江蘇省禽源空腸彎曲桿菌的分離鑒定及耐藥性研究

周 倩，唐夢君，張小燕，張 靜，唐修君，顧 榮，劉茵茵，高玉時

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江蘇省禽源空腸彎曲桿菌的分離鑒定及耐藥性研究

周 倩，唐夢君，張小燕，張 靜，唐修君，顧 榮，劉茵茵，高玉時

目的 了解江蘇省禽源空腸彎曲桿菌的流行情況及耐藥特征。方法 從江蘇徐州、淮安和揚州等7市采集禽肉產品和泄殖腔棉拭子樣品共753份，分離細菌，PCR方法鑒定空腸彎曲桿菌后，根據WHO推薦的K-B法測定9大類27種抗生素的敏感性。結果 753份樣品共分離出空腸彎曲桿菌207株，分離率為27.5%。藥敏結果顯示，所有菌株除了對美羅培南、慶大霉素、卡那霉素、氟苯尼考和磷霉素保持高度敏感性，對其它抗生素產生不同程度耐藥，對磺胺類、喹諾酮類、β-內酰胺類和四環素類抗生素耐藥率最高，其中對甲氧芐氨嘧啶、諾氟沙星、頭孢曲松和四環素耐藥率分別高達100%、84.02%、80.9%和79.4%，一株分離自徐州的菌株對92.6%的抗生素產生耐受性。測試菌株出現多重耐藥現象，優勢耐藥譜為LIN/CTX/CRO/NOR/CIP/T/TE，菌株耐藥類型在40%～60%數量最多，各市菌株耐藥類型不一。結論 江蘇省禽源空腸彎曲桿菌耐藥性比較普遍，多重耐藥菌株較突出，應嚴格監管養殖場抗生素的使用及流通階段食品源空腸彎曲桿菌的監測。

江蘇省；空腸彎曲桿菌；分離鑒定；抗生素耐藥性

食源性疾病作為一個日益嚴峻的公共衛生問題，正威脅著消費者的健康和利益，且與食品污染問題廣泛存在于發展中國家甚至發達國家[1]。空腸彎曲桿菌(Campylobacterjejuni，C.jejuni)被認為是引起人類腹瀉常見病原菌，世界流行疾病研究指出空腸彎曲桿菌主要由食品傳染，禽肉產品是主要的傳染源。由于空腸彎曲桿菌能夠在家禽腸道內大量定植，在屠宰的過程中如果腸道破裂很容易污染屠宰場地、設施和水從而污染禽肉產品[2-3]。據2010年歐盟食品和飼料快速預警系統(RASSF)通報的數據[4]，引起禽肉食品安全的微生物因素中彎曲桿菌僅次于沙門氏菌和李斯特桿菌，該菌能夠通過環境或食物鏈進入動物和人體從而引起各種空腸彎曲病，能夠引起家禽腹瀉、肝炎及奶牛流產不孕等[5]，人感染后其臨床癥狀從水樣腹瀉到血便，同時伴有頭痛、腹痛、發熱、偶有嘔吐[6-7]。近些年來，大量的抗生素被濫用到集約化養殖生產中，導致了動物彎曲桿菌耐藥問題日益嚴重。目前，江蘇省畜禽養殖業發展迅速，其中以蘇北地區的養殖戶和養殖小區為主[]，因此本試驗對江蘇省采集的樣品進行空腸彎曲桿菌分離純化并進行抗生素敏感性分析，了解空腸彎曲菌的污染狀況及耐藥情況，為有效控制空腸彎曲菌污染及抗生素耐藥提供科學依據和技術支撐，在提高食品安全風險管理等方面具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品采集及處理 2016年6月至2016年11月，分離江蘇省徐州、鹽城和揚州等市及其區縣的超市和農貿市場的禽肉產品，養殖場和農貿市場泄殖腔棉拭子。禽肉樣品采用滅菌PBS棉球擦拭，泄殖腔棉拭子保存至半固體運輸培養基(Cary-Blair)中，共753份。所有樣品低溫運送至實驗室，樣品采用PBS適當稀釋后涂板。

1.1.2 試劑及培養基 Cary-Blair半固體培養基、含6種抗生素(頭孢哌酮、多粘菌素B、兩性霉素B、利福平、三甲氧氨芐嘧啶、放線菌酮)的選擇性CCDA培養基、MH平板、BHI培養基、27種藥敏紙片均購買于英國OXOID公司；脫纖維綿羊血購買于青島海博生物技術有限公司；引物由上海生工生物技術公司合成；rTaq酶、DNA Marker購買于寶生物工程(大連)有限公司；厭氧罐購自日本MGC公司；混合氣(5%O2、10%CO2和85%N2)購于南京特種氣體廠有限公司；細菌基因組DNA提取試劑盒購買于北京天根生物科技有限公司；其它為微生物試驗常規試劑。

