HPLC標準曲線法測定酵母中谷胱甘肽

杜梨梨，羅必英

（安琪酵母股份有限公司檢測中心，湖北宜昌443005）

HPLC標準曲線法測定酵母中谷胱甘肽

杜梨梨，羅必英

（安琪酵母股份有限公司檢測中心，湖北宜昌443005）

通過HPLC標準曲線法進行酵母中還原型和氧化型谷胱甘肽含量測定的研究，利用Intersil ODS-3 C18柱，以庚烷磺酸鈉-磷酸鹽緩沖溶液（pH3.0）和甲醇（v∶v=90∶10）為流動相，流速為1.0 mL/min，檢測波長為210nm，得到氧化型和還原型谷胱甘肽的相關系數均為0.9999，檢測限分別為2.40mg/L、2.27mg/L，定量限分別為9.0 mg/L、8.5 mg/L，精密度分別為2.00%、0.94%，回收率分別為100.12%～103.43%和95.23%～96.44%之間。

谷胱甘肽； 氧化型； 還原型； HPLC； 酵母

谷胱甘肽是由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸結合而成的含有巰基的三肽，有還原型和氧化型兩種形式[1]。它廣泛存在于所有的生物細胞中，以酵母[2]、小麥胚芽以及人和動物肝臟、腎等含量最為豐富。谷胱甘肽具有整合解毒作用，能幫助人體保持正常的免疫系統功能。它可以用于藥物，也可以作為功能性食品的有效成分，在延緩衰老、增強免疫力、抗腫瘤等功能性食品中廣泛應用。

酵母中谷胱甘肽的檢測方法較多，有比色法、熒光法、碘量法和高效液相色譜法（HPLC）等[2-5]。本實驗采用沸水浴提取酵母中的谷胱甘肽，用高效液相色譜法檢測其含量，該方法對完善和改進谷胱甘肽的檢測方法有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

耗材及試劑：還原型谷胱甘肽標準品：沃凱，國藥集團化學試劑有限公司，CAS：70-18-8；氧化型谷胱甘肽標準品：Sigma-Aldrich，CAS：27025-41-8；庚烷磺酸鈉，磷酸二氫鉀，磷酸，鹽酸。

儀器設備：Agilent1200高效液相色譜儀；電熱恒溫水浴鍋；色譜柱：Intersil ODS-3 C18，250 mm× 4.6 mm，5μm。

1.2 實驗方法

1.2.1 酵母細胞中谷胱甘肽的提取

稱取樣品0.5 g，加0.01 mol/L鹽酸40 mL，100℃水浴加熱，并不停攪拌，5 min后迅速置于冰浴中冷卻至室溫，用0.01 mol/L鹽酸定容至50 mL。搖勻，用0.45μm微孔濾膜過濾后待測。

1.2.2 谷胱甘肽的HPLC分析條件

流動相：A∶B=90∶10（v∶v）。

A相（庚烷磺酸鈉-磷酸鹽緩沖溶液）：稱取磷酸二氫鉀3.4 g，庚烷磺酸鈉1.1 g，溶于500 mL水中，用磷酸調節pH值至3.0，0.45μm微孔濾膜過濾。

B相：甲醇。

檢測波長，210 nm；流速，1.0 mL/min；進樣量，20μL；柱溫，35℃。

1.2.3 谷胱甘肽標準曲線的繪制

配制濃度分別為8μg/mL、20μg/mL、35μg/mL、70μg/mL、140μg/mL的谷胱甘肽系列標準溶液，依上述分析條件進樣分析，制作氧化型和還原型谷胱甘肽標準品工作曲線。

1.2.4 HPLC測定酵母細胞中谷胱甘肽的含量

取1.2.1中待測液進樣分析，色譜條件如上所述。依據1.2.3中谷胱甘肽標準系列工作曲線計算樣品中氧化型和還原型谷胱甘肽的含量。

2 結果與分析

2.1 檢測波長的選擇

取一定濃度的還原型和氧化型谷胱甘肽進行檢測，兩者的光譜圖見圖1、圖2。由圖1、圖2可知，氧化型與還原型谷胱甘肽的最大吸收波長在190～195 nm之間，由于儀器在此波長時不夠穩定，故檢測波長選擇210 nm。

2.2 流動相（庚烷磺酸鈉-磷酸鹽緩沖溶液）pH值的選擇

流動相pH值會影響樣品的出峰時間。選擇3個不同pH值的庚烷磺酸鈉-磷酸鹽緩沖溶液進行實驗，還原型和氧化型谷胱甘肽的出峰時間見表1。由于pH2.5時標樣出峰時間較長，且不利于保護色譜柱，故選擇庚烷磺酸鈉-磷酸鹽緩沖溶液的pH3.0。

2.3 流動相比例的選擇

圖1 還原型谷胱甘肽光譜圖

圖2 氧化型谷胱甘肽光譜圖

表1 不同pH值流動相對應谷胱甘肽出峰時間表

流動相成分不同，樣品出峰時間不同。選擇5個不同的流動相比例進行實驗，還原型和氧化型谷胱甘肽的出峰時間見表2。依據出峰時間選擇A相與B相比例為90∶10，氧化型和還原型谷胱甘肽的圖譜見圖3。

