干燥方法對(duì)白背毛木耳多糖抗氧化活性的影響

邱夢(mèng)鴿，華麗君，湯怡，尹潔，李家祺，陳義勇

（常熟理工學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，江蘇常熟215500）

干燥方法對(duì)白背毛木耳多糖抗氧化活性的影響

邱夢(mèng)鴿，華麗君，湯怡，尹潔，李家祺，陳義勇*

（常熟理工學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，江蘇常熟215500）

以白背毛木耳為原料，利用傳統(tǒng)水提法提取白背毛木耳多糖（polysaccharides from Auricularia polytricha，APPs），分別對(duì)傳統(tǒng)熱風(fēng)干燥多糖（APPs-H）、真空干燥多糖（APPs-V）和冷凍干燥多糖（APPs-F）的化學(xué)組成和抗氧化活性進(jìn)行研究。結(jié)果表明，白背毛木耳多糖為含有少量的蛋白質(zhì)的酸性多糖，不同干燥方法將會(huì)影響其單糖組成和糖醛酸含量。APPs-H，APPs-V和APPs-F具有較強(qiáng)的清除DPPH自由基、羥基自由基、超氧陰離子自由基和亞硝基自由基的能力和還原力，在一定濃度范圍內(nèi)，多糖與抗氧化活性及還原能力之間呈正相關(guān)關(guān)系，干燥方法對(duì)白背毛木耳多糖抗氧化活性造成不同影響，其中APPs-F抗氧化活性最強(qiáng)，其次是APPs-V和APPs-H，冷凍干燥是制備APPs適宜的干燥方法。

干燥方法；白背毛木耳多糖；抗氧化活性

白背毛木耳（Auricularia polytricha）屬于真菌門擔(dān)子菌綱，銀耳目黑木耳科黑木耳屬[1]。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)白背毛木耳的研究主要集中在栽培技術(shù)方面，對(duì)白背毛木耳多糖（polysaccharides from Auricularia polytricha，APPs）的研究主要集中在提取和純化[2-3]及生理活性如抗凝血、降血脂、增強(qiáng)免疫功能和抗腫瘤等作用[4]。

干燥作為多糖制備工藝過程中重要的一個(gè)環(huán)節(jié)，不同的干燥方式由于受熱條件、傳熱方式及失水速度等因素可能會(huì)改變多糖的化學(xué)結(jié)構(gòu)進(jìn)而對(duì)多糖生物活性有顯著的影響[5-6]。徐洲等[5]探討了不同干燥方法對(duì)淫羊藿多糖化學(xué)性質(zhì)和抗氧化活性的影響，程知慶等[6]研究了干燥方法對(duì)瘤背石磺多糖抗氧化性和還原力的影響，吳振等[7]研究了不同干燥方式對(duì)銀耳多糖理化特性及抗氧化活性的影響，F(xiàn)an Liuping等[8]研究了不同干燥方法對(duì)靈芝多糖抗氧化活性的影響，結(jié)果表明干燥方式對(duì)多糖的生物活性有顯著的影響。不同干燥方法對(duì)白背毛木耳多糖抗氧化活性的影響研究還鮮見報(bào)道，因此本文研究了傳統(tǒng)熱風(fēng)干燥、真空干燥和冷凍干燥這3種干燥方法對(duì)APPs的化學(xué)組成及抗氧化活性的影響，篩選出一種最適合APPs的干燥方法，旨在為APPs工業(yè)制備提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

白背毛木耳：購(gòu)于常熟市大潤(rùn)發(fā)超市；DPPH：上海楷洋生物技術(shù)有限公司；鹽酸奈己二胺、對(duì)氨基苯磺酸：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；鐵氰化鉀：上海強(qiáng)順化學(xué)試劑有限公司；無水乙醇、甲醇、丙酮、苯酚、硫酸亞鐵、水楊酸、鄰苯三酚、雙氧水、Tris-HCl、VC、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、三氯乙酸、亞硝酸鈉、溴化鉀、正丁醇、氯仿、石油醚等以上試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

HK-20B密封式粉碎機(jī)：廣州市旭朗機(jī)械設(shè)備有限公司；DHG-9030A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：上海三發(fā)科學(xué)儀器有限公司；CR22GⅡ高速冷凍離心機(jī)：日本HITACHI公司；SHB-B95循環(huán)水式多用真空泵：鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司；RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器有限公司；Alpha 1-2 LD冷凍干燥機(jī)：德國(guó)CHRIST公司；722分光光度計(jì)：上海菁華科技儀器有限公司；HH-2智能數(shù)顯恒溫水浴鍋：金壇市杰瑞爾電器有限公司；GC-14A氣相色譜儀：日本Shimadzu公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 樣品的預(yù)處理

