固定化纖維素酶及其對(duì)棉纖維的作用

郭陳岑，張 宇，張永奎，謝通慧，楊 坤

(四川大學(xué) 化工學(xué)院，四川 成都 610065)

固定化纖維素酶及其對(duì)棉纖維的作用

郭陳岑，張 宇，張永奎，謝通慧，楊 坤*

(四川大學(xué) 化工學(xué)院，四川 成都 610065)

為實(shí)現(xiàn)纖維素酶處理棉織物后重復(fù)使用，以pH敏感型樹脂——聚丙烯酸樹脂Ⅳ為載體，吸附固定纖維素酶。結(jié)果表明，纖維素酶成功固定于載體上，酸性條件下溶解，中性條件下析出回收，其酶活固定率與4次酶活回收率分別為45.5%和81.4%。與游離纖維素酶相比，固定化纖維素酶熱穩(wěn)定性增強(qiáng)，在酶精練過程中，其催化速率更為穩(wěn)定可控。表征發(fā)現(xiàn)經(jīng)固定化纖維素酶處理后棉纖維結(jié)晶度增大，吸水性、可染性增強(qiáng)，纖維卷曲減少，對(duì)纖維損傷程度較小。

纖維素酶；pH敏感型樹脂；棉纖維；酶精練

纖維素酶可在溫和條件下去除棉纖維表面雜質(zhì)，提高其可染性與吸濕吸水性，還可以水解棉織物表層的細(xì)小纖維素，平滑織物[1]。然而，隨著催化水解反應(yīng)的進(jìn)行，纖維素酶逐漸進(jìn)入纖維孔隙，侵蝕內(nèi)部，造成不可逆的纖維損傷和力學(xué)性能降低，不利于高檔棉織物的生產(chǎn)，且不易回收利用，穩(wěn)定性較差，生物洗滌成本高[2]。

近年來，固定化纖維素酶的研究迅速發(fā)展。固定化纖維素酶能有效增大酶分子的體積，將水解作用鎖定于棉纖維表面，去除初生胞壁中蠟質(zhì)、果膠與細(xì)小纖維素的同時(shí)，減小對(duì)棉織物結(jié)構(gòu)的破壞。在水解不溶性純棉底物時(shí)，酶固定于可溶性載體能減小傳質(zhì)阻力，更有效地催化水解，但難以回收；固定于不溶性載體易回收，但難與棉纖維分離。pH敏感型樹脂作為一種可逆載體，通過調(diào)節(jié)環(huán)境pH值可實(shí)現(xiàn)其溶解性能的轉(zhuǎn)化，兼顧兩者的優(yōu)點(diǎn)[3]。聚丙烯酸樹脂Ⅳ為甲基丙烯酸甲酯-甲基丙烯酸丁酯-甲基丙烯酸二甲胺基乙酯(1∶1∶2)共聚物，由于分子鏈中存在叔胺基，能夠在pH小于5.0時(shí)溶解，在pH大于5.0時(shí)溶脹。本文以聚丙烯酸樹脂Ⅳ為載體，利用其羧基與纖維素酶中的胺基的靜電吸附，制成pH敏感型固定化纖維素酶，應(yīng)用于純棉處理工藝，探究固定化纖維素酶對(duì)棉纖維結(jié)構(gòu)及性能的影響。

1 試驗(yàn)部分

1.1 材料和儀器

新疆精梳棉(經(jīng)沸水浴10 min，用蒸餾水洗滌3次后，晾干梳理后備用)、聚丙烯酸樹脂Ⅳ(西安悅來醫(yī)藥科技有限公司)、酸性纖維素酶(上海康地恩生物科技有限公司)。

UV-1800紫外分光光度計(jì)(上海美譜達(dá)儀器有限公司)、Nicolet 6700傅里葉紅外光譜儀(賽默飛世公司)、RF-6000熒光分光光度檢測(cè)儀(島津企業(yè)管理有限公司)、JSM-7500F場發(fā)射掃描電子顯微鏡(日本電子株式會(huì)社)。

1.2 纖維素酶的固定與回收

取2.0 g聚丙烯酸樹脂Ⅳ(R)溶于pH 3.0的磷酸溶液中，調(diào)節(jié)pH至4.0，加入1 ml纖維素酶(FC)，攪拌固定1 h。調(diào)節(jié)pH至5.5，4 000 r/min離心10 min，洗滌沉淀。用pH 3.0的磷酸溶液溶解沉淀，調(diào)pH至4.0，并定容至100 ml，制得固定化纖維素酶(IC)，4 ℃下儲(chǔ)存?zhèn)溆谩Ｕ{(diào)節(jié)pH過程中使用1 mol/L NaOH溶液及2 mol/L磷酸溶液。

