MMP-2和TIMP-2在激光誘導形覺剝奪的高度近視豚鼠脈絡膜新生血管中的表達變化

劉 林 丁雯芝 張 昀 馬曉昀 鄒 俊△

(1上海市第十人民醫院眼科 上海 200072; 2上海市光華中西醫結合醫院眼科 上海 200052)

MMP-2和TIMP-2在激光誘導形覺剝奪的高度近視豚鼠脈絡膜新生血管中的表達變化

劉 林1丁雯芝1張 昀2馬曉昀2鄒 俊1△

(1上海市第十人民醫院眼科 上海 200072;2上海市光華中西醫結合醫院眼科 上海 200052)

目的 構建高度近視豚鼠脈絡膜血管新生(choroidal neovascularization,CNV)模型,探討基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase-2,MMP-2)和基質金屬蛋白酶抑制劑(tissue inhibitor-2 of metalloproteinase,TIMP-2)在高度近視CNV形成中的作用。方法 72只2周齡三色豚鼠隨機分為實驗組(n=36)和對照組(n=36),實驗組右眼行6周形覺剝奪誘導高度近視。兩組各選取30只豚鼠右眼行532 nm激光光凝視網膜誘導CNV。于激光前和光凝后7、14、21、28、35天進行免疫組化觀察光凝區域MMP-2和TIMP-2的表達,real-time PCR檢測視網膜色素上皮層(retinal pigment epithelium,RPE)-脈絡膜-鞏膜復合物中的MMP-2和TIMP-2 mRNA表達對MMP-2和TIMP-2免疫組化陽性表達的積分光密度值(integral optical desnsity,IDO)及mRNA相對表達水平進行統計學分析。結果 激光光凝后實驗組和對照組MMP-2和TIMP-2表達均明顯上調,MMP-2于光凝后21天、TIMP-2于光凝后28天時表達高峰。激光前及光凝后各觀察時間點,實驗組MMP-2陽性表達和mRNA相對表達量均明顯高于對照組,差異有統計學意義(P<0.05);而激光前實驗組TIMP-2表達較對照組明顯減少(P<0.05),光凝后各時間點兩組TIMP-2表達差異無統計學意義。結論 MMP-2和TIMP-2與高度近視CNV形成密切相關,MMP-2與TIMP-2表達平衡紊亂可能參與高度近視CNV的發生發展。

高度近視; 脈絡膜新生血管; 豚鼠; 激光; MMP-2; TIMP-2

病理性近視(pathologic myopia,PM)又稱進行性高度近視,以眼軸過度延長伴鞏膜、脈絡膜、Bruch膜、視網膜色素上皮層(pigment epithelium layer retina,RPE)和神經視網膜特征性的退行性改變為主要特征。脈絡膜新生血管(choroidal neovascularization,CNV)是PM引起中心視力嚴重損害的常見原因[1],CNV病理過程極其復雜,包括多種細胞因子、蛋白水解酶、變性改變、Bruch膜-RPE-脈絡膜內皮細胞損傷等參與。 Bruch膜的損傷及細胞外基質(extracellular matrix,ECM)的降解在CNV形成過程中至關重要[2]。ECM的降解平衡主要由基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP)和基質金屬蛋白酶抑制劑(tissue inhibitor of metalloproteinase,TIMP)調控。MMP是一種蛋白水解酶,能降解ECM、Bruch膜和毛細血管基底膜,導致血管內皮細胞的增殖遷移。TIMP是內源性抑制因子,可高度特異性地抑制MMP,MMP活性增強或TIMP活性減低常導致ECM降解,促進新生血管形成。其中MMP-2和TIMP-2的平衡紊亂在CNV發生中發揮重要作用[3]。研究表明后極部鞏膜MMP-2/TIMP-2之間動態失衡也參與豚鼠形覺剝奪性近視的形成[4-5],鞏膜MMP-2活性表達增高而TIMP-2表達減少可促使鞏膜ECM主動重塑形成近視,但相關研究尚不多見。

