北京規模化豬場病毒性腹瀉隱性感染情況調查

劉 鄧 賈澤穎 張 丹 全炎銘 郭又春 劉莉如 劉修全 陳華林

（北京三元集團畜牧獸醫總站，北京 100192）

北京規模化豬場病毒性腹瀉隱性感染情況調查

劉 鄧 賈澤穎 張 丹 全炎銘 郭又春 劉莉如 劉修全 陳華林*

（北京三元集團畜牧獸醫總站，北京 100192）

為了解PEDV、TGEV和RV在豬群中的隱性感染情況，對北京市8個規模化養豬場開展流行病學調查。本次調查共采集到440份臨床健康糞樣，利用多重FQ-RT-PCR的方法進行檢測，結果表明：PEDV、RV、TGEV的陽性率分明為14.1%、13.6%和3.2%；不同階段的豬群中，PEDV在保育-育肥階段陽性率最高，達到25.4%；RV在仔豬階段陽性率最高，達到27.3%；TGEV在保育-育肥階段陽性率為8.5%。由此可知，規模化豬場PEDV、TGEV和RV隱性感染情況較為嚴重。

豬病毒性腹瀉；FQ-RT-PCR；隱性感染

豬傳染性胃腸炎病毒（Porcine transmissible gastroenteritis virus,TGEV）、豬輪狀病毒（Porcine rotavirus,RV）和豬流行性腹瀉病毒（Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV）是引起規模化豬場豬群腹瀉的主要病原，一年四季均能發生，對仔豬的危害較為嚴重[1-2]。近幾年時有暴發，且波及面較廣，并呈現高發病率高死亡率的趨勢，給我國養豬業帶來了極為嚴重的損失[3-5]。據調查部分規模化豬場在時間上呈現為波浪式暴發，為了解該情況出現的潛在因素，本研究采集北京市郊的8個規模化養豬場的440份臨床健康豬糞，進行PEDV、TGEV和RV病原學方面的檢測，從而為豬病毒性腹瀉的防控提供依據。

1 試驗材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 主要試劑

一步法熒光定量RT-PCR試劑盒，購自大連寶生物工程有限公司（TaKaRa）；RNA提取試劑盒購自QIAGEN公司。

1.1.2 主要儀器設備

ABI 7500熒光定量PCR儀購自于Thermo Fisher公司；高速冷凍離心機購自德國賀利氏儀器公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品來源

采集自北京周邊某養殖公司下轄8個種豬場共440份臨床健康豬新鮮糞樣，其中：母豬（Ⅰ組）159頭份、保育-育肥豬（Ⅱ組）142頭份、仔豬（Ⅲ組）139頭份。

1.2.2 樣品前處理

從糞樣采集管中取出一定量的糞樣轉移進1.5 mL離心管中，分別加入500 μL無菌生理鹽水，渦旋振蕩器上混勻，以8 000 r/min轉速離心15 min，吸取上清轉移至新的離心管中待檢。

1.2.3 RNA提取

按照QIAGEN公司的RNA提取試劑盒說明書提取總RNA。往1.5 mL離心管中加入560 μL AVL裂解液，隨后加入150 μL樣品渦旋混合15 s靜置10 min，瞬時離心后加入560 μL無水乙醇渦旋混合，轉移至收集管中，8 000 r/min離心1 min，棄掉廢液后收集管中加入500 μL AW1液體，8 000 r/min離心1 min，棄掉廢液后，收集管中加入500 μL AW2液體，14 000 r/min離心3 min，棄掉廢液后，14 000 r/min空離2 min，加入60 μL AVE，靜置1 min后，8 000 r/min離心1 min，做好標記，-80℃凍存待用。

1.2.4 多重FQ-RT-PCR檢測

采用本實驗室建立的多重FQ-RT-PCR方法進行檢測，該檢測方法能夠同時檢測PEDV、TGEV和RV三種病原，并設立陰陽性對照，當熒光定量PCR儀能夠收集到明顯的擴增信號時則判定為陽性（CT值＜35）；熒光信號增強不明顯（40＞CT值≥35）判定為可疑，需要復檢，復檢后如果40＞CT值≥35則判定為陽性；無熒光信號增強則判為陰性，其具體的反應體系以及反應條件如下：2×One Step RT-PCR Buffer III 25μL，TaKaRa Ex Taq TM HS（5 U/μL）1.5 μL，PrimeScript RT enzyme Mix II 1.0 μL，（PEDV/TGEV/RV）PCR Forward Primer（10 μM），（PEDV/TGEV/RV）PCR Reverse Primer （10 μM），（PEDV/TGEV/RV）Probe（10 μM），total RNA 10 μL，合計50μL。反應條件：（反轉錄）42℃30min；（預變性）95℃30 s；95℃15 s；56℃30 s（退火延伸收集熒光信號），40個循環。

2 試驗結果

2.1 PEDV、TGEV、RV總體隱性感染狀況

采用多重FQ-RT-PCR方法對8個種豬場440份臨床健康豬糞進行檢測，可疑樣品進行復測，總體檢測結果如表1所示。2個種豬場PEDV、TGEV、RV陽性率均為0；其余6個豬場以隱性感染PEDV和RV為主，PEDV陽性率最高達到43.3%，RV陽性率最高達到31.7%，整體上PEDV陽性率為14.1%、RV為13.6%，而TGEV陽性率只有3.2%。