量取50 ml固定化纖維素酶(IC)，調(diào)節(jié)pH至5.5，4 000 r/min離心10 min。洗滌沉淀后用pH 3.0的磷酸溶液溶解，調(diào)節(jié)pH至4.0，并定容至50 ml，制得回收固定化纖維素酶。重復(fù)上述操作，分別制得回收1～4次的固定化纖維素酶。以pH 4.0的0.5%(w/v)CMC溶液為底物，50 ℃，用CMC分解法[4]分別測(cè)定稀釋100倍的游離纖維素酶、固定化纖維素酶與回收固定化纖維素酶酶活。按公式(1)、(2)計(jì)算酶活固定率與回收率：

(1)

(2)

式中，U1為游離纖維素酶酶活；U2為固定化纖維素酶酶活；U3為回收固定化纖維素酶酶活。

1.3 纖維素酶的最適反應(yīng)條件

以pH2.5-6.5CMC溶液為底物，50 ℃條件下，分別測(cè)定纖維素酶及固定化纖維素酶相對(duì)酶活。于20～80 ℃條件下，纖維素酶與固定化纖維素酶分別以pH4.5、pH4.0的CMC溶液作為底物，分別測(cè)定相對(duì)酶活。以滅活酶為對(duì)照，最大酶活為100%。

1.4 纖維素酶處理棉纖維

經(jīng)預(yù)處理的棉纖維置于含0.1%JFC的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液(pH4.0，浴比1∶30)中，50 ℃保溫10min。分別加入1ml具有相同CMC酶活的FC與IC，以沸水浴滅活20min的酶液作為空白，50 ℃，180r/min水解反應(yīng)6h。間隔取樣，DNS分光光度法[5]測(cè)水解液中還原糖濃度。

1.5 測(cè)試方法

1.5.1 失重率

將纖維素酶處理后的棉纖維于50 ℃烘干，105 ℃烘至恒重，按公式(3)計(jì)算失重率：

(3)

1.5.2 果膠去除率

棉纖維中的果膠用0.5%(w/v)的草酸銨溶液提取，硫酸咔唑比色法檢測(cè)含量，并計(jì)算果膠去除率。

1.5.3 上染百分率[6]

將0.1g棉纖維置于25ml，0.05g/L的直接大紅溶液中，100r/min進(jìn)行染色。采用殘液法計(jì)算上染百分率。

1.5.4 吸水性

吸水量按第35版美國藥典及《yy0330-2002醫(yī)用脫脂棉》中棉吸水量檢測(cè)法測(cè)定。

1.5.5 結(jié)晶度

棉纖維剪碎后用RigakuD/max-TTRIIIX射線衍射儀檢測(cè)，Jade5.0軟件分析。結(jié)晶度計(jì)算公式為：

(4)

式中，I002和Iam分別是002衍射晶面2θ=22.8°和2θ=18.0°散射峰的強(qiáng)度。

1.5.6 熒光光譜、紅外光譜

纖維素酶、固定化纖維素酶、樹脂分別用熒光分光光度儀檢測(cè)熒光發(fā)射光譜，固定激發(fā)光為280nm，掃描接收波長為300～500nm；纖維素酶、固定化纖維素酶及樹脂凍干后用傅里葉紅外光譜儀測(cè)定紅外光譜；經(jīng)FC處理前后棉纖維的表面和截面情況，采用掃描電子顯微鏡進(jìn)行觀察。

2 結(jié)果與討論

2.1 纖維素酶的固定化

聚丙烯酸樹脂Ⅳ粉末(R)、真空凍干的纖維素酶(FC)及固定化纖維素酶(IC)的紅外圖譜如圖1(a)所示。R的特征峰為：甲基伸縮振動(dòng)的吸收峰(2 955cm-1)，叔胺寬而強(qiáng)的多重譜帶(2 500～2 600cm-1)，C=O的伸縮振動(dòng)(1 730cm-1)，以及O-C-O的伸縮振動(dòng)(1 148cm-1)。FC的特征峰為：酰胺Ⅰ帶特征峰，即C=O的伸縮振動(dòng)(1 647cm-1)；酰胺Ⅱ帶的特征峰，即N-H的彎曲振動(dòng)(1 544cm-1)，以及氫鍵與酰胺鍵締合形成的N-H的伸縮振動(dòng)峰(3 425cm-1)，也有可能是羥基的吸收峰；最后是酰胺Ⅲ帶的特征峰，即C-N鍵的彎曲振動(dòng)(1 240cm-1)。在IC中均存在上述兩者特征峰，由此可證明纖維素酶成功與聚丙烯酸樹脂Ⅳ結(jié)合。

