臍血間充質(zhì)干細(xì)胞對肺纖維化大鼠MMP2/TIMP-1的影響*

左萬里，黃積雄，鄧冏睿，趙潔敏，周 偉，雷澤洪，黃炎明

(1.暨南大學(xué)附屬江門中醫(yī)院/江門市五邑中醫(yī)院，廣東 江門 529000； 2.中山大學(xué)附屬江門醫(yī)院/江門市中心醫(yī)院，廣東 江門 529000)

肺纖維化(Pulmonary Fibrosis)是多種病因引起的間質(zhì)性肺疾病的終末期病變。近期研究發(fā)現(xiàn)，肺纖維化的發(fā)生與肺組織基質(zhì)金屬蛋白酶-2(MMP-2)、基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制劑-1(TIMP-1)表達(dá)失衡相關(guān)[1]。間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymal Stem Cells，MSCs)是一種具備多向分化潛能、趨化特性、免疫調(diào)節(jié)作用及旁分泌功能的干細(xì)胞，對MMP-2/TIMP-1具有調(diào)節(jié)作用。因此，我們選用博來霉素誘導(dǎo)建立肺纖維化大鼠模型，給予臍血間充質(zhì)干細(xì)胞(CB-MSCs)對肺纖維化大鼠進(jìn)行干預(yù)，觀察CB-MSCs對肺纖維化大鼠MMP-2、TIMP-1水平的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供雄性SPF級SD大鼠36只，隨機(jī)分為3組，每組12只，分別為正常對照組(C組)、肺纖維化模型組(M組)及CB-MSCs治療組(T組)。各組大鼠體重(203±34) g，組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。臍血間充質(zhì)干細(xì)胞由廣州賽吉生物科技有限公司提供。

1.2 肺纖維化模型建立及MSCs移植

2%戊巴比妥溶液按50 mg/kg體重對各組大鼠進(jìn)行腹腔注射麻醉，頸正中切口顯露氣管，C組大鼠于氣管內(nèi)注入0.1 mL生理鹽水，M、T組大鼠分別于氣管內(nèi)注入以5 mg/kg體重配制的博萊霉素生理鹽水溶液0.1 mL，注射后立即直立旋轉(zhuǎn)大鼠2 min，使藥物于肺內(nèi)均勻分布。縫合皮膚，局部消毒后繼續(xù)在原飼養(yǎng)環(huán)境下飼養(yǎng)[2]。次日C、M組大鼠經(jīng)尾靜脈注射生理鹽水1 mL對照，T組大鼠經(jīng)尾靜脈注射CB-MSCs106。建模后第28 d及42 d分別處死各組大鼠的一半(分別記為C1、C2、M1、M2、T1、T2組)。

1.3 測定MMP-2、TIMP-1水平

取1 g右肺，剪碎后加入預(yù)冷的PBS溶液9 mL，然后用高速勻漿機(jī)以15 000 r/min充分勻漿，所得勻漿液離心15 min后收集上清500 ul，于-80°C低溫凍存。待實(shí)驗(yàn)結(jié)束、所有標(biāo)本采集完后，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)雙抗體夾心法，同時(shí)批量檢測肺組織MMP-2、TIMP-1水平。

1.4 大鼠肺組織病理標(biāo)本制作及觀察

左肺用生理鹽水沖洗，浸泡于4%多聚甲醛緩沖液中固定，常規(guī)酒精脫水、石蠟包埋，制作HE、Masson染色切片。光鏡下觀察肺組織成纖維細(xì)胞、膠原纖維等肺間質(zhì)結(jié)構(gòu)病理改變情況。根據(jù)Szapiel等的方法，對HE染色切片評定肺組織肺泡炎程度，對Masson染色切片評定肺組織纖維化程度。肺泡炎分四級：(1) 無(-)；(2) 輕(+)：受累范圍<20%，肺泡結(jié)構(gòu)完整，肺泡間隔增寬，病變局限；(3) 中(++)：受累范圍20%～50%；(4) 重(+++)：受累范圍>50%，彌漫性肺泡炎，偶可見肺泡腔內(nèi)細(xì)胞及出血造成的實(shí)變。肺纖維化分四級：(1) 無(-)；(2) 輕(+)：受累范圍<20%，累及胸膜及胸膜下肺實(shí)質(zhì)，肺泡結(jié)構(gòu)發(fā)生紊亂；(3) 中(++)：受累范圍20%～50%，肺纖維化從胸膜開始延伸，但仍屬局部；(4) 重(+++)：受累范圍>50%，彌散性肺纖維化、融合損傷并伴有廣泛肺實(shí)質(zhì)結(jié)構(gòu)紊亂。等級資料轉(zhuǎn)化為計(jì)量資料：-為0分，+為1分，++為2分，+++為3分。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 大鼠一般情況

