涼膈散對內毒素致急性肺損傷大鼠肺組織病理學及血中性粒細胞凋亡的影響

周 勇趙 瑋

涼膈散對內毒素致急性肺損傷大鼠肺組織病理學及血中性粒細胞凋亡的影響

周 勇1趙 瑋2

目的觀察涼膈散對內毒素（LPS）致急性肺損傷（ALI）大鼠肺組織病理學及血中性粒細胞（PMN）凋亡的影響。方法健康雄性SD大鼠72只，隨機分為正常對照組、ALI模型組、涼膈散大、中、小劑量組和強的松治療組，每組12只。LPS（2mg/kg）氣管內滴注復制急性肺損傷模型。各組大鼠分別以生理鹽水、涼膈散不同劑量、強的松灌胃。計算各組大鼠肺組織病理學積分，流式細胞儀檢測PMN的凋亡改變。結果病理學炎癥積分：12h模型組高于正常對照組[（2.08±0.12）分比（0.33± 0.03）分，P<0.01]，12h涼膈散大、中、小劑量組均低于模型組[（0.83±0.09）分、（1.00±0.09）分、（1.17± 0.08）分比[（2.08±0.12）分，P<0.01或P<0.05]，24h模型組高于正常對照組[（2.25±0.11）分比（0.41± 0.04）分，P<0.01]，涼膈散大、中、小劑量組均低于模型組[（0.67±0.05）分、（1.17±0.07）分、（1.33±0.06）分比（2.25±0.11）分，P<0.01或P<0.05]。中性粒細胞凋亡指數：12h模型組低于正常對照組[（51.36± 3.99）%比（71.71±4.13）%，P<0.01]，12h涼膈散大、中劑量組高于模型組[（66.37±4.25）%、（61.6± 5.02）%比（51.36±3.99）%，P<0.05]，24h模型組低于正常對照組[（63.04±4.89）%比（80.82±5.19）%，P<0.01]，涼膈散大劑量組高于模型組[（71.32±5.32）%比（63.04±4.89）%，P<0.05]。結論涼膈散可誘導急性肺損傷時中性粒細胞凋亡，抑制中性粒細胞發揮活性作用，從而減輕急性肺損傷肺部炎癥反應，其機制可能是通過抑制核轉錄因子-κB表達實現。

大鼠；急性肺損傷；涼膈散；病理學；中性粒細胞；凋亡

急性肺損傷（ALI）是由非心源性的各種肺內、外致病因素如嚴重感染、創傷、彌漫性血管內凝血、休克等原發疾病引起，臨床主要表現為急性進行性加重的呼吸困難和難治性低氧血癥，進一步發展可演變為急性呼吸窘迫綜合征（ARDS）[1]。目前認為過度失調的炎癥反應是ALI發生發展的機制之一。在ALI患者肺泡灌洗液中發現中性粒細胞（PMN）是主要的炎性細胞，它一方面可以釋放多種如蛋白酶、花生四烯酸、活性氧族等細胞毒性產物導致肺組織損傷；另一方面，它還可以釋放一些促炎分子如生長因子、細胞因子和趨化因子等促進炎性反應[2-3]。

涼隔散載于宋《太平惠民和劑局方》，其功效為瀉火解毒，清上泄下。文獻報道，涼隔散治療ALI、ARDS獲得一定的效果[4-5]，能夠抑制內毒素誘導的急性肺損傷小鼠核轉錄因子-κB（NF-κB）表達的增強，同時還能抑制炎癥因子如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）及白細胞介素-6（IL-6）的表達，減輕肺組織損傷[6]。本課題研究涼膈散對急性肺損傷模型大鼠主要炎性細胞——中性粒細胞凋亡的干預作用，探討涼膈散治療急性肺損傷的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物雄性清潔級SD大鼠72只，體質量（200±20）g，由浙江中醫藥大學動物實驗中心提供，許可證號：SYXK（浙）2013-0184。

1.2 實驗藥物涼膈散（大黃、樸硝、甘草、梔子各9g，薄荷、黃芩各6g，連翹18g）購自杭州市紅十字會醫院中藥房，水煎濃縮至4g生藥/mL；強的松片（浙江仙居制藥股份有限公司，批號131089），生理鹽水溶至1mg/mL。

