高效液相色譜法測定嬰幼兒配方奶粉中葉黃素含量的探討

文/高 楊 尚東洋

（黑龍江龍丹乳業科技股份有限公司）

高效液相色譜法測定嬰幼兒配方奶粉中葉黃素含量的探討

文/高 楊1尚東洋2

（黑龍江龍丹乳業科技股份有限公司）

提出并建立了一種快速測定嬰幼兒配方奶粉中葉黃素含量的高效液相色譜法。樣品處理后，經C18（5 μm，250 mm×4.6 mm）色譜柱分離，甲醇作為流動相，高效液相-紫外檢測器檢測，外標法進行定量。試驗結果表明，C18色譜柱檢測葉黃素保留時間穩定，分離效果良好，且峰型良好，能夠滿足檢測要求。該方法具有操作簡單、快速準確、節省試劑、污染少等特點，具有較好的實用性。

葉黃素；高效液相色譜法；嬰幼兒配方奶粉

葉黃素系統名稱為3，3，-α，β-二羥基-胡蘿卜素，分子式為C40H56O2，相對分子質量為568.88（按2007年國際相對原子質量）。屬于類胡蘿卜素類色素，又名“植物黃體素”，是一種天然色素。葉黃素廣泛存在于自然界的植物體中，其中萬壽菊中含量最多。

葉黃素具有多種生物活性，富有營養而無副作用，因此用途非常廣泛，可應用于食品、化妝品、醫藥、煙草和禽類飼料等領域。大量醫學證據表明，葉黃素對視覺有保護作用，能夠預防白內障、動脈硬化，并且有抗氧化、增強免疫力等功效，特別在預防癌變發生、延緩癌癥發展等方面發揮了重要作用，是目前國際上功能性食品成分研究中的熱點之一，具有廣闊的開發前景。

鑒于葉黃素獨特的生理功能，近年來，越來越多的乳品企業開展了將葉黃素添加到嬰幼兒配方奶粉中的相關研究工作，并取得了一定的成效。隨著添加葉黃素的嬰幼兒配方奶粉陸續上市，準確、快速檢測產品中葉黃素的含量對嬰幼兒配方奶粉的質量控制具有重要意義。

目前，關于葉黃素含量的檢測方法主要有紙層析法、薄層層析法、柱層析法、分光光度法、高效液相色譜法、液質聯用法等。其中，高效液相色譜法普及率高、分析速度快、準確性高，是目前應用最為廣泛，同時也是葉黃素含量測定最適用的檢測方法之一。

2016年8月31日，國家衛生和計劃生育委員會發布了GB 5009.248-2016《食品安全國家標準 食品中葉黃素的測定》，該標準代替了GB/T 23209-2008《奶粉中葉黃素的測定 液相色譜-紫外檢測法》。新發布的國標和舊國標相比，增加了對葉黃素標準溶液濃度的校正要求、操作過程注意點，更改了提取溶劑等，方法更加嚴謹，提高了回收率，測定結果準確穩定，可以很好地控制產品質量。但該方法操作步驟較為繁瑣費時。筆者采用高效液相色譜-紫外檢測器，以甲醇作為流動相，采用最普遍使用的C18色譜柱進行分離，操作簡單、快速準確、節省試劑、減少污染、實用性強，可適用于嬰幼兒配方奶粉中葉黃素含量的快速測定。

1 儀器設備與試驗方法

1.1 儀器、試劑與材料

1.1.1 主要儀器設備

高效液相色譜儀（日本島津，型號為LC-20AT，配有紫外檢測器）；渦旋振蕩器（海門市其林貝爾儀器制造有限公司，型號為XW-80A）；分析天平（美國奧豪斯，型號為CAV214C，感量0.1 mg）；數控超聲波清洗器（昆明市超聲儀器有限公司，型號為KQ-700DE）；紫外可見分光光度計（日本島津，型號為UV2550）；氮吹濃縮裝置（天津奧特賽恩斯儀器有限公司，型號為WTN-2800D）；超純水儀（沃特爾，型號為WP-UPLH-20）；冷凍速離心機（鹽城市凱特實驗儀器有限公司，型號為TGL16M）；深冷冰柜（海爾醫療，型號為DW86L338）；移液器（DRAGON，1～5 mL）。