白背毛木耳干燥粉碎后用石油醚脫脂回流，再用95%乙醇洗滌2次，以除去一些色素、單糖、低聚糖和其他一些小分子物質(zhì)，抽濾除去溶劑后，干燥得到脫脂后的白背毛木耳粉末樣品備用。

1.3.2 APPs的提取

稱取50g樣品粉末于磨口錐形瓶中，加入2000mL蒸餾水，在恒溫水浴80℃下提取4 h，將上清液離心15 min（4 000 r/min），上清液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，濃縮液采用sevage法去蛋白（6次），將濃縮液采用聚酰胺吸附柱層析法進(jìn)一步純化，用蒸餾水洗脫，得到洗脫液，洗脫液透析24 h，濃縮透析袋中液體，加入4倍體積95%乙醇，4℃過夜后離心（4000r/min），沉淀即為精制APPs。

1.3.3 APPs的干燥

采用傳統(tǒng)熱風(fēng)干燥、真空干燥和冷凍干燥分別得到傳統(tǒng)熱風(fēng)干燥多糖（Traditional hot-air drying APPs，APPs-H）、真空干燥多糖（Vacuuming drying APPs，APPs-V）和冷凍干燥多糖（Freezing drying APPs，APPs-F）。傳統(tǒng)熱風(fēng)干燥干燥條件：溫度50℃，風(fēng)速2.0 m/s，干燥時(shí)間16 h。真空干燥干燥條件：溫度50℃，真空度0.06 MPa，干燥時(shí)間12 h。冷凍干燥條件：溫度-50℃，壓力0.06 MPa，干燥時(shí)間24 h。

1.3.4 APPs化學(xué)組分分析

中性糖含量測(cè)定以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品，采用苯酚-硫酸法[9]，蛋白質(zhì)含量的測(cè)定以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)品，采用福林-酚法[10]，糖醛酸含量測(cè)定以半乳糖醛酸為標(biāo)準(zhǔn)品，采用間羥聯(lián)苯法[11]。

1.3.5 APPs單糖組成

取多糖樣品10 mg于具塞管中，加入2 mol/L的TFA溶液2 mL真空封管后于121℃水解1 h，水解液除盡過量的TFA后，真空干燥。采用糖腈乙酸酯衍生化法，加10 mg鹽酸羥胺、適量肌醇（內(nèi)標(biāo)）和0.5 mL吡啶，90℃加熱30 min后，取出冷卻至室溫，加入0.5 mL醋酸酐，90℃下繼續(xù)反應(yīng)30 min進(jìn)行乙酰化，反應(yīng)產(chǎn)物直接進(jìn)行氣相色譜分析。

色譜條件：采用OV1701彈性石英毛細(xì)管柱（Φ0.32 mm×30 m），載氣為N2，流速1.5 mL/min，F(xiàn)ID氫焰檢測(cè)器，氣化室溫度260℃，檢測(cè)器溫度250℃，采用程序升溫：起始溫度150℃，停留1 min，以10℃/min升溫至190℃，停留1 min，以3℃/min升溫至240℃，停留20 min。

1.3.6 清除DPPH自由基的測(cè)定

參照Liu Lixiang等[12]方法進(jìn)行，分別取2 mL不同質(zhì)量濃度的多糖樣品液（0.5、1.0、1.5、2.0、3.0 mg/mL），加入2 mL的0.1 mmol/L的DPPH-乙醇溶液，混勻后避光室溫放置30 min，在517 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，記為A1；以蒸餾水代替多糖樣液重復(fù)上述操作，在517 nm波長(zhǎng)處測(cè)其吸光度，記為A0；以蒸餾水代替DPPH-乙醇溶液重復(fù)以上操作，作為對(duì)照管，在517 nm波長(zhǎng)處測(cè)得吸光度，記為A2。VC作為陽(yáng)性對(duì)照，代替多糖樣品液同樣進(jìn)行測(cè)定，樣品平行測(cè)定3次并且取平均值，按下式計(jì)算DPPH的清除率：