本研究以前期建立的高度近視豚鼠CNV模型為基礎,應用免疫組化及RT-PCR技術觀察高度近視豚鼠CNV中MMP-2、TIMP-2 mRNA及蛋白在質表達,初步探討其在高度近視CNV形成中的作用。

材 料 和 方 法

實驗動物 清潔級英國短毛種三色豚鼠,雌性,2周齡,體質量100～150 g,由上海市松江區松聯實驗動物場提供,于上海市第十人民醫院動物實驗中心飼養。動物生產許可證:SCXK (滬)2012-0011,使用許可證:SYXK(滬)2011-0128。實驗前檢查確認所有豚鼠身體健康,眼部無特殊疾患,雙眼屈光均為遠視且無明顯屈光參差(雙眼屈光度差值小于2.50 D)。飼養環境安靜,室溫恒定20～22 ℃,室內自然光12 h/12 h交替照明,自由進食飲水并每日2次給予新鮮綠色蔬菜補充維生素C。實驗動物按3R原則給予人道主義關懷。實驗操作均由上海市第十人民醫院倫理委員會審核通過。

激光誘導高度近視豚鼠脈絡膜新生血管模型的建立 72只2周齡三色豚鼠隨機分為實驗組(n=36)與對照組(n=36),實驗組右眼進行6周形覺剝奪誘導為高度近視組(FDM組)。實驗組采用自制半透明眼罩(材料為乳白色醫用乳膠手套)用強力膠粘于眼周毛發以完全遮蓋,每日檢查3次遮蓋情況,發現脫落立即重新粘貼,并確保形覺剝奪眼遮蓋完全且未對眼球造成壓迫,采用檢影鏡進行屈光度測量,屈光度均達到-6.00 D以上的高度近視,左眼不予干預;對照組兩眼均不予以眼罩干預。

實驗組與對照組均選取30只豚鼠右眼采用532 nm激光光凝視網膜誘導CNV。應用4%戊巴比妥以1.5 mL/100 g腹腔注射淺麻醉豚鼠,用0.5%復方托吡卡胺滴眼液充分散瞳后,于90D前置鏡下采用532 nm 激光,距離視盤1～1.5 PD圍繞視盤行視網膜光凝6～8個點。光斑直徑50μm,曝光時間0.05 s,激光功率為1 500 mW。以光凝處產生氣泡伴或不伴少量出血為擊破Bruch膜標志,作為有效點。光凝后實驗組右眼繼續遮蓋形覺剝奪,以免形覺剝奪性近視發生逆轉。

免疫組化 兩組于激光前、光凝后7、14、21、28和35天這6個時間點分別隨機選取3只豚鼠進行免疫組化,觀察光凝區域MMP-2和TIMP-2的表達,所有豚鼠僅選擇右眼進行以下實驗及分析。

麻醉處死豚鼠后完整摘除眼球,置眼球固定液(甲醛-戊二醛混合液,由復旦大學附屬眼耳鼻喉科醫院病理科提供)內48 h,經常規梯度酒精脫水、二甲苯透明、石蠟包埋,于角膜至視盤的矢狀位行3μm連續切片。免疫組化采用ABC法[7]。一抗為兔抗MMP-2多克隆抗體及兔抗TIMP-2多克隆抗體(上海生工),二抗為羊抗兔IgG抗體。應用IPP 6.0圖像分析軟件測量激光斑處積分光密度值(integral optical density,IOD),每組各時間點分別選取10張切片進行測量取平均值。

real-time PCR 兩組于激光前、光凝后7、14、21、28和35天這6個時間點隨機抽取3只豚鼠進行PCR實驗。所有豚鼠僅右眼進行實驗分析。過量麻醉處死豚鼠后,顯微操作下獲得RPE-脈絡膜-鞏膜復合物;顯微鏡下用眼科剪沿角鞏膜緣剪開球壁,沿鋸齒緣分離視網膜后去除,獲得RPE-脈絡膜-鞏膜復合物,剪取部分復合物(以視盤為中心、半徑為5 mm,所有激光斑均在此范圍內),加入預冷的500μL Trizol裂解液,充分研磨,按照RNA提取試劑盒步驟提取總RNA(北京康為世紀生物科技有限公司)。紫外分光光度法測定總RNA濃度及純度。按照第一鏈cDNA合成試劑盒步驟逆轉錄cDNA(北京康為世紀生物科技有限公司)。PCR反應使用ABI7500熒光定量PCR儀(美國Life Technology公司),反應條件為95 ℃變性5 min,40個循環(95 ℃下10 s,60 ℃下30 s,72 ℃下30 s)。引物序列參見表1,設3個副孔,取平均值。