1.2 方法

1.2.1 細菌分離純化 取100 μL PBS稀釋液到含有6種抗生素的改良CCDA選擇性平板上，無菌L棒涂勻后倒置于厭氧罐，充入混合氣，42 ℃微需氧培養36 h后挑取可疑菌落(扁平、有金屬光澤、像水滴樣菌落)接種于MH血平板42 ℃微需氧培養36 h，重復2-3次，直至得到單一純培養菌落。

1.2.2 模板DNA提取 將MH血平板純化培養的細菌用無菌棉簽刮下洗入PBS緩沖溶液，離心后去除上層液體，采用試劑盒提取基因組DNA。

1.2.3 PCR鑒定 采用二重PCR方法鑒定空腸彎曲桿菌，引物序列見表1。25 μL PCR反應體系：rTaq premix 12.5 μL，上下游引物兩對(10 μM/L)各1 μL，無菌去離子水9.5 μL，模板DNA 1 μL。PCR循環參數：95 ℃預變性1 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35個循環；再72 ℃延伸10 min。PCR產物用1%瓊脂糖凝膠電泳成像。

表1 靶基因引物序列及片段長度
Tab.1 Primer sequence and gene length

靶基因Gene引物序列(5'-3')Primersequence片段大小(bp)Genelength參考文獻Reference16srRNAF:ATCTAATGGCTTAACCATTAAAC857[9]R:GGACGGTAACTAGTTTAGTATTmapAF:CTATTTTATTTTTGAGTGCTTGTG589R:GCTTTATTTGCCATTTGTTTTATTA

1.2.4 菌種保存 經PCR鑒定為空腸彎曲桿菌菌株收集于含有20%甘油的BHI培養基中，標記記錄，置于-80 ℃冷凍保存。

1.2.5 藥物敏感性檢測

1.2.5.1 抗菌藥物的選擇 根據養殖場用藥情況和對公共衛生的影響，選擇9類27種抗生素，按照美國臨床實驗室標準化協會(CLSI)的標準[10]，27種藥敏紙片名稱、含量及判斷標準見表2。菌液稀釋到0.5麥氏濃度后根據藥敏紙片說明書進行測試，42 ℃微需氧培養36～48 h后用直尺測定抑菌圈直徑(mm)。數據采用Excel2015整理分析。

表2 抗生素名稱及判定標準
Tab.2 Antibiotic drugs and criterion of sensitivity tests

類別Category抗生素名稱Antibioticdrug劑量(μg/片)Scrapsofpapercontainingthedrug/μg判定標準(mm)criterion耐藥(R)Resistant中介(I)Intermediate高敏(S)Susceptibleβ-內酰胺類氨芐西林(AMP)10≤1314-16≥17β-lactam阿莫西林(AML)10≤1314-17≥18頭孢噻肟(CTX)30≤2223-25≥26頭孢拉定(VI)30≤1415-17≥18頭孢曲松(CRO)30≤1920-22≥23亞胺培南(IPM)10≤1920-22≥23美羅培南(MEM)10≤1920-22≥23氨基糖苷類鏈霉素(S)10≤1112-14≥15Aminoglycoside慶大霉素(CN)10≤1213-14≥15卡那霉素(K)30≤1314-17≥18阿米卡星(AK)30≤1415-16≥17妥布霉素(TOB)10≤1213-14≥15喹諾酮類諾氟沙星(NOR)10≤1213-16≥17quinolone環丙沙星(CIP)5≤1516-20≥21氧氟沙星(LEV)5≤1314-16≥17萘啶酸(NA)30≤1314-18≥19恩諾沙星(ENR)5≤1213-15≥16磺胺類復方新諾明(SXT)25≤1011-15≥16sulfonamide甲氧芐氨嘧啶(T)5≤1011-15≥16大環內酯類紅霉素(E)15≤1314-22≥23marcrolides阿奇霉素(AZM)15≤1213-21≥22四環素類tetracylines四環素(TE)30≤1112-14≥15潔霉素類克林霉素(DA)2≤1819-25≥26Lincomycin林可霉素(LIN)2≤1213-15≥16氯霉素類氯霉素(C)30≤1213-17≥18Chloramphenicol氟苯尼考(FF)30≤1718-20≥21多磷類phosphorus磷霉素(FOS)10≤1213-15≥16

1.2.5.2 質控菌株 ATCC25922大腸桿菌(Escherichiacoli)為揚州大學獸醫學院惠贈。

2 結 果

2.1 空腸彎曲菌分離鑒定結果 在改良的CCDA平板上，空腸彎曲桿菌呈圓形、金屬光澤菌落或扁平半透明不整齊邊緣菌落生長。PCR擴增后能成功擴增出兩條目的條帶，857 bp為屬特異性條帶，589 bp為種特異性條帶，圖1為部分菌株鑒定結果。