DPPH清除率/%=[1-（A1-A2）/A0]×100

式中：A1表示加多糖樣品的吸光度；A0表示不加多糖樣品的空白組的吸光度；A2表示不加DPPH的對(duì)照組的吸光度。

1.3.7 清除羥基自由基的測(cè)定

根據(jù)Wang Hongyuan等[13]方法進(jìn)行白背毛木耳粗多糖對(duì)羥基自由基的清除作用，在此基礎(chǔ)上稍作修改。取不同濃度的多糖樣液（0.5、1.0、1.5、2.0、3.0 mg/mL）各1.0 mL，分別加入硫酸亞鐵（9.0 mmol/L）和1.0 mL水楊酸-乙醇（9.0 mmol/L），對(duì)照組以1.0 mL去離子水代替多糖樣液，最后加1.0 mL過氧化氫溶液?jiǎn)?dòng)反應(yīng)。將反應(yīng)溶液在37℃恒溫水浴30 min，在510 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，記為A1；以去離子水代替多糖樣液來重復(fù)以上操作，在510 nm波長(zhǎng)處測(cè)得吸光度，記為A0；以去離子水代替過氧化氫溶液重復(fù)上述操作，在510nm波長(zhǎng)處測(cè)其吸光度，記為A2。3種樣品分別測(cè)定，VC作為陽(yáng)性對(duì)照，代替多糖樣品液同樣進(jìn)行測(cè)定，樣品平行測(cè)定3次取平均值，按下式計(jì)算·OH的清除率：

·OH清除率/%=[1-（A1-A2）/A0]×100

式中：A1表示加多糖樣品的吸光度；A2表示不加多糖樣品的空白組的吸光度；A0表示不加過氧化氫的對(duì)照組的吸光度。

1.3.8 清除超氧陰離子自由基的測(cè)定

參照J(rèn)iang Bo等[14]方法并略有修改，取4.5 mL的Tris-Hcl緩沖液（50 mmol/L，pH8.2）在25℃恒溫水浴20 min后，加入1.0 mL不同質(zhì)量濃度的多糖樣品溶液（0.5、1.0、1.5、2.0、3.0 mg/mL）和0.4 mL鄰苯三酚溶液（25 mmol/L，25℃水浴預(yù)熱）混勻，在25℃水浴5 min，再加入1.0 mL抗壞血酸（8 mmol/L）終止反應(yīng)，迅速在420 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，記為Ai；以蒸餾水代替多糖樣液來重復(fù)以上操作，在420 nm波長(zhǎng)處測(cè)得吸光度，記為A0。VC作為陽(yáng)性對(duì)照，代替多糖樣品液同樣進(jìn)行測(cè)定，樣品分別平行測(cè)定3次取平均值，按下式計(jì)算O2-·清除率：

O2-·清除率/%=（A0-Ai）/A0×100

式中：A0表示不加多糖樣品空白組的吸光度；Ai表示加多糖樣品的吸光度。

1.3.9 清除亞硝基自由基的測(cè)定

參照文獻(xiàn)[15]略有修改，取2.0 mL的NaNO2（5mg/ L）和3.0 mL不同質(zhì)量濃度的多糖樣品溶液（0.5、1.0、1.5、2.0、3.0 mg/mL）常溫反應(yīng)30 min后，再加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%的對(duì)氨基苯磺酸溶液1.0 mL，搖勻靜置5 min后，再加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.2%鹽酸萘乙二胺0.5 mL，混合均勻靜置15 min，在538 nm波長(zhǎng)處測(cè)得吸光度，記為A1；以去離子水代替多糖樣液來重復(fù)以上操作，在538 nm波長(zhǎng)處測(cè)得吸光度，記為A0；以去離子水代替NaNO2重復(fù)以上操作，在538 nm波長(zhǎng)處測(cè)得吸光度，記為A2。VC作為陽(yáng)性對(duì)照，代替多糖樣品液進(jìn)行測(cè)定，樣品分別平行測(cè)定3次取平均值，按下式計(jì)算NO2-自由基的清除率：

NO2-自由基清除率/%=[1-（A1-A2）/A0]×100

式中：A1表示加多糖樣品的吸光度；A0表示不加多糖樣品空白組的吸光度；A2表示加多糖樣品，不加NaNO2的吸光度。

1.3.10 還原力的測(cè)定

參照Wu Huichun等[16]的方法，在具塞比色管中分別加入2 mL磷酸緩沖液（0.2 mol/L、pH6.6）、0.2 mL不同質(zhì)量濃度的APPs-H、APPs-V和APPs-F多糖樣品溶液（0.5、1.0、1.5、2.0、3.0 mg/mL）和質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的鐵氰化鉀溶液2.5 mL，混合均勻，50℃恒溫水浴20 min后，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的三氯乙酸2.5 mL終止反應(yīng)。取反應(yīng)溶液2.5 mL，加入2.5 mL蒸餾水和0.5 mL FeCl3，混合均勻靜置10 min，4 500 r/min離心10 min，在700 nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光度，VC作為陽(yáng)性對(duì)照，樣品平行測(cè)3次取平均值。