表1 real-time PCR引物序列

結 果

免疫組化結果

MMP-2 激光前對照組視網膜神經節細胞層、感光細胞層、RPE層及脈絡膜血管層基質中都有MMP-2表達,其表達程度較低;而高度近視組中各層MMP-2表達明顯升高(圖1)。光凝后7～14天,兩組光凝區域視網膜、增殖遷移的RPE樣細胞、成纖維細胞及CNV的基質中均有MMP-2陽性表達,于21天時達高峰,呈強陽性染色,之后逐漸下降;光凝后各時間點高度近視組CNV中MMP-2陽性表達均較對照組更加顯著(P均<0.05,表2)。

TIMP-2 激光前對照組視網膜神經節細胞層、感光細胞層、RPE層及脈絡膜層基質中均有少量TIMP-2表達;而高度近視組鞏膜中TIMP-2表達明顯減少(圖1)。光凝后7～21天兩組光凝區域CNV的基質、成纖維細胞及增殖遷移的RPE細胞中TIMP-2呈陽性表達,28天時陽性表達最強;光凝后各時間點高度近視組CNV中TIMP-2陽性表達與對照組相比差異無統計學意義(P均>0.05,表2)。

Cell nucleus or matrix brown staining is regard as positive.Bar=100 μm.

圖1 光凝前后各時間點MMP-2和TIMP-2的免疫組化結果

Fig 1 Immunohistochemistry of MMP-2 and TIMP-2 at different time points before and after laser photocoagulation

Real-time PCR結果

MMP-2 光凝后7～28天高度近視組與對照組MMP-2 mRNA表達均較激光前明顯上調(P均<0.05),且兩組MMP-2 mRNA相對表達量均于21天時達到高峰,之后逐漸下降,對照組于35天時恢復至激光前水平,而高度近視組MMP-2 mRNA表達仍明顯上調(P<0.05)。兩組各時間點比較發現,激光前及激光后各時間點高度近視組MMP-2 mRNA相對表達量均明顯高于對照組(P均<0.05,圖2A)。

TIMP-2 高度近視組與對照組于光凝后7天時TIMP-2 mRNA表達較激光前未見明顯升高(P>0.05),14天時才開始明顯上調(P<0.05),兩組TIMP-2 mRNA相對表達量均于28天時達到高峰,35天時仍處于表達高水平(P<0.05)。各時間點兩組比較,高度近視組激光前TIMP-2 mRNA相對表達量明顯高于對照組(P<0.05),而光凝后各時間點兩組比較,差異均無統學意義(圖2B)。

表2 各時間點光凝損傷區MMP-2及TIMP-2陽性表達的IOD

Control group and FDM group,n=3.

A:MMP-2;B:TIMP-2.Post-laservs. pre-laser photocoagulation,(1)P<0.05,(2)P<0.01,(3)P<0.001;Controlvs.FDM:(4)P<0.05,(5)P<0.01,(6)P<0.001.Control group and FDM group,n=3.