R、FC和IC在280nm固定激發(fā)光下，300～500nm范圍內(nèi)熒光發(fā)射譜圖如圖1(b)所示。

(a)紅外光譜圖

(b)熒光光譜圖圖1 游離纖維素酶(FC)、固定化纖維素酶(IC)及聚丙烯酸樹脂Ⅳ(R)光譜圖

FC在336nm處有一較強(qiáng)熒光特征峰；R在檢測(cè)范圍內(nèi)并未出現(xiàn)明顯的熒光發(fā)射峰，說明聚丙烯酸樹脂IV作為IC的固定載體，對(duì)IC熒光檢測(cè)的影響可忽略；IC于336nm處同樣檢測(cè)到纖維素酶特征熒光發(fā)射峰，說明IC中已固定纖維酶，與紅外光譜分析結(jié)果相同。而在相同濃度、相同稀釋倍數(shù)下，IC熒光峰略低于FC熒光峰，由此證明固定化過程中有一定酶量損失，部分纖維素酶固定于載體上。

在相同的實(shí)驗(yàn)條件(50 ℃，pH4.0)下測(cè)定了相同酶量的FC與IC酶活，得出酶活固定率為45.5%。由于固定方式為物理吸附，固定化及回收過程中的酶量及酶活損失是固定率降低的重要因素。

在IC的回收實(shí)驗(yàn)中，隨著回收次數(shù)的增加，其酶活逐漸減小，回收4次后，其活性分別為原IC酶活的94.8%、90.9%、87.0%、81.4%。重復(fù)使用時(shí)，酶活損失較少，且降低速率較為穩(wěn)定。造成回收后固定化纖維素酶活性損失的可能因素為回收操作過程中部分纖維素酶從載體上脫落及部分固定化纖維素酶失活。

2.2FC和IC的最適反應(yīng)條件

不同pH條件下FC與IC的酶活如圖2(a)所示。隨著緩沖液pH值的增加，F(xiàn)C與IC酶活性均呈現(xiàn)出先升后降的趨勢(shì)。在pH值低于3.5時(shí)，IC酶活略高于FC；而pH高于4.0時(shí)，則相對(duì)較低。這是由于聚丙烯酸樹脂Ⅳ是陽離子型載體，含有大量叔胺基，纖維素酶與其結(jié)合固定后，反應(yīng)區(qū)域比溶液的整體環(huán)境堿性略強(qiáng)，故使得IC的最適反應(yīng)pH向酸性偏移。

不同溫度條件下，F(xiàn)C與IC的酶活如圖2(b)所示。酶催化反應(yīng)速率隨著環(huán)境溫度的升高而加快，但高溫也使酶蛋白空間結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，發(fā)生熱失活。FC和IC的最適反應(yīng)溫度均為50 ℃，在50～80 ℃范圍內(nèi)，IC的酶活相比FC下降得更為平緩，耐熱性提高。這是由于纖維素酶被吸附固定于載體上，阻礙了蛋白質(zhì)分子鏈的伸展，空間結(jié)構(gòu)改變更為困難，提高了IC的耐熱性。

2.3FC和IC處理棉纖維

2.3.1 酶解產(chǎn)物

圖3為相同CMC酶活的FC與IC在相同條件下處理棉纖維時(shí)，水解液中還原糖含量變化情況。FC在前1h還原糖含量增加較快，1h后增長逐漸減緩，酶解速率降低。由于反應(yīng)初期水解液中產(chǎn)物含量比較低，底物抑制作用不明顯，F(xiàn)C可保持較大催化速率；隨著反應(yīng)進(jìn)行，產(chǎn)物抑制作用增大；且FC耐熱性較差，出現(xiàn)熱失活，使得水解速率逐漸變小。

而IC在檢測(cè)的4h內(nèi)持續(xù)保持一定的水解速率，產(chǎn)物穩(wěn)定增長。IC分子體積較大，與棉纖維反應(yīng)時(shí)，受到的空間阻力大，初始反應(yīng)速率較低。而催化過程中，底物抑制作用相對(duì)較小，熱失活不明顯，水解速率基本保持穩(wěn)定，有利于實(shí)際生產(chǎn)中的設(shè)計(jì)與監(jiān)控。

(a)最適反應(yīng)pH

(b)最適反應(yīng)溫度圖2 游離纖維素酶(FC)與固定化纖維素酶(IC)

圖3 棉纖維水解液中還原糖量的變化

2.3.2 棉纖維結(jié)構(gòu)

圖4為經(jīng)IC處理前后棉纖維的表面及截面的SEM圖。原棉纖維帶有天然卷曲，內(nèi)部中空的管狀結(jié)構(gòu)(圖a)；其表面附有果膠、蠟質(zhì)等疏水性物質(zhì)，呈脊?fàn)罨驕蠣?圖b)；截面卷曲呈“腎形”，可見中腔(圖c)。經(jīng)固定化纖維素酶處理后，其表層纖維素發(fā)生剝皮反應(yīng)。在振蕩作用下，初生胞壁隨表層纖維素被除去,暴露出纖維束(圖e)。同時(shí)，在酶解作用下，中腔結(jié)構(gòu)發(fā)生變化(圖f)，纖維卷曲減少甚至消失，呈扁平狀(圖d)。表面結(jié)構(gòu)的變化及纖維卷曲的減少都有利于棉纖維的可染性及吸水性提升。

