蓮子心的HPLC指紋圖譜研究*

曾建偉褚劍峰李西海蔡巧燕林珊朱曉勤陳達鑫吳錦忠#

（1福建中醫藥大學中西醫結合研究院 福州 350122；2福建省中西醫結合老年性疾病重點實驗室 福州 350122）

●中西藥苑●

蓮子心的HPLC指紋圖譜研究*

曾建偉1,2褚劍峰1,2李西海1,2蔡巧燕1,2林珊1,2朱曉勤1,2陳達鑫1,2吳錦忠1,2#

（1福建中醫藥大學中西醫結合研究院 福州 350122；2福建省中西醫結合老年性疾病重點實驗室 福州 350122）

目的：建立蓮子心的HPLC指紋圖譜，為蓮子心的品質評價提供可靠的方法。方法：采用Agilent HC C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）色譜柱，以乙腈-0.1%三乙胺溶液（10∶90）為流動相，梯度洗脫，流速為1.0 ml/min，檢測波長為284 nm，柱溫為30℃，建立蓮子心的HPLC指紋圖譜，并進行相似度評價。結果：10個產地的蓮子心在指紋圖譜的相似度上達0.90以上，說明這10個產地的蓮子心其主要化學成分基本一致。結論：該方法能較好地反映蓮子心的化學成分信息，且操作簡單，重復性好，為科學評價蓮子心品質提供了參考。

蓮子心；HPLC；指紋圖譜；相似度

蓮子心為睡蓮科植物蓮（Nelumbo Nucifera Gaertn）成熟種子的干燥幼葉及胚根，味苦性寒，具有清心安神，交通心腎，澀精止血之功效，用于熱入心包，神昏譫語，心腎不交，失眠遺精，血熱吐血等癥的治療[1]，歷版《中國藥典》均有收載。蓮子心主要含有生物堿[2]、黃酮[3]、多糖[4]等活性成分，具有降血糖[5]、抗心律失常[6]、抗腫瘤[7]和抗氧化[4，8～9]等活性。蓮子心主產于湖南、湖北、江西、福建、浙江等江南水鄉，素有湘蓮、贛蓮、建蓮等名品，除上述主產地外，全國多地均有分布。本文采用高效液相色譜法，建立了蓮子心的指紋圖譜，從化學層面考察了全國各產地蓮子心的品質差異，為科學評價蓮子心的整體品質提供了實驗依據。現報告如下：

1 儀器與材料

1.1 儀器Agilent 1200高效液相色譜儀（包括G1311A四元泵，G1329A自動進樣器，G1316A柱溫箱，G1315D二極管陣列檢測器，Chemstation工作站），MS105DU十萬分之一電子天平（梅特勒-托利多公司），AR2130千分之一電子天平（奧豪斯儀器有限公司），KQ-500DE型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司），Millipore超純水機（Millipore公司）。

1.2 材料蓮心堿、異蓮心堿、甲基蓮心堿（對照品）均購自北京捷成生物工程技術公司，乙腈、甲醇（色譜純），三乙胺、甲醇（分析純）均購自國藥集團化學試劑有限公司，超純水為實驗室自制。蓮子心樣品分別采自全國各主產地，分別編號為S1：河南南陽，S2：福建建寧，S3：湖北洪湖，S4：湖南湘潭，S5：江蘇洪澤湖，S6：江西廣昌，S7：山東微山湖，S8：浙江龍游，S9：重慶石祝，S10：安微蕪湖，均經福建中醫藥大學楊成梓教授鑒定為蓮（Nelumbo nucifera Gaertn）的干燥幼葉及胚根。

2 方法

2.1 色譜條件色譜柱：Agilent HC C18（4.6 mm× 250 mm，5 μm），流動相：乙腈-0.1%三乙胺溶液（10∶90），梯度洗脫，0～20 min：乙腈10%～50%；20～25 min：乙腈50%～80%；25～35 min：乙腈80%；流速：1.0 ml/min；檢測波長：284 nm；進樣量：10 μl；柱溫：30℃。