表2 不同流動相比例對應谷胱甘肽出峰時間表

2.4 樣品處理方法考察

酵母中谷胱甘肽的提取受鹽酸濃度、水浴鍋溫度以及提取時間3個因素的影響。本實驗對每個因素進行3個水平的考察。溫度選擇80℃、100℃、121℃，鹽酸濃度選擇0.005 mol/L、0.01 mol/L、0.02 mol/L，處理時間選擇5 min、10 min、15 min進行正交實驗，實驗結果見表3。

由表3可知，溫度的影響最大，其中100℃時提取效果最好。鹽酸濃度為0.005 mol/L和0.01 mol/L時差別不大，提取結果均高于0.02 mol/L，此時選擇0.01 mol/L。處理時間不同，提取效果也不同，依次是5 min的提取效果＞15 min的提取效果＞10 min的提取效果。

針對正交實驗的結果，進行正交實驗補充實驗。對某一樣品，處理條件為溫度100℃、鹽酸濃度0.01 mol/L，時間選擇3 min、4 min、5 min、6 min、7 min、10 min和15 min。實驗結果見圖4。

圖3 流動相比例為90:10時氧化型和還原型谷胱甘肽圖譜

圖4 不同樣品處理時間對應的谷胱甘肽含量

由圖4可知，當處理時間為5 min時，還原型和氧化型谷胱甘肽的提取效果都比較好，因此樣品處理時間選擇5 min，樣品圖譜見圖5。

圖5 樣品處理時間為5 min時對應的色譜圖

表3 3因子3水平正交實驗結果表

表4 HPLC標準曲線法檢測氧化型和還原型谷胱甘肽結果

2.5 線性范圍考察

配制濃度在1～200 mg/L范圍內的一系列混標進行HPLC分析。結果表明，當谷胱甘肽的濃度達到145 mg/L以上時，氧化型和還原型谷胱甘肽的峰形不對稱，說明最大濃度應小于145 mg/L。當氧化型、還原型谷胱甘肽濃度分別為2.40 mg/L、2.27 mg/L時，檢測限約為3倍的噪聲水平。當氧化型、還原型谷胱甘肽濃度分別為9.0 mg/L、8.5 mg/L時，檢測限約為10倍的噪聲水平，此濃度為儀器的定量限。

2.6 精密度考察

稱取同一樣品6份，進行平行測定。由表4可知，氧化型和還原型谷胱甘肽的相對標準偏差分別為2.00%、0.94%。

2.7 回收率考察

根據精密度測定的結果，可知樣品含量。以上同一個樣取9份，分別添加約80%、100%、120%進行回收率測定。測定數據見表4，氧化型和還原型谷胱甘肽的加標回收率在95.23%～103.43%之間。

3 結論

本實驗建立了一種快速、準確測定谷胱甘肽的高效液相色譜方法。利用Intersil ODS-3 C18柱，以庚烷磺酸鈉-磷酸鹽緩沖溶液（pH3.0）和甲醇（v∶v= 90∶10）為流動相，流速為1.0 mL/min，檢測波長為210 nm，在10 min內成功分離和定量分析了還原型和氧化型谷胱甘肽。該方法下，氧化型和還原型谷胱甘肽的相關系數均為0.9999，檢測限分別為2.40 mg/L、2.27 mg/L，定量限分別為9.0 mg/L、8.5 mg/L，精密度分別為2.00%、0.94%，回收率分別為100.12%～103.43%、95.23%～96.44%。

[1] 賈貞,王丹,游松.谷胱甘肽的研究進展[J].沈陽藥科大學學報,2009,26(3)：238-241.

[2] 范崇東,王淼,徐榕榕.熱水提取酵母中谷胱甘肽的條件優化[J].食品工業科技,2004(2)：127-129.

[3] 杜小莉,朱珠,傅強,等.HPLC測定還原型谷胱甘肽的血漿濃度[J].中國藥學雜志,2005(6)：64-67.

[4] 滕艷坤,闞微娜.HPLC法測定還原型谷胱甘肽片中雜質氧化型谷胱甘肽含量[J].中國藥師,2014(2)：45-47.

[5] 陳芬,趙曉燕,饒欽雄,等.HPLC測定姬松茸中谷胱甘肽的含量[J].天然產物研究與開發,2014(9)：122-125.

Determination of Glutathione in Yeast by HPLC Standard Curve Method

DU Lili and LUO Biying
(Angel Yeast Co.Ltd.,Yichang,Hubei 443005,China)

The content of reduced/oxidized glutathione in yeast was measured by HPLC standard curve method.Intersil ODS-3 C18 column was applied,sodium heptane sulfonate-hydrogen phosphate buffer solution(pH=3)and methanol(v∶v=90∶10)was used as mobile phase,flowing rate was 1.0 mL/min,and detection wavelength was 210 nm.The correlation coefficient of reduced/oxidized glutathione was 0.9999,and their detection limits were 2.27 mg/L and 2.40 mg/L respectively,their quantification limits were 8.5 mg/L and 9.0 mg/L respectively,their precision were 0.94%and 2.00%respectively,and their recoveries were 95.23%to 96.44%and 100.12%to 103.43%respectively.(Trans.by YUE YANG)

glutathione;oxidized;reduced;HPLC;yeast

TS261.1；TS261.7；TQ926

A

1001-9286（2017）06-0119-04

10.13746/j.njkj.2017014

2017-01-22

杜梨梨（1983-），女，從事生物技術方面的專業研究。

優先數字出版時間：2017-04-17；地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/52.1051.TS.20170417.1056.008.html。