圖4 原棉纖維及固定化纖維素酶處理后棉纖維的SEM圖

2.3.3 棉纖維性能

表1為FC與IC處理前后棉纖維的性能變化情況。經(jīng)酶處理的棉纖維的失重率、果膠去除率、結(jié)晶度、可及性及吸水量均高于原棉纖維。這是由于纖維素酶的催化作用，水解去除了纖維表面大量的纖維素，并在攪拌作用下剝離了纖維素表層的果膠等非纖維素雜質(zhì)。水解作用大量發(fā)生在非晶區(qū)，結(jié)晶區(qū)比例增大，使得棉纖維結(jié)晶度升高；纖維素、果膠的去除造成了纖維的失重；疏水性雜質(zhì)的去除使得大量纖維素露出，大大增強(qiáng)了纖維的可及性，一定程度上提高了棉纖維的可染性和吸水性。

表1 處理前后棉纖維的性能

注：各數(shù)值誤差均低于5%。

通過比較發(fā)現(xiàn)，經(jīng)FC處理的棉纖維失重率、果膠去除率、可及性及吸水量均高于IC處理的棉纖維，而結(jié)晶度略低。這是由于FC可滲入棉纖維內(nèi)部，其催化水解作用相對(duì)不受控制，使得棉纖維內(nèi)部的空隙增大，結(jié)晶區(qū)也發(fā)生水解反應(yīng)，更多雜質(zhì)被去除，可染性、吸水性增強(qiáng)。同時(shí)，纖維結(jié)構(gòu)破壞得更嚴(yán)重，失重率增

加，這也成為纖維強(qiáng)度下降的因素之一。對(duì)于IC而言，由于固定后體積增加，難以透過表層的空隙滲入棉纖維內(nèi)部，催化水解反應(yīng)主要集中在表層，故IC處理的棉纖維的失重率相對(duì)較小，對(duì)棉纖維的損傷及其力學(xué)性能的影響小；果膠部分去除，可及性也略升高；催化水解反應(yīng)主要發(fā)生在非晶區(qū)，結(jié)晶度升高。

3 結(jié)論

(1)以聚丙烯酸樹脂Ⅳ作為載體，吸附結(jié)合纖維素酶，成功制備了固定化纖維素酶，其熱穩(wěn)定性提高，酶活固定率和4次回收率分別為45.5%和81.4%。

(2)制備的pH敏感型固定化纖維素酶能夠有效應(yīng)用于棉纖維處理。由于其空間位阻較大，將水解反應(yīng)控制在纖維表面，保持較穩(wěn)定的催化水解速率，實(shí)際操作中可控性更強(qiáng)，能有效減少不可逆的纖維損傷。

(3)固定化纖維素酶在處理過程中能部分去除棉纖維表面果膠等雜質(zhì)，暴露纖維束，提高可染性；改變纖維結(jié)構(gòu)，減少卷曲與扭轉(zhuǎn)，有利于織物吸水性、吸濕性及透氣性的提高。

[1] 劉 磊,陸必泰.棉織物的酸性纖維素酶拋光工藝[J].印染, 2012, 38(3):37-39.

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Immobilized Cellulase and Its Effect on Cotton Fibers

GUO Chen-cen, ZHANG Yu, ZHANG Yong-kui, XIE Tong-hui, YANG Kun*

(School of Chemical Engineering, Sichuan University, Sichuan 610065, China)

Polyacrylic resin IV of pH sensitive resin was used as carrier for immobilization of cellulase to ensure biotreatment of cellulose. The results showed that cellulase was immobilized on resin. It was dissolved under acid condition and precipitated under neutral condition. Activity fixed rate and recovery rate were 45.5% and 81.4%, respectively. Compared with free cellulase, immobilized cellulase had higher thermal stability. In scouring process, immobilized cellulase remained stable catalytic rate. The crystallinaty index, water adsorption and dyeability of cotton were all increased and fiber crimp was decreased. Cotton treated with immobilized cellulase showed less damage.

cellulase; pH sensitiveresin resin; cotton fiber; enzymatic treatment

2017-03-02

四川大學(xué)大學(xué)生創(chuàng)新訓(xùn)練項(xiàng)目(201610611654)

郭陳岑(1992-)，女，碩士研究生，研究方向：酶處理棉纖維，E-mail：gcc2016scu@163.com。

*通信作者：楊 坤(1978-)，男，副教授，博士，研究方向：環(huán)境微生物及生物分離，E-mail:cookyoung@scu.edu.cn。

TS190.2

A

1673-0356(2017)05-0001-04