1.3 主要實驗試劑和儀器膜聯蛋白-異氰酸熒光素（Annexin V-FITC）凋亡檢測試劑盒（美國Sigma公司），流式細胞儀（美國FACS Calibur公司）。

1.4 實驗方法

1.4.1 分組和造模SD大鼠72只，隨機分為正常對照組、ALI模型組、涼膈散大、中、小劑量組和強的松治療組，每組12只。除正常對照組外，均采用內毒素（LPS）溶液（2mg/kg）氣管內滴注復制急性肺損傷模型[7]，1天1次，連續2天。

1.4.2 藥物干預從第2次氣管內滴注LPS 1h后予藥物，每天2次，連續給藥3天。正常對照組、ALI模型組每次胃飼生理鹽水1mL/100g；強的松治療組每次胃飼強的松10mg/kg；涼膈散大、中、小劑量組分別予涼膈散11.88g/kg、5.94g/kg、2.97g/kg，加生理鹽水稀釋至4mL，分2次灌胃。

1.4.3 標本采集造模后12、24h每組各處死6只大鼠，麻醉后剖開腹腔暴露下腔靜脈收集血液，血標本離心制備血清，注入加有肝素（濃度500U/mL）0.4mL的試管中以提取PMN。取肺組織，右肺中葉肺組織置于PBS配置的10%甲醛溶液中固定。余肺置－70℃保存。

1.4.4 病理組織學檢查右肺中葉肺組織在以PBS配置的10%甲醛溶液中固定24h后，矢狀切面右肺門處斜切肺門緣，取厚約5mm肺組織，脫水、透明、浸蠟、石蠟包埋、切片，分別行HE染色。根據光鏡下肺組織炎癥細胞浸潤和上皮脫落的程度分為4級[8]：“－”未見明顯炎癥細胞浸潤；“+”少量炎癥細胞浸潤，氣管結構完整；“+++”見大量炎癥細胞浸潤，并可見管壁破壞及（或）上皮脫落；“++”界于“+”和“+++”之間。分別記為0、1、2、3分。

1.4.5 提純PMN高速低溫離心機離心l0min（4℃，2000rpm），取白細胞層及部分血漿與等量D-Hanks液混勻。將稀釋血漿、白細胞層沿管壁緩慢疊加于分層液表面，形成清晰界面。離心30min（20℃，2000rpm）。吸棄上清液及薄膜層，沉淀物即為PMN。用紅細胞裂解液去除紅細胞。離心，棄上清。用D-Hanks液清洗細胞×3次，洗后離心，末次離心后棄上清，加入RMP I-1640培養液重懸細胞待測。

1.4.6 Annexin V和碘化丙啶（PI）雙標法測定中性粒細胞凋亡分離純化后的PMN懸浮于孵育緩沖液中，加Annexin V-FLUOS和PI，室溫下孵育15min，流式細胞儀雙通道檢測5000個細胞，激發波長488nm，發射波長515nm和610nm。Annexin V陽性為凋亡早期細胞，PI陽性為壞死細胞，Annexin V、PI雙陽性為凋亡晚期/壞死細胞。以Annexin V+/PI-細胞（右下象限）占所有細胞的百分比表示PMN的凋亡指數[9]。

1.5 統計學方法應用SPSS19.0統計軟件進行數據分析，計量資料數據以均數±標準差表示，組間比較采用One-Way ANOVA分析。P<0.05表示差異有統計學意義。

2 實驗結果

2.1 各組大鼠病理學炎癥積分比較各時相模型組病理學炎癥積分均高于正常對照組（P均<0.01），12h涼膈散中、小劑量組高于正常對照組（P<0.05）；12h和24h涼膈散大、中、小劑量組、強的松組均低于模型組（P<0.05或P<0.01），各治療組之間比較，差異無統計學意義（P均>0.05），見表1。

表1 各組大鼠病理學炎癥積分比較

表1 各組大鼠病理學炎癥積分比較

注：與正常對照組比較，*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較，△P< 0.05，△△P<0.01