2.2 溶液配制

2.2.1 對照品溶液配制取蓮心堿，異蓮心堿，甲基蓮心堿適量，精密稱定，加甲醇使溶解，制成濃度分別為20、40和60 μg/ml的對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液配制取蓮子心粉末（過四號篩）約1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入25 ml 30%乙醇，稱定重量，浸泡30 min，加熱回流提取60 min，放冷，再次稱定重量，用30%乙醇補足減失的重量，過孔徑為0.45 μm微孔濾膜濾過，取續濾液，即得。

2.3 方法學考察

2.3.1 精密度試驗取同一供試品溶液，連續進樣6次，各共有峰的相對保留時間的RSD＜0.42%，相對峰面積RSD≤1.50%，相似度均大于0.98，表明該儀器的精密度良好。

2.3.2 穩定性試驗取同一供試品溶液，分別于0 h，2 h，4 h，8 h，12 h，24 h進樣檢測，各共有峰的相對峰面積RSD≤2.56%，相似度大于0.96，表明樣品溶液在24 h內基本穩定。

2.3.3 重復性試驗取同一批蓮子心藥材共6份，精密稱定，按“2.2.2”項下方法制備成供試品溶液，按“2.1”項色譜條件下進行測定，各共有峰的相對峰面積RSD≤2.81%，相似度大于0.97，表明該分析方法重現性良好。

2.4 指紋圖譜的建立與共有指紋峰的確認

2.4.1 指紋圖譜的建立取10批來自不同產地蓮子心藥材，按“2.2.2”項下方法制備成供試品溶液，按“2.1”項色譜條件下進行分析，記錄各產地蓮子心的HPLC色譜圖，導入藥典委員會頒布的《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統A版》，經系統自動匹配后，生成蓮子心的指紋圖譜。見圖1。

圖1 蓮子心HPLC指紋圖譜

2.4.2 共有峰的確定從蓮子心HPLC指紋圖譜中確定出14個共有峰，選擇保留時間適中且與相鄰色譜峰分離較好的12號色譜峰作為參照峰，計算各共有峰的保留時間和峰面積與同一圖譜中參照峰的保留時間和峰面積的比值，得到相對保留時間和相對峰面積。見表1～表2。

表1 蓮子心HPLC指紋圖譜中共有峰的相對保留時間

表2 蓮子心HPLC指紋圖譜中共有峰的相對峰面積

2.4.3 部分共有峰的鑒定為進一步闡明蓮子心的化學成分組成，采用與現有對照品比對的方法，根據保留時間和紫外光譜，初步鑒定出指紋圖譜中的12，13，14號色譜峰分別為蓮心堿、異蓮心堿和甲基蓮心堿。

2.5 相似度評價采用中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統，計算10批蓮子心藥材的HPLC指紋圖譜的相似度，以生成的共有模式為對照圖譜，計算相似度，結果表明各產地蓮子心具有良好的相似性。見表3。

表3 10批蓮子心的相似度評價結果

3 討論

我們在試驗過程中選擇了不同濃度的乙醇作為提取溶劑，采用索氏提取、超聲提取和回流提取作為提取方法，并選擇不同的提取時間，對蓮子心藥材進行提取得到了不同的樣品溶液，并進行了HPLC檢測，根據檢測結果分析了色譜峰的峰形、峰數、分離度和基線等，最終確定以30%乙醇為提取溶劑，超聲提取30 min是最佳提取條件。

將樣品溶液在全波長200～400 nm范圍內進行掃描，結果顯示，樣品3D色譜圖在284 nm處，峰數較多，峰面積較大，基線平穩。這既是蓮子心生物堿成分的最大吸收波長，也是黃酮成分的第二大吸收波長，該波長能最大限度地檢測出蓮子心的主要成分，故選擇284 nm作為檢測波長。

此外，蓮子心的主要成分為生物堿成分呈堿性，為降低拖尾現象，我們在水相中加入了0.1%的三乙胺作為掃尾劑。實驗中我們還發現，采用等度洗脫，色譜圖中間較長一段時間無峰，為節約分析時間，我們采用了梯度洗脫并優化了流動相的變化比例，使出峰均勻，峰的分離度良好。

