<0.05）；見(jiàn)表2。兩組rs2275913和rs763780基因型和等位基因分布比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），見(jiàn)表3。

表2 兩組研究對(duì)象IL-17 SNPs等位基因頻率[例（%）]

表3 兩組研究對(duì)象IL-17 SNPs基因型分布[例（%）]

2.3 兩組研究對(duì)象IL-17比較病例組（未治療）血清IL-17水平與對(duì)照組比較明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。抗結(jié)核治療6個(gè)月后，病例組IL-17水平明顯下降，與治療前比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見(jiàn)表4。

表4 兩組研究對(duì)象IL-17比較（pg/mL）

3 討論

肺結(jié)核主要與細(xì)胞免疫有關(guān)，當(dāng)MTB侵入機(jī)體后，抗原遞呈細(xì)胞通過(guò)分泌多種細(xì)胞因子（包括TNF-α、IL-2、IL-6、IL-10、IL-17、IL-22等）調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞等炎性細(xì)胞，組成一個(gè)復(fù)雜的免疫網(wǎng)絡(luò)，限制和清除MTB。其中IL-17是由Th17細(xì)胞分泌的特征性細(xì)胞因子，其中IL-17A、IL-17F是其中重要的組成部分，可參與誘導(dǎo)、調(diào)節(jié)局部組織慢性炎癥反應(yīng)[8]。但I(xiàn)L-17啟動(dòng)子區(qū)基因多態(tài)性與肺結(jié)核間是否具有緊密聯(lián)系，同時(shí)是否通過(guò)IL-17表達(dá)來(lái)影響肺結(jié)核發(fā)生及治療等均不完全清楚。本研究中，兩組的基本臨床資料無(wú)明顯差異，對(duì)其環(huán)境因素進(jìn)行分析后發(fā)現(xiàn)，肺結(jié)核家族史、接觸史及卡介苗接種史是肺結(jié)核發(fā)病的影響因素，其中肺結(jié)核家族史可能與肺結(jié)核遺傳易感性相關(guān)。

IL-17A rs2275913位點(diǎn)和IL-17F rs763780位點(diǎn)是目前研究IL-17最多的兩個(gè)SNP位點(diǎn)，因SNPs基因型受種族和地區(qū)等多種因素影響，所以本次研究均選擇浙江省漢族人群實(shí)施研究。本研究發(fā)現(xiàn)rs2275913和rs763780的基因型與肺結(jié)核發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)無(wú)明顯相關(guān)性，本研究與Abhimanyu等[9]的結(jié)果相一致。但據(jù)其他文獻(xiàn)報(bào)道，西班牙人群中IL-17 rs2275913的GG基因型與肺結(jié)核高風(fēng)險(xiǎn)存在相關(guān)性[10]，Jin等[11]也發(fā)現(xiàn)rs763780的CC基因型增加肺結(jié)核發(fā)病的風(fēng)險(xiǎn)。本研究結(jié)果顯示，rs763780位點(diǎn)等位基因T顯著高于等位基因C（P<0.05），提示rs763780的等位基因T可能是肺結(jié)核發(fā)病的易感基因，增加肺結(jié)核發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，與Peng等[12]的研究結(jié)果相一致。

IL-17通過(guò)CXCL9/10趨化中性粒細(xì)胞向感染病灶的部位聚集，并參與結(jié)核肉芽腫的形成，還可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞吞噬MTB，起到保護(hù)作用[13]。本研究顯示治療前病例組IL-17水平顯著高于對(duì)照組，表明在MTB負(fù)荷下，機(jī)體Th17細(xì)胞分泌大量IL-17，結(jié)果與Cowan等[14]的研究相一致。而治療6個(gè)月后IL-17水平顯著降低，說(shuō)明隨著細(xì)菌負(fù)荷量的下降，Th17細(xì)胞的刺激因素減少，IL-17分泌減少。由此可以推測(cè)IL-17可能成為肺結(jié)核療效觀察和預(yù)后判斷的參考指標(biāo)。

綜上所述，IL-17基因多態(tài)性在不同地區(qū)、種族中存在不同研究結(jié)果。本研究雖得出一定研究數(shù)據(jù)，也可為肺結(jié)核疾病防治提供重要參考，但仍存在不足，如研究樣本數(shù)量小，不足以代表整個(gè)漢族人群，所以尚需擴(kuò)大研究樣本。此外，此次研究的基因位點(diǎn)較少，還需增加基因位點(diǎn)以更深入研究，提高研究結(jié)果的可靠性。

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（收稿：2016-08-21修回：2016-10-27）

杭州市科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目（No.20120533Q26）

杭州市紅十字會(huì)醫(yī)院結(jié)核科（浙江省結(jié)核病診療中心）（杭州310003）

邱美華，Tel：13073694218；E-mail：louie15@sina.com