圖1 部分菌株PCR鑒定結果(M: DL2000 Marker，1-18為樣品編號)Fig.1 Agarose gel electrophoresis of PCR amplification

2.2 江蘇省不同地區禽源空腸彎曲桿菌流行情況 從表3可以明顯看出，753份樣品中，共分離到207株空腸彎曲桿菌，平均分離率為27.5%，其中38份來自禽肉產品，169份來自泄殖腔棉拭樣，分離率分別為24.5%和28.7%。7個城市樣品分離率分別為20%(徐州)、30.9%(淮安)、25%(揚州)、23.2%(鹽城)、41.9%(宿遷)、14.3%(南通)和28%(常州)，宿遷空腸彎曲桿菌污染明顯，南通污染程度最低。

2.3 藥敏結果分析

2.3.1 抗生素敏感性檢測結果 207株空腸彎曲桿菌中有194株復蘇成功，對27種抗生素產生不同的敏感性，見表4。從總敏感率(敏感菌株占菌株總數的百分比)來看，對美羅培南、慶大霉素、阿米卡星、氟苯尼考和磷霉素仍具有高度敏感性，且各市敏感程度具有一致性；對于抗生素卡那霉素、紅霉素、阿奇霉素和氯霉素各市敏感程度不一；所有菌株對抗生素甲氧芐氨嘧啶敏感性極低。反之，從表4可以看出，多數菌株對抗生素已經產生明顯耐藥性，且具有多重耐藥。

表3 不同地區的空腸彎曲桿菌分離情況
Tab.3 Distribution ofC.jujeniisolated from different places and sources

地點Location類別(陽性/樣本數)Classes(positive/sample)禽肉產品Poultrymeat泄殖腔棉拭子CloacalswabsTotal徐州0%(0/10)23.1%(15/65)20.0%(15/75)淮安23.6%(13/55)33.3%(55/165)30.9%(68/220)揚州26%(13/50)24.4%(20/82)25.0%(33/132)鹽城26.7%(4/15)22.9%(32/140)23.2%(36/155)宿遷35.0%(7/20)43.9%(29/66)41.9%(36/86)南通20.0%(1/5)13.3%(4/30)14.3%(5/35)常州0%(0/0)28.0%(14/50)28.0%(14/50)合計24.5%(38/155)28.3%(169/598)27.5%(207/753)

表4 27種抗生素敏感性檢測結果
Tab.4 Result of sensitivity test

抗菌藥物Antibioticdrug各市菌株敏感率(%)SusceptibilityratesXZn=15HAn=61YZn=33YCn=31SQn=36NTn=5CZn=13總敏感率(%)sensitiveraten=194AMP25.021.023.528.12.820.07.718.3AML37.525.844.143.813.920.07.727.5CTX18.814.58.89.42.8007.8VI56.39.735.212.58.30017.4CRO12.511.38.815.60006.9IPM50.061.394.184.438.980.0100.072.7MEM93.885.597.190.694.4100.0100.094.5S47.867.779.462.580.680.092.372.9CN75.067.779.481.272.2100.092.381.1K31.338.776.565.650.0100.084.663.8AK75.075.891.287.569.4100.0100.085.6TOB25.041.982.471.922.280.092.359.4NOR37.59.6015.65.6009.8CIP25.08.15.812.511.1008.9LEV25.022.68.815.713.920.0015.1NA18.816.120.637.52.8030.818.1ENR25.029.011.837.530.640.0024.8SXT37.533.923.543.841.740.0031.5T01.6002.8000.6E56.362.979.471.966.7100.092.375.6AZM37.575.882.471.958.3100.092.374.0TE18.814.55.925.016.720.0014.4DA12.524.232.453.122.240.015.428.5LIN012.98.89.422.220.0010.5C56.362.985.378.175100.092.378.6FF68.870.991.281.383.380.0100.082.2FOS93.896.894.193.891.710092.394.6

注：n代表菌株總數

Note: n means the number of strains.

2.3.2 分離菌株對27種抗生素的耐藥譜分析 194株菌對27種抗生素呈現出不同的耐藥性。值得注意的是，分離菌株耐藥率在40%～60%數量最多(圖2)。9類受試藥物中，空腸彎曲桿菌對β-內酰胺類、喹諾酮類、磺胺類和四環素類抗生素的耐藥率最高。其中對頭孢曲松、諾氟沙星、甲氧芐氨嘧啶和四環素耐藥率分別為80.9%、84.02%、100%和79.4%，一株分離自徐州的菌株對92.6%的抗生素產生耐受性。