蓮子心含有多種化學成分，藥典標準中僅測定蓮心堿一個成分的含量，已不能全面反映蓮子心的整體質量，因此建立能全面、系統地反映其化學成分的指紋圖譜，將為其品質評價和質量控制提供一個有效的參考方法。本文在優化提取方法和色譜條件的基礎上，建立了蓮子心的HPLC指紋圖譜，確定了蓮子心的14個共有峰，其中峰12、13、14分別鑒定為蓮心堿、異蓮心堿和甲基蓮心堿。相似度計算結果表明，各批樣品指紋圖譜的色譜峰整體上基本一致，相似度均在0.90以上，共有峰的相對保留時間RSD均小于0.71%，而共有峰的相對峰面積RSD卻相差很大，在63.68%～111.9%之間。由此可見，不同產地的蓮子心所含化學成分的種類雖然基本一致，但其含量差異仍然較大，提示蓮子心藥材的品質可能與產地的生長環境、采收加工等因素有關。

[1]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(一部)[M].北京:中國醫藥科技出版社,2015.273

[2]李萍,楊光明,張玉玲,等.蓮子心脂溶性生物堿的分離、鑒定[J].食品與生物技術學報,2016,35(1):19-27

[3]邵建,劉艷麗,李笑然,等.蓮子心的化學成分研究[J].中草藥,2016,47 (10):1661-1664

[4]俞遠志,吳亞林,潘遠江.蓮子心多糖的提取、分離和抗氧化活性研究[J].浙江大學學報(理學版),2008,35(1):48-51

[5]李秋哲.蓮子心黃酮結構分析及其降血糖活性研究[D].福州:福建農林大學,2015.18

[6]王瑞芳,歐來良.蓮子心提取物抗心律失常作用及其急性毒性研究[J].中草藥,2008,39(3):413-415

[7]曾建偉,謝勇,林忠寧,等.蓮子心抗腫瘤活性部位的篩選研究[J].實用中西醫結合臨床,2014,14(1):87-88

[8]楊小青,宋金春,謝順嵐,等.蓮子心中酚性與非酚性生物堿體外抗氧化活性比較[J].醫藥導報,2015,34(12):1579-1583

[9]張俊生,陳莉華,楊順清,等.超聲波輔助乙醇提取蓮子心總黃酮及其抗氧化活性的研究[J].食品工業科技,2012,33(3):220-223

Study on the HPLC Fingerprint of Nelumbinis Plumula

ZENG Jian-wei1,2,CHU Jian-feng1,2,LI Xi-hai1,2,CAI Qiao-yan1,2,LIN Shan1,2,ZHU Xiao-qin1,2,CHEN Da-xin1,2,WU Jin-zhong1,2#
(1Institute of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine,Fujian University of Traditional Chinese Medicine,Fuzhou350122; 2Key Laboratory of Integrated Traditional and Western Medicine for Senile Diseases of Fujian Province,Fuzhou350122)

Objective:To establish the HPLC fingerprint of Nelumbinis Plumula,in order to provide a reliable method for the quality evaluation of Nelumbinis Plumula.Methods:Used Agilent HC C18(4.6 mm×250 mm,5 μm)column,with acetonitrile-0.1% triethylamine solution(10∶90)as mobile phase,gradient elution,flow rate was 1 ml/min,the detection wavelength was 284 nm,the column temperature is 30℃,established the HPLC fingerprint of Nelumbinis Plumula,and evaluated the similarity.Results:The similarity of 10 batches of Nelumbinis Plumula from different regions reached more than 0.90.which shows that the main chemical components of these 10 batches of Nelumbinis Plumula from different regions were basically identical.Conclusion:This method can preferably reflect the chemical composition information of Nelumbinis Plumula,and it is simple and reproducible.It provides a reference for the scientific evaluation of the quality of Nelumbinis Plumula.

Nelumbinis Plumula;HPLC;Fingerprint;Similarity

R914

B

10.13638/j.issn.1671-4040.2017.03.100

2017-02-07）

福建中醫藥大學校管課題-科研創新平臺專項（編號：X2015022）

#通訊作者：吳錦忠，E-mail：jinzhongfj@126.com