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2.2 各組大鼠中性粒細胞凋亡指數比較12h、24h模型組中性粒細胞凋亡指數均低于正常對照組（P< 0.01）；12h、24h強的松組均高于模型組（P<0.01或P<0.05），12h涼膈散大、中劑量組高于模型組（P< 0.05），涼膈散小劑量組與模型組比較，差異無統計學意義（P＞0.05），涼膈散小劑量組低于強的松組（P< 0.05）。24h涼膈散大劑量組高于模型組（P<0.05），中、小劑量組與模型組比較，差異無統計學意義（P＞0.05），見表2。

表2 各組大鼠中性粒細胞凋亡指數比較

表2 各組大鼠中性粒細胞凋亡指數比較

注：與正常對照組比較*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較，△P<0.05，△△P<0.01；與強的松組比較，▲P<0.05

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3 討論

PMN在各種炎性因子如LPS、腫瘤壞死因子（TNF-α）、白細胞介素（IL-1）的作用下，聚集于肺微血管內皮并被激活，再由肺血管進入肺組織并持續活化，釋放一系列損傷介質，引起彌漫性肺泡損害；還通過激活NF-κB從而誘導IL-1β、IL-8、TNF-α等釋放引起炎癥級聯瀑布效應，繼而導致ALI[2，9]。凋亡PMN的脫顆粒、呼吸爆發等致炎能力下降，并更容易被吞噬細胞識別、吞噬。吞噬細胞吞噬大量凋亡PMN后，其產生和釋放促炎介質的功能受到抑制[10]。炎癥反應時，通過快速凋亡機制清除炎癥局部的PMN，達到促進炎癥消散從而限制肺損傷的目的。但是研究[3]表明，ALI時滲出到肺組織的PMN存在凋亡延遲，存活時間延長，持續釋放毒性內容物，造成肺組織的損傷。本研究結果顯示，12h、24h模型組中性粒細胞凋亡指數均低于正常對照組（P<0.01），也證明急性肺損傷中存在中性粒細胞凋亡延遲。

中醫認為，肺主氣，司呼吸，開竅于鼻，肺為嬌臟，易感外邪。肺損傷發病多因感受外邪（如邪毒六淫、癘氣等），屬溫病范疇，熱迫血瘀，瘀熱互結于肺，氣機不通，肺通調水道功能失司，水液內停，而致肺水腫；影響氣機升降，導致肺氣上逆而喘。肺與大腸相表里，肺部邪熱下移于大腸，與陽明積滯搏結，大便不通，極易使邪毒淤積腸道，損傷黏膜，進入血液循環，從而加劇膿毒血癥，加重肺組織的炎癥反應。早期運用清熱解毒藥，可阻止邪毒入里陷內。涼隔散方中連翹輕清透散，清熱解毒，清透上焦之熱；薄荷清利頭目、利咽；黃芩清透上焦之熱，清透胸膈之熱；梔子清利三焦之熱；竹葉通利小便，引火下行；大黃、梔子瀉下通便；整方具有清上通下功效。

本研究結果顯示,光鏡下涼膈散各干預組肺泡結構破壞或實變、肺泡隔增厚、肺泡腔內、細動脈周圍和細支氣管壁炎癥細胞浸潤和紅細胞滲出情況均較模型組有較大程度的改善。病理學積分顯著降低。提示涼膈散對肺部炎癥有抑制作用。