1.3.11 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 APPs化學(xué)組分

不同干燥方法得到的APPs化學(xué)組成見表1。

表1 不同干燥方法的APPs化學(xué)組成Table 1 Chemical composition of APPs dried by different methods %

從表1可以看出，3種APPs均含有中性糖、糖醛酸及少量的蛋白質(zhì)，說明3種多糖是酸性多糖，APPs-H、APPs-V和APPs-F的中性糖含量分別為89.35%、88.47%和87.26%，蛋白含量分別為1.59%、1.76%和1.65%，中性糖和蛋白含量差異不明顯。APPs-H的糖醛酸含量低于APPs-V和APPs-F，差異顯著（p< 0.05），這可能是由于APPs-H在干燥過程中氧氣及高溫對(duì)糖醛酸的破壞[17]。

2.2 APPs單糖組成

不同干燥方法得到的APPs的單糖組成見表2。

表2 不同干燥方法的APPs單糖組成Table 2 Monosaccharide composition of APPs dried by different methods %

從表2可以看出，3種APPs主要由鼠李糖、阿拉伯糖、木糖和甘露糖4種單糖組成，APPs-H、APPs-V和APPs-F單糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)比分別為：（2.43∶9.38∶1∶10.72）、（2.34∶9.67∶1∶11.06）和（2.46∶11.06∶1∶16.53）。其中APPs-H和APPs-V單糖組成差異不明顯，APPs-F單糖組成與APPs-H和APPs-V差異明顯（p<0.05），說明不同干燥方法不會(huì)影響多糖的單糖種類，但單糖的構(gòu)成比例將會(huì)發(fā)生改變，這可能與干燥過程中單糖構(gòu)象的改變有關(guān)[18]。

2.3 干燥方法對(duì)APPs抗氧化活性的影響

2.3.1 不同干燥方法對(duì)APPs清除DPPH自由基的影響

不同干燥方法對(duì)APPs清除DPPH自由基的影響結(jié)果見圖1。

圖1 不同干燥方法對(duì)APPs清除DPPH自由基的影響Fig.1 Scavenging effect of APPs dried by different methods on the DPPH radical

由圖1可知，在0.5 mg/mL～3.0 mg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，APPs對(duì)DPPH自由基的清除率隨APPs-H、APPs-V和APPs-F質(zhì)量濃度的增加而提高，與APPs質(zhì)量濃度呈正相關(guān)。在濃度為3.0 mg/mL時(shí)，APPs-H、APPs-V和APPs-F對(duì)DPPH自由基的清除率分別為44.37%、51.78%和58.35%，在相同質(zhì)量濃度條件下，APPs-F對(duì)DPPH自由基能力最強(qiáng)，APPs-V次之，APPs-H最弱。

2.3.2 不同干燥方法對(duì)APPs清除羥基自由基的影響

不同干燥方法對(duì)APPs清除羥基自由基的影響結(jié)果見圖2。

由圖2可知，在0.5 mg/mL～3.0 mg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，APPs對(duì)·OH的清除率隨APPs-H、APPs-V和APPs-F質(zhì)量濃度的增加而提高，與APPs質(zhì)量濃度呈正相關(guān)。在濃度為3.0 mg/mL時(shí)，APPs-H、APPs-V和APPs-F對(duì)·OH的清除率分別為65.73%、69.68%和75.28%，在相同質(zhì)量濃度條件下，APPs-F對(duì)·OH清除作用最強(qiáng)，其次是APPs-V和APPs-H，但都弱于VC。

圖2 不同干燥方法對(duì)APPs清除羥基自由基的影響Fig.2 Scavenging effect of APPs dried by different methods on hydroxyl free radical

2.3.3 不同干燥方法對(duì)APPs清除超氧陰離子自由基的影響

不同干燥方法對(duì)APPs清除超氧陰離子自由基的影響結(jié)果見圖3。

圖3 不同干燥方法對(duì)APPs清除超氧陰離子自由基的影響Fig.3 Scavenging effect of APPs dried by different methods on superoxid free radical

從圖3中可以看出，APPs-H、APPs-V和APPs-F對(duì)超氧陰離子自由基清除率隨APPs質(zhì)量濃度的增加而提高，與APPs質(zhì)量濃度呈正相關(guān)。在濃度為3.0 mg/mL時(shí)，APPs-H、APPs-V和APPs-F清除率依次為55.27%、57.64%、59.59%，在相同質(zhì)量濃度條件下APPs清除超氧陰離子自由基能力為：VC>APPs-F>APPs-V> APPs-H。