圖2 分離菌株耐藥類型Fig.2 Types of resistant isolates

194株空腸彎曲桿菌對27種抗生素共產生21種耐藥譜，且有相同耐藥譜出現。所有菌株至少耐4種抗生素，100%菌株為多重耐藥菌株(耐3種抗生素以上)，藥敏結果顯示優勢耐藥譜為LIN/CTX/CRO/NOR/CIP/T/TE，分離菌株表現出耐藥譜型多樣性。

統計耐藥類型最高(40%～60%)的菌株(共125株)的分離地域，見表5，常州多達92.9%，揚州最低，為42%。由此可見，各市菌株耐藥類型不盡相同，淮安和揚州為一類，徐州、宿遷、南通、常州和鹽城為一類。

表5 耐藥率40%～60%分離地域分析
Tab.5 Analysis of isolation in 40%-60% resistance

地點Location菌株數/受試菌株總數Strains/Testingstrains徐州73%(11/15)淮安59%(36/61)揚州42%(14/33)鹽城71%(22/31)宿遷69%(25/36)南通80%(4/5)常州100%(13/13)合計64%(125/194)

3 討 論

從江蘇地區采集的753份樣品中分離到207株空腸彎曲桿菌，分離率為27.5%，來源于養殖場的泄殖腔棉拭子陽性率略高于禽肉產品。該結果與我國一些地區有的近似，有的有較大差距。說明空腸彎曲桿菌的污染地域特征明顯，受環境因素影響[11]。

成功復蘇的194株空腸彎曲桿菌對9類27種抗生素耐藥程度不一。其中對甲氧芐氨嘧啶、諾氟沙星、頭孢曲松和四環素耐藥率分別高達100%、84.02%、80.9%和79.4%，但耐藥菌株對美羅培南、慶大霉素、卡那霉素、氟苯尼考和磷霉素敏感性較高，出現多重耐藥現象。總體來說，菌株表現出對β-內酰胺類、喹諾酮類和磺胺類抗生素高度耐藥，這與國內許多研究人員報道一致，反映出國內養殖和臨床用藥過程中抗生素使用情況，尤其是喹諾酮類抗生素作為治療動物空腸彎曲桿菌病的首選藥物，耐藥趨勢更為顯著[12-14]。

在動物的養殖過程中，可根據藥敏顯示結果，科學地采用輪換用藥等方式，有針對性地使用抗菌藥物，避免抗生素濫用。同時提高養殖人員對細菌耐藥性的專業意識，加強從農場到餐桌空腸彎曲桿菌監測。

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Isolation, identification and antimicrobial resistance ofCampylobacterjejuniisolates from poultry in Jiangsu Province

ZHOU Qian, TANG Meng-jun, ZHANG Xiao-yan, ZHANG Jing, TANG Xiu-jun,GU Rong, LIU Yin-yin, GAO Yu-shi

(PoultryInstitute,ChineseAcademyofAgriculturalScience,Yangzhou225125,China)

The aim of the research is to study the prevalence and antimicrobial resistance ofCampylabocterjejuniisolated from poultry in Jiangsu Province. A total of 753 samples from poultry meat and cloacal swabs were investigated, after the pure culture and the polymerase chain reaction of themapAgene, 207 isolates were examined for antimicrobial resistance by using K-B method according to World Health Organization. Results showed that all isolates performed different degree of antimicrobial resistance except meropenem, gentamycin, kanamycin, florfenicol and fosfomycin, the resistance rates of 194 strains to trimethoprim, norfloxacin, ceftriaxone and tetracycline were 100%, 84.02%, 80.9% and 79.4% respectively, 1 strain isolated from Xuzhou was resistant to 92.6% antibiotics. The multi-drug resistance appeared and the advantage of drug-resistant spectrum was LIN/CTX/CRO/NOR/CIP/T/TE, the resistant type focused on 40%-60%. The research provided evidence for surveillance of the antimicrobial resistance ofC.jejuniand highlighted the need to employ more prudent use of critically important antimicrobial.

Jiangsu Province;Campylobacterjejuni; isolation and identification; antimicrobial resistance

Gao Yu-shi,Email: gaoys100@sina.com

10.3969/j.issn.1002-2694.2017.06.005

十三五國家重點研發計劃高危金屬中毒病防控技術研究(2016YFD0501208)、揚州市社會發展(YZ2016058)、2017國家農產品質量安全風險評估重大專項(GJFP2017007)、揚州市家禽質量安全科技服務平臺建設項目(yz2015162)聯合資助

高玉時，Email:gaoys100@sina.com

中國農業科學院家禽研究所，揚州 225125

R378

A

1002-2694(2017)06-0495-06

2016-12-29 編輯:李友松

Supported by the National Key Research and Development Program of China(No.2016YFD0501208), the Social Development Project of Yangzhou(YZ2016058)，the National Major Project for Agro-product Quality & Safety Risk Assessment (No.GJFP2017007), the Yangzhou Technology Service Platform Construction of the Quality and Safety of Poultry Science (No.yz2015162)