1.1.2 試劑材料

葉黃素標準品，Sigma，純度≥98.0%；正己烷，色譜純；無水乙醇，色譜純；甲醇，色譜純；二氯甲烷，色譜純；0.45 μm濾膜，有機系；試驗用水為實驗室自己制備。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品制備

準確稱取2.00 g（精確至0.01 g）均勻試樣于50 mL聚丙烯離心管中，加入20 mL約50 ℃的溫水，超聲20 min，使樣品充分溶解。

用移液管準確移取處理好的均勻樣液1 mL于10 mL螺口試管中，加入1 mL無水乙醇，渦旋振蕩1 min混勻，再加入3 mL正己烷，避光渦旋振蕩提取3 min，4 500 r/min離心3 min，重復提取2 次，合并提取液，以10 mL水洗滌，4 500 r/min離心3 min分層，重復洗滌1 次，合并有機相，于室溫氮氣吹干，以甲醇渦旋振蕩溶解殘渣并定容至2 mL。冷凍30 min，4 500 r/min離心3 min，取上清液過0.45 μm濾膜，供液相色譜測定。

1.2.2 液相條件

色譜柱：C18（5 μm，250 mm×4.6 mm）；

流動相：甲醇；

流速：1.0 mL/min；

檢測波長：445 nm；

進樣體積：10 μL；

柱溫：30 ℃。

2 試驗結果與注意事項

2.1 標準曲線

2.1.1 標準溶液配制

標準儲備溶液（200 mg/L）：稱取標樣0.001 g，用二氯甲烷溶解并定容至5 mL容量瓶，在-80 ℃冰箱中避光保存。

標準中間溶液（8 mg/L）：吸取1 mL儲備液，用甲醇定容至25 mL容量瓶中，在-80 ℃冰箱中避光保存。

標準工作溶液：根據靈敏度和使用需要，用甲醇稀釋成標準工作溶液，濃度為0.10、0.20、0.30、0.40、0.50 mg/L。此標準工作溶液需于分析前臨時配制。

2.1.2 標準曲線及相關系數

用葉黃素標準工作溶液分別進樣，以標準工作溶液濃度為橫坐標，以峰面積為縱坐標，繪制標準曲線，用標準工作曲線對樣品進行定量。在0.10～0.50 mg/L范圍內，葉黃素線性范圍良好，線性回歸方程為Y=29330X+2993.6，相關系數為0.9989。測試溶液中被測組分濃度在標準曲線的線性范圍內。

2.2 加標回收率和相對標準偏差

在不含葉黃素的空白樣品中，分別添加3 個不同梯度的葉黃素標準工作液，每個梯度做6 個平行樣，按照1.2的樣品處理方法進行處理。結果見表1：加標量為0.10～0.50 μg，其回收率為86.4%～95.3%，相對標準偏差為1.20%～3.83%。

2.3 注意事項

2.3.1 由于葉黃素穩定性差，對光敏感，所有試驗操作應在500 nm以下紫外光的黃色光源或紅色光源環境中進行。

2.3.2 標準溶液配制后需要用紫外可見分光光度計校準，得到準確濃度。

圖1 葉黃素標準曲線

表1 平均回收率和相對標準偏差（n=6）

3 結論

本文以GB 5009.248-2016《食品安全國家標準 食品中葉黃素的測定》為基礎，對方法進行了改進，方法改進后具有操作簡單、快速準確、節省試劑、污染少等特點，具有較好的實用性。C

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高楊（1987-），女，助理工程師，從事乳品質量管理工作。

2017-04-19）