本研究結果顯示，中性粒細胞凋亡指數12h涼膈散大、中劑量組高于模型組（P<0.05），24h涼膈散大劑量組高于模型組（P<0.05）。說明急性肺損傷時涼膈散能誘導PMN凋亡。既往有研究報道涼膈散抑制內毒素誘導的小鼠p38MAPK、NF-κB表達的增強[6，11]，此二者與中性粒細胞凋亡有關?？v觀目前關于中性粒細胞凋亡的信號通路，主要包括[12]：（1）抑制PMN凋亡的通路：NF-κB存活蛋白通路、ERK信號轉導通路、PI3 K-Akt通路；（2）促進PMN凋亡的通路：Fas/Fast通路，p38MAPK信號轉導通路。其中NF-κB調控多種參與早期免疫反應和炎性反應的因子，包括腫瘤壞死因子、IL-1β、IL-2、IL-6、IL-8、IL-12、誘導型一氧化氮合酶、環加氧酶2、趨化因子、黏附分子、集落刺激因子等。研究[13]發現，多種核因子κB抑制劑能促進體外培養人血中性粒細胞的自發性凋亡，且呈現出時間依賴性和劑量依賴性，而對腫瘤壞死因子誘導中性粒細胞凋亡具有協同效應。由此推論，涼膈散可能通過抑制內毒素誘導的小鼠NF-κB表達的增強，抵抗NF-κB對中性粒細胞凋亡的抑制作用，從而起到誘導中性粒細胞凋亡的作用，但其具體機制及涼膈散對中性粒細胞凋亡的其他信號通路有無影響，尚有待于進一步研究。

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（收稿：2016-11-20修回：2016-12-19）

Effect of Lianggesan on Histopathology of Lung Tissue and the Apoptosis of Polymorphonuclear Granulo－cytes in a Rat Model of Lipopolysaccharide-induced Acute Lung Injury

ZHOU Yong1,ZHAO Wei21 Department of Leader Health,Hangzhou Red Cross Hospital,Hangzhou(310003),China;2 Research Center of Respiration Physiological Functions,the First Affiliated Hospital of Zhejiang Chinese Medical University,Hangzhou (310006),China

ObjectiveTo investigate the effect of Lianggesan on the histopathology accumulated points of lung tis sue and the apoptosis of polymorphonuclear granulocytes（PMN）in blood from rats with lipopolysaccharide（LPS）in duced acute lung injury.MethodsSeventy-two healthy male SD rats were randomly divided into 6 groups（n=12）: control group,model group,prednisone group and the Lianggesan decoction high-,middle-and low-dose groups.The LPS solution（2mg/kg）was instilled into the trachea to prepare rat acute lung injury model except control group,once a day for two days.Each treatment group completed the second infusion 1 hour after LPS solution.The drugwas intragastric administration twice a day.After each group were instilled 12h,24h,6 rats were put to death to collect the required samples.The apoptosis of PMN was detected with flow cytometer.ResultsAt 12h after instilled,the pathology accumulated points in model groupwas higher than that in control group（2.08±0.12 vs 0.33±0.03,P<0.01）),that in Lianggesan decoction high-,middle-and low-dose groups were lower than that in model group（0.83±0.09,1.00±0.09, 1.17±0.08 vs 2.08±0.12,P<0.01 or P<0.05）;at 24h after instilled,the points in model group was higher than that in control group（2.25±0.11 vs 0.41±0.04,P<0.01）,that in Lianggesan decoction high-,middle-and low-dose groups were lower than that in model group（0.67±0.05,1.17±0.07,1.33±0.06 vs 2.25±0.11,P<0.01 or P<0.05）.The apoptosisof PMN at 12h after instilled in model group was lower than that in control group（51.36%±3.99%vs 71.71%±4.13%, P<0.01）,that in Lianggesan decoction high-and middle-dose groups were higher than that in model group（66.37%± 4.25%,61.6%±5.02%vs 51.36%±3.99%,P<0.05）;the apoptosis at 24h after instilled in the model groupwas lower than that in control group（63.04%±4.89%vs 80.82%±5.19%,P<0.01）,that in Lianggesan decoction high-dose groupwas higher than that in model group（71.32%±5.32%vs 63.04%±4.89%,P<0.05）.ConclusionLianggesan can induce the apoptosis of PMN,lighten the inflammatory reaction of lung tissue in acute lung injury.The underlying mechanism may be related to suppressing the expression of NF-κB.

rats;acute lung injury;Lianggesan;pathology;polymorphonuclear granulocytes;apoptosis

浙江省中醫藥科技計劃項目（No.2011ZA083）

1杭州市紅十字會醫院干部保健科（杭州310003）；2浙江中醫藥大學附屬第一醫院呼吸生理研究中心（杭州310006）

周勇，Tel：0571-56109768