圖2 光凝前后各時間點MMP-2及TIMP-2 mRNA相對表達量

Fig 2 Relative mRNA expressions of MMP-2 and TIMP-2 at different time points before and after laser photocoagulation

討 論

新生血管生成是一個基底膜降解、內皮細胞增殖遷移和毛細血管形成的多重步驟進程。VEGF在內皮細胞的增殖遷移中起重要作用,但遷移的微血管內皮細胞必須穿過毛細血管的基底膜及周圍的ECM才能增殖和形成管腔。因此,內皮細胞基底膜及ECM的降解是血管形成的關鍵。在近視發展過程中,鞏膜ECM也歷經主動重塑過程[4-6]。可見ECM的重塑與新生血管生成和近視的發生都密切相關,而ECM動態平衡主要由MMP和TIMP表達平衡維系,因而我們推測MMP和TIMP的平衡紊亂可能參與高度近視CNV的形成。本研究以高度近視豚鼠CNV作為病理性高度近視的研究模型,初步探討MMP-2和TIMP-2在高度近視CNV中的作用。

文獻研究[4-5,7]顯示鞏膜成纖維細胞及ECM中都有MMP-2及TIMP-2表達。劉桂香等[4]在豚鼠形覺剝奪性近視模型的研究中發現近視眼鞏膜MMP-2表達明顯上調,而TIMP-2表達減少,提示MMP-2/TIMP-2平衡破壞可能是啟動豚鼠形覺剝奪近視鞏膜ECM主動重塑的重要因素。本研究中也發現類似結果,激光前后各時間點高度近視眼鞏膜MMP-2的陽性表達均較對照眼更加顯著,TIMP-2表達則明顯降低。同時各時間點高度近視組內兩兩比較發現,鞏膜中MMP-2和TIMP-2表達不再發生明顯改變,可能是隨著形覺剝奪時間延長其表達變化逐漸趨于穩定的結果,因而mRNA結果組內比較時可忽略鞏膜的影響。

研究表明Bruch膜及其周圍基質的變化、以及MMP的活化是CNV發生的早期重要步驟[8]。MMP-2作為MMP家族的重要成員,可降解大部分新生血管基底膜和周圍ECM的成分如Ⅰ型、Ⅳ型膠原和纖連蛋白,在CNV形成中發揮重要作用[4]。TIMP-2作為一種蛋白水解酶抑制劑,主要抑制MMP-2的合成和活性,兩者之間的動態平衡對于內皮細胞形態和管腔形成具有關鍵作用[3],研究顯示在老年黃斑變性患者中CNV膜和激光誘導的大鼠CNV中均存在MMP-2 mRNA及蛋白高表達[8-11]。Lambert等[11]在野生型小鼠中應用腺病毒轉染過表達的MMPs內源性抑制劑TIMP-2,發現激光誘導的CNV生長受到顯著抑制;在體外,病毒轉染過表達TIMP-2的脈絡膜內皮細胞移行和管腔形成也明顯減少。MMP-2表達水平升高,而TIMP-2表達水平下降或不能與MMP-2對應升高,即兩者平衡失調,可導致MMP-2水解作用增加,破壞ECM的正常結構和生理功能,從而促進新生血管生長。

本研究結果顯示,激光后高度近視組MMP-2 mRNA及蛋白表達均明顯上調,21天時達到高峰,之后該酶表達仍高于激光前,但呈下降趨勢。激光后TIMP-2 mRNA及蛋白表達也明顯增加,但與MMP-2并不同步,TIMP-2早期(7天時)變化不明顯,14天時才開始升高,表明早期MMP-2的活性受TIMP-2干預較少,因而能持續地降解基底膜促進內皮細胞增殖遷移。且MMP-2表達高峰(21天)早于TIMP-2高峰期(28天),提示CNV形成過程中,先有MMP-2的活化表達,隨著MMP-2的積累,TIMP-2濃度逐漸增加以限制MMP-2的活化。綜上可見,MMP-2與TIMP-2的表達動態平衡紊亂,蛋白酶水解作用增加,從而促進高度近視CNV的發生發展。在血管生成初期MMP-2選擇性的降解Bruch膜和ECM,為血管內皮細胞增殖遷移提供了空間,促進新生血管生長進入視網膜下,CNV膜形成后又能降解毛細血管的基底膜,保證內皮細胞繼續增殖延伸。除了MMP-2/TIMP-2以外,其他MMP也參與CNV形成,例如MMP9和MMP13[12-13]。這些MMP是否參與高度近視誘導的CNV形成尚需進一步研究。