2.3.4 不同干燥方法對(duì)APPs清除亞硝基自由基的影響

不同干燥方法對(duì)APPs清除亞硝基自由基的影響結(jié)果見圖4。

從圖4中可知，APPs-H、APPs-V和APPs-F對(duì)亞硝基自由基的清除率隨APPs質(zhì)量濃度的增加而提高，與APPs質(zhì)量濃度呈正相關(guān)。在濃度為3.0 mg/mL時(shí)，APPs-H、APPs-V和APPs-F對(duì)亞硝基自由基的清除率依次為58.45%、60.43%和62.37%，在相同質(zhì)量濃度條件下，APPs清除超氧陰離子自由基能力為：VC＞APPs-F＞APPs-V＞APPs-H，但是APPs-H、APPs-V和APPs-F對(duì)亞硝基自由基的清除率差異不明顯。

圖4 不同干燥方法對(duì)APPs清除亞硝基自由基的影響Fig.4 Scavenging effect of APPs dried by different methods on Nitroso free radical

2.3.5 不同干燥方法對(duì)APPs還原力的影響

不同干燥方法對(duì)APPs還原力的影響結(jié)果見圖5。

圖5 不同干燥方法對(duì)APPs還原力的影響Fig.5 Effect of APPs dried by different methods on reducing power scavenging

由圖5可知，在0.5 mg/mL～3.0 mg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，還原力隨APPs-H、APPs-V和APPs-F質(zhì)量濃度的增加而增加，與APPs質(zhì)量濃度呈線性關(guān)系。在濃度為3.0 mg/mL時(shí)，APPs-E、APPs-V和APPs-F還原力分別為0.303、0.322和0.544，APPs-F還原力最強(qiáng)，其次是APPs-V和APPs-H，但都弱于VC。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)利用傳統(tǒng)水提法提取白背毛木耳多糖，分別對(duì)傳統(tǒng)熱風(fēng)干燥、真空干燥和冷凍干燥3種不同干燥方法對(duì)白背毛木耳多糖的化學(xué)組成和抗氧化活性進(jìn)行研究，結(jié)果表明，白背毛木耳多糖為含有少量的蛋白質(zhì)的酸性多糖，不同干燥方法將會(huì)影響其單糖組成和糖醛酸含量，抗氧化活性研究表明3種干燥方法得到的多糖APPs-H，APPs-V和APPs-F具有較強(qiáng)的清除DPPH自由基、羥基自由基、超氧陰離子自由基和亞硝基自由基的能力和還原力，在一定濃度范圍內(nèi)多糖與抗氧化活性及還原能力之間呈正相關(guān)關(guān)系，不同干燥方法將會(huì)對(duì)白背毛木耳多糖抗氧化活性造成不同影響，其中APPs-F抗氧化活性最強(qiáng)，其次是APPs-V和APPs-H，因此冷凍干燥方法是制備APPs適宜的干燥方法。

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Effect of Drying Methods on Antioxidant Activities of Polysaccharides from Auricularia polytricha

QIU Meng-ge，HUA Li-jun，TANG Yi，YIN Jie，LI Jia-qi，CHEN Yi-yong*
（School of Biology and Food Engineering，Changshu Institute of Technology，Changshu 215500，Jiangsu，China）

Auricularia polytricha was used as raw materials.Polysaccharides from Auricularia polytricha（APPs）were extracted using conventional water extraction.APPs-H，APPs-V and APPs-F were obtained with traditional hot-air drying，vacuum drying and freeze drying，respectively.Chemical composition and antioxidant activities of APPs-H，APPs-V and APPs-F were investigated.The results showed that APPs were acidic polysaccharides containing a small amount of protein.Different drying methods could affect the monosaccharide composition and uronic acid content.APPs-H，APPs-V and APPs-F had a stronger scavenging ability of DPPH radical，hydroxyl radical，superoxide anion free radical and nitroso free radical and reducing power.In a certain concentration range，APPs were positively correlated with the antioxidant activity and reducing capacity.Drying methods had different effects on the antioxidant activity of APPs.APPs-F had highest antioxidant activities，followed by APPs-V and APPs-H.Freeze drying was the best drying method for preparation of APPs.

drying methods；polysaccharidesfrom Auricularia polytricha；antioxidant activity

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.12.006

2016-05-30

常熟理工學(xué)院2015屆本科畢業(yè)設(shè)計(jì)(論文)重點(diǎn)資助團(tuán)隊(duì)課題

邱夢(mèng)鴿（1989—），女（漢），本科，研究方向：食品科學(xué)。

*通信作者：陳義勇（1974—），男（漢），副教授，博士，研究方向：食品科學(xué)與天然活性成分。