2.2 不同階段豬群隱性感染情況

由表2知，不同日齡階段的豬群PEDV和RV均有隱性感染，TGEV在仔豬群沒有檢測到。PEDV隱性感染在保育-育肥階段陽性率最高達到25.4%；RV隱性感染在仔豬階段陽性率最高達到27.3%；TGEV隱性感染在各階段豬群均不高，保育-育肥階段陽性率最高，為8.5%，仔豬階段感染率為0。

表1 8個種豬場3種病原隱性感染情況

表2 不同日齡豬群隱性感染情況

2.3 混合感染情況

本次抽樣調查的440份臨床健康糞樣中，PEDV和RV混合感染8份，混合感染率為1.8%；PEDV、RV和TGEV混合感染9份，混合感染率為2.0%。

3 結論

根據本次試驗開展的北京規模化豬場病毒性腹瀉隱性感染情況調查可知，PEDV、TGEV和RV這三種較為常見的豬群腹瀉致病原中，隱性感染以PEDV為主（14.4%），其次為RV（13.6%），TGEV隱性感染率最低（3.2%），調查結果同近些年來國內報道豬病毒性腹瀉發病感染情況基本一致。杜鵑等[6]采用多重RT-PCR方法，于2012—2013年間對北京部分區縣1 201份樣品進行監測，結果顯示：PEDV陽性率4.66%，TGEV陽性率2.58%，RV陽性率6.16%。薛瑞雪等[7]采用RT-PCR方法對2013年10月至2014年10月采集的226份腹瀉樣品進行檢測，結果顯示：226份病料樣品中PEDV、TGEV和RV的陽性率分別為34.96%、2.21%和28.76%，PEDV與RV的混合感染率為3.10%，表明PEDV和RV為山東仔豬腹瀉的主要病原，并存在多種病原混合感染情況。而本研究針對的主要是臨床健康豬群的流行病學調查，因此數據上看略高于其他文獻報道，根據豬場實際生產情況分析，極有可能與部分豬場在調查前3—4個月有病毒性腹瀉暴發有關，因此在豬群發生病毒性腹瀉后，隱性感染情況會持續較長的一段時間。

本次調查中，不同階段的豬群其隱性感染情況也有較為明顯的區別，其中PEDV和RV在仔豬以及保育-育肥階段的隱性感染率較高，而TGEV在仔豬階段的隱性感染率為0，其他階段也有隱性感染，但較低，同國內這方面的調查也基本相似。劉云波等[8]于2011—2012年間采用多重RT-PCR方法對13個省市的豬腹瀉以及臨床健康樣品進行了檢測，結果顯示：臨床健康樣品中，保育-育肥豬PEDV、RV陽性率分別為2.13%和1.42%，仔豬RV陽性率達到12.86%，表明PEDV和RV存在有隱形感染情況。

本研究表明，規模化豬場中PEDV、TGEV和RV的隱性感染情況較為突出，而且有研究表明目前病毒性腹瀉的暴發季節性越來越不明顯，田云等[9]在2012年通過對廣東省豬群流行性腹瀉的流行病學調查發現免疫率高、生物安全措施好的豬場發病率和死亡率均較低，因此病毒性腹瀉的防控應以預防為主。

[1]李瑞香,王翠萍.豬病毒性腹瀉病的流行特點及防控措施[J].畜牧與飼料科學,2016,37(2):111-112.

[2]Chae C,Kim O,Choi C,et al.Prevalence of porcine epidemic diarrhea virus and transmissible gastroenteritis virus infection in Korean pigs[J].Vet Rec,2000,147(21):606-608.

[3]Ben Salem AN,Chupin Sergei A,Bjadovskaya Olga P,et al.Multiplex nested RT-PCR for the detection of porcine enteric viruses[J].J Virol Methods,2010,165(2):283-293.

[4]秦谷雨,楊勇,李郁,等.安徽省仔豬腹瀉5種病毒感染情況的調查研究[J]．動物醫學進展,2012,33(12):59-63.

[5]黃毓茂.當前豬病毒性腹瀉流行特點與防控建議[J]．中國豬業,2012(11):21-22.

[6]杜鵑,韋海濤,周德剛,等.北京地區豬主要病毒性腹瀉疾病的流行病學調查[J].中國獸醫雜志,2015,51(3):24-26.

[7]薛瑞雪,田野,田夫林,等.山東省部分地區仔豬病毒性腹瀉流行病學調查[J].中國預防獸醫學報,2015,37(4):254-257.

[8]劉云波,趙洪翠,王志成,等.豬病毒性腹瀉分子流行病學調查[J].中國畜牧獸醫,2013,40(2):204-207.

[9]田云,孫彥偉,王福廣,等.2012年廣東豬群腹瀉流行病學調查[J].廣東畜牧獸醫科技,2015,40(3):19-22.

S852.65

A

1673-4645(2017)04-0032-03

2017-01-18

劉鄧（1981-），男，碩士，獸醫師，主要從事畜禽疫病診斷，E-mail：9465245@qq.com*

陳華林（1966-），男，高級獸醫師，主要從事畜禽疫病防控