C組大鼠一般情況良好，無死亡。M組造模后死亡2只，該組大鼠活動(dòng)、飲食情況明顯差于C組。T組在MSCs移植后死亡1只，但一般情況較M組好轉(zhuǎn)。所有大鼠頸前傷口于造模3～4 d后自然愈合。

2.2 大鼠肺組織病理學(xué)觀察

C1、C2組大鼠肺泡結(jié)構(gòu)正常，未見明顯炎癥性或纖維化改變，無膠原纖維沉積。模型M1組大鼠肺組織HE染色可見肺泡間隔明顯增寬，伴水腫、出血，大量炎性細(xì)胞浸潤；Masson染色可見肺泡結(jié)構(gòu)紊亂，隨時(shí)間延長M2組的肺纖維化更為嚴(yán)重，伴大量藍(lán)綠染色的膠原纖維沉積。治療T1組的肺泡炎程度則顯著減輕，Masson染色可見肺纖維化、肺泡間隔增寬程度較M1組改善，T2組藍(lán)染膠原沉積顯著減少，肺纖維化等改變亦較M2組明顯減輕，見圖1。

2.3 各組大鼠肺泡炎、肺纖維化程度評分比較

模型M1組大鼠肺泡炎及纖維化程度評分較對照C1組、治療T1組均顯著升高(P<0.05)；模型M2組大鼠肺泡炎及纖維化程度評分較對照C2組升高，而治療T2組較M2組下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

2.4 各組大鼠肺組織MMP-2、TIMP-1及MMP-2/TIMP-1比較

M1組大鼠MMP-2/TIMP-1比值較對照C1組、治療T1組均顯著升高(P<0.05)；M2組大鼠肺泡炎及纖維化程度評分較對照C2組升高，而治療T2組較M2組下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1。各組大鼠肺組織MMP-2/TIMP-1分別與肺泡炎程度評分、肺纖維化程度評分存在顯著正相關(guān)(r分別為0.63、0.57)。

圖1 大鼠肺組織病理學(xué)觀察(左圖為HE×100倍，右圖為Masson×100倍)

治療時(shí)間(d)組別肺泡炎程度(分)肺泡炎程度(分)MMP-2(分)TIMP-1(分)MMP-2/TIMP-128C10.00±0.000.00±0.000.04±0.010.19±0.040.20±0.11M12.60±0.55a3.00±0.00a0.25±0.01a0.06±0.00a4.23±0.51aT12.17±0.752.17±0.750.17±0.020.08±0.012.20±0.5642C20.00±0.000.00±0.000.05±0.020.16±0.020.30±0.12M22.40±0.55b3.00±0.00b0.23±0.02b0.05±0.004.51±0.37bT21.80±0.84c3.00±0.00c0.18±0.02c0.07±0.012.72±0.61c

注：M1組與C1、T1組比較，aP<0.05；M2組與C2組比較，bP<0.05；M2組與T2組比較，cP<0.05。

3 討論

肺纖維化(pulmonary fibrosis，PF)是間質(zhì)性肺疾病的終末期病變，由多種原因引起，以肺泡間質(zhì)慢性炎癥、成纖維細(xì)胞異常增殖及大量細(xì)胞外基質(zhì)聚集為特征[1]。近年研究發(fā)現(xiàn)，基質(zhì)金屬蛋白酶家族(MMPs)參與了肺纖維化的發(fā)病過程。MMPs是一類高度保守的鋅離子依賴內(nèi)肽酶，能夠降解細(xì)胞基膜成分及細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)，其中MMP-2是降解ECM、肺間質(zhì)IV型膠原的主要酶類。有學(xué)者觀察到肺纖維化早期病理是以肺泡炎癥改變?yōu)橹鳎笃谥饾u發(fā)生肺纖維化，同時(shí)肺組織的TIMP-1表達(dá)升高，MMP-2/9活性下降[2]。目前，已證實(shí)MMP-2及其抑制劑TIMP-1的表達(dá)失衡在肺纖維化的發(fā)病過程起關(guān)鍵作用[3]。調(diào)節(jié)MMP-2/TIMP-1的表達(dá)失衡有望阻斷或延緩肺纖維化的發(fā)生。