為探討近視因素的影響,本研究對高度近視組與對照組進行比較,發現激光后各觀察時間點高度近視組MMP-2 mRNA和蛋白表達均明顯高于對照組,我們推測高度近視組持續的缺氧條件使MMP-2在新生血管膜及鞏膜中表達增加,提示缺氧可能也是MMP-2活化和表達的誘導因素之一。然而,光凝后各時間點高度近視組TIMP-2表達與對照組均無顯著差異,甚至由于鞏膜的影響其mRNA表達略有降低,但差異無統計學意義,表明高度近視組持久的缺氧狀態未對TIMP-2表達造成明顯影響,但MMP-2的顯著升高導致高度近視組MMP-2和TIMP-2失調更為嚴重,這可能也是高度近視組CNV的發生率及發生程度更高的原因之一。然而,本研究僅做了MMP-2與TIMP-2的免疫組化和PCR的檢測,未進行MMP-2的酶譜分析及蛋白印跡相關研究,有待進一步完善,以深入探討其作用機制。

綜上所述,我們認為MMP-2和TIMP-2與高度近視豚鼠CNV的形成密切相關,MMP-2與TIMP-2可能通過表達平衡紊亂參與高度近視CNV的發生發展進程。通過進一步探索MMP-2和TIMP-2的相關信號通路,可為病理性高度近視CNV形成的分子機制及其防治的研究提供新線索。

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Expression of MMP-2 and TIMP-2 in laser-induced choroidal neovascularization in guinea pigs model with form-deprivation high myopia

LIU Lin1, DING Wen-zhi1, ZHANG Yun2, MA Xiao-yun2, ZOU Jun1△

(1DepartmentofOphthalmology,ShanghaiTenthPeople’sHospital,Shanghai200072,China;2DepartmentofOphthalmology,ShanghaiGuanghuaHospitalofIntegrativeMedicine,Shanghai200052,China)

Objective To establish the high myopic choroidal neovascularization (CNV) in guinea pigs and to investigate the role of (matrix metalloproteinase-2,MMP-2) and tissue inhibitor-2 of metalloproteinase (TIMP-2) in high myopic CNV. Methods Seventy-two 2-week-old guinea pigs were randomized into control group (n=36) and high myopia group (n=36).Right eyes were indued form deprivation high myopia for 6 weeks.Thirty guinea pigs were randomly selected in each group,and CNV were induced in the right eyes by the 532 nm laser.MMP-2 and TIMP-2 expressions were investigated by immunohistochemistry pre-laser and 7,14,21,28,35 days after laser induction,respectively,while MMP-2 and TIMP-2 relative expression levels in retinal pigment epithelium (RPE)-

choroid-sclera complex were detected by real-time PCR.Integral opitical density (IODs) of positive expression and mRNA relative expression levels of these factors were performed by statistical analyses. Results The expressions of MMP-2 and TIMP-2 were up-regulated in the two groups after laser photocoagulation through immunohistochemistry and real-time PCR examinations.Expression of MMP-2 peaked at 21 d and TIMP-2 at 28 d,respectively.IODs of positive expression and mRNA relative expression levels of MMP-2 were higher in high myopia group than those in control group at each inspective time point,and the differences were statistically significant (P<0.05).TIMP-2 expression was significantly reduced in high myopia group compared with control group before laser photocoagulation (P<0.05),while there was no significant difference between the two groups at each time point after laser photocoagulation. Conclusions MMP-2 and TIMP-2 were closely related to the formation of high-myopic CNV.Balance disorders of MMP-2 and TIMP-2 might participate in the occurrence and development of high-myopic CNV.

high myopia; choroidal neovascularization; guinea pig; laser; MMP-2; TIMP-2

R778.1+1

A

10.3969/j.issn.1672-8467.2017.03.011

2016-09-01;編輯:段佳)

上海市科委基礎研究重點項目(11JC1401202)

△Corresponding author E-mail:zoujun70@126.com

*This work was supported by the Key Basic Research Project from Science and Technology Commission of Shanghai Municipality (11JC1401202).