間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)作為存在于骨髓、臍血等部位的多能干細(xì)胞，具有多向分化潛能，可修復(fù)組織損傷，對包括IFN-γ、TGF-β1、MMP-2及TIMP-1等因子起免疫調(diào)節(jié)作用。如吳志勇等[4]發(fā)現(xiàn)骨髓MSCs可改變心衰大鼠的心肌細(xì)胞核的NF-kB基因表達(dá)，升高M(jìn)MPs及降低TIMPs水平。本實(shí)驗(yàn)選擇臍血間充質(zhì)干細(xì)胞(CB-MSCs)對博來霉素誘導(dǎo)的肺纖維大鼠進(jìn)行干預(yù)，觀察到P組大鼠MMP-2/TIMP-1比值較正常組對照C組大鼠明顯升高，并隨時(shí)間進(jìn)展；而在給予臍血間充質(zhì)干細(xì)胞治療的大鼠比較模型組有顯著性降低 (第28 d、42 d分別為2.20±0.56vs4.23±0.51，2.72±0.61vs4.51±0.37)。由于肺纖維化形成過程中，包括TGF-β1等促炎因子激活，導(dǎo)致肺上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)和促進(jìn)膠原纖維在肺內(nèi)沉積等發(fā)生[5]，成纖維細(xì)胞在受到TGF-β1刺激后，可引起MMP-2等MMPs的基因和蛋白表達(dá)上調(diào)[6]。本實(shí)驗(yàn)證實(shí)了臍血MSCs能夠有效改善MMP-2/TIMP-1水平失衡。

實(shí)驗(yàn)中觀察到PF模型組大鼠肺泡間隔明顯增寬，伴水腫、出血，大量炎性細(xì)胞浸潤；Masson染色可見肺泡結(jié)構(gòu)紊亂，大量藍(lán)綠染色的膠原纖維沉積，并隨時(shí)間加重。臍血MSCs治療后肺泡炎程度則顯著減輕，HE、Masson染色均可見肺纖維化、肺泡間隔增寬、膠原沉積程度顯著減輕。比較各組大鼠發(fā)現(xiàn)PF大鼠肺組織肺泡炎及纖維化程度評分較正常組明顯升高，CB-MSCs治療組大鼠較模型組有顯著下降。肺組織MMP-2/TIMP-1分別與肺泡炎程度評分、肺纖維化程度評分呈顯著正相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)證實(shí)了臍血MSCs能夠有效延緩肺纖維化進(jìn)展，其機(jī)制與調(diào)節(jié)MMP-2/TIMP-1水平密切相關(guān)。

MMPs家族可通過多種途徑參與到肺纖維化的進(jìn)程。TIMP-1是MMP-2的內(nèi)源性抑制劑，可通過酶的催化結(jié)構(gòu)域，與MMP-2以1∶1的形式緊密結(jié)合，形成復(fù)合體，抑制MMP-2的活性，從而減輕MMP-2對細(xì)胞外基質(zhì)的降解作用[7]。但矛盾的是，本研究發(fā)現(xiàn)臍血間充質(zhì)干細(xì)胞并不是通過提高M(jìn)MP-2水平而改善肺纖維化進(jìn)展，相反，在MMP-2，MMP-2/TIMP-1水平下調(diào)后，MSCs治療組大鼠的肺泡炎癥、纖維化程度反而得到顯著改善。由于博來霉素誘導(dǎo)PF的早期階段，肺組織MMP-2活性增高，其后的纖維化形成過程中TIMP-1的基因表達(dá)明顯升高，導(dǎo)致MMPs/TIMPs比例失衡，促使MMPs溶解細(xì)胞外基質(zhì)能力下降，引起膠原纖維沉積。由于肺纖維化發(fā)病過程中的MMP/TIMP連續(xù)性動(dòng)態(tài)變化仍不清晰，可能導(dǎo)致各實(shí)驗(yàn)間相悖結(jié)果出現(xiàn)，仍需進(jìn)一步探討。

綜上可見，本研究證實(shí)了臍血間充質(zhì)干細(xì)胞移植可延緩肺纖維化進(jìn)展，改善MMP/TIMP失衡是MSCs延緩PF的重要機(jī)制。但肺纖維化發(fā)病過程中的MMPs/TIMPs連續(xù)性動(dòng)態(tài)變化、臨床上應(yīng)用臍血MSCs治療肺纖維化效果仍有待更深入的研究以闡明。

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