南美白對蝦的冷藏特性及生物保鮮劑對腐敗菌的抑制作用

吳佩君,唐樹平,彭名軍,馬廣智,汪光華,楊 喆,王靜輝,黃儒強,*

(1.華南師范大學生命科學學院,廣東廣州510631;2.上海玖旭化妝品有限公司,上海201613;3.廣州市食品檢驗所,廣東廣州510410)

?

南美白對蝦的冷藏特性及生物保鮮劑對腐敗菌的抑制作用

吳佩君1,唐樹平2,彭名軍3,馬廣智1,汪光華1,楊 喆1,王靜輝1,黃儒強1,*

(1.華南師范大學生命科學學院,廣東廣州510631;2.上海玖旭化妝品有限公司,上海201613;3.廣州市食品檢驗所,廣東廣州510410)

以感官評價、pH、菌落總數和揮發性鹽基氮為測定指標,探究冷藏南美白對蝦的貨架期。為了提高南美白對蝦冷藏期間的品質,用濾紙片法探究山棯子黃酮提取物、茶多酚、溶菌酶和Nisin對南美白對蝦腐敗菌的抑制效果,并用二倍稀釋法測定最小抑菌濃度(MIC)。實驗結果表明,在4 ℃條件下,整蝦貨架期為3 d;茶多酚對惡臭假單胞菌、腐敗希瓦氏菌、藤黃微球菌、魯氏不動桿菌和嗜水氣單胞菌有抑制作用,MIC分別為0.12、016、0.06、0.18和0.14 g·100 mL-1;山棯子黃酮提取物可以抑制惡臭假單胞菌、腐敗希瓦氏菌、藤黃微球菌、蠟樣芽胞桿菌和魯氏不動桿菌,MIC分別0.40、0.50、0.20、0.90和0.40 g·100 mL-1。溶菌酶對蠟樣芽胞桿菌、哥倫比亞腸球菌和藤黃微球菌有抑制作用,MIC分別為0.18、0.04和0.02 g·100 mL-1,Nisin可以抑制魯氏不動桿菌、哥倫比亞腸球菌和藤黃微球菌,MIC分別為0.20、0.05和0.04 g·100 mL-1。綜合來說,山棯子黃酮提取物和茶多酚可以抑制部分的革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌,而溶菌酶和Nisinz主要抑制革蘭氏陽性菌。

南美白對蝦,山棯子黃酮提取物,茶多酚,乳酸鏈球菌素,溶菌酶,抑菌

南美白對蝦,學名凡納濱對蝦,殼薄體肥,肉質細嫩,蛋白質含量高,脂肪和碳水化合含量都極低,且富含微量元素,是膳食的理想食材[1]。南美白對蝦在捕撈、加工和銷售等環節中很容易受微生物侵染而腐敗變質,并且蝦頭富含多酚氧化酶,加速氧化分解反應,導致蝦體變軟變黑,降低了南美白對蝦的營養價值[2]。

表1 南美白對蝦感官評分標準Table 1 Grading standard of Penaeus Vannamei sensory assessment

目前應用于南美白對蝦保鮮的生物保鮮劑有茶多酚、溶菌酶、殼聚糖、乳酸鏈球菌和抗壞血酸等。茶多酚是一類多酚化合物,包括黃烷醇類、黃色苷類、黃酮類、黃酮醇類和酚酸類。近年來的研究表明茶多酚具有抗氧化、清除自由基和抑制微生物生長等多種生理活性[3]。溶菌酶因其溶解細菌細胞壁而得名,其作用機理是切斷N-乙酰壁酸和乙酰葡萄糖胺之間的β-1,4糖苷鍵,但是單獨溶菌酶的防腐保鮮作用有一定的的局限性,主要表現在其特異性高,只能分解芽孢細菌的活細胞,而不能分解芽孢;只對革蘭氏陽性菌有較強的抑制作用,對革蘭氏陰性菌幾乎不起作用[4]。乳酸鏈球菌,縮寫為Nisin,能有效殺死或者抑制引起食品腐敗的革蘭氏陽性菌,對產生孢子的細菌,如芽孢桿菌也有較強的抑制作用[5],但是在貯藏過程中,pH、溫度等因素的改變也會影響Nisin的活性。

近年來,關于植物提取物的抑菌性研究報道越來越多,本實驗室一直在研究山棯子黃酮提取物的抗氧化性、抗腫瘤性、降血脂等功能[6],但尚未涉及抑菌性研究,并且國內外關于山棯子黃酮提取物的抑菌性報道甚少,因此,本研究旨在比較通過比較山棯子黃酮提取物、茶多酚、溶菌酶和Nsin對南美白對蝦腐敗菌的抑制效果,為今后的復配保鮮劑提供一定的實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

南美白對蝦 購自廣州市番禺區海鷗島養殖技術研發基地;乳酸鏈球菌素(Nisin)(1200 U/g) 浙江銀象生物技術有限公司;茶多酚(多酚≥98%) 成都艾科達化學試劑有限公司;溶菌酶(20000 U/mg) 美國Amresco公司;山棯子 市售;腐敗希瓦氏菌、蠟樣芽胞桿菌、魯氏不動桿菌、藤黃微球菌、惡臭假單胞菌、嗜水氣單胞菌、哥倫比亞腸球菌 均由華南師范大學生命科學學院325實驗室篩選并保藏;營養肉湯、瓊脂 廣東環凱微生物科技有限公司;其它化學試劑 均為分析純。

YXQ-LS-50SII立式壓力蒸汽滅菌鍋 上海博迅實業有限公司;ZHJH-1109B超凈工作臺 上海智城分析儀器制造有限公司;SP-02Y生化培養箱 黃石市恒豐醫療器械有限公司;PHS-3SpH計 上海大普儀器有限公司;K9840全自動凱氏定氮儀 濟南海能儀器股份有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品處理 南美白對蝦采樣后加氧保活運到實驗室,挑選鮮活、完整、色澤鮮亮、大小均一的個體,加冰猝死,流水洗凈。隨機分為8組,每組10頭,置于保鮮盒中于4 ℃冷藏,每天取一組樣品測定相關指標[7]。

1.2.2 山棯子黃酮類提取物的制備 取2000 g山棯子干燥粉碎,經70%乙醇浸提過濾濃縮后,上樣于AB8大孔樹脂,60%乙醇洗脫,旋轉蒸發濃縮至膏狀,真空干燥,稱重定量,最終質量為100 g[8]。

1.2.3 南美白對蝦貯藏特性

1.2.3.1 感官評定 由5名具有感官評定經驗人員組成評定小組,按照表1對整蝦的氣味、外觀和肉質3個方面進行評分,此表參照Reilly[9]加以調整,總分值在9分(極鮮)和0分(完全腐敗)之間,6分以下表明樣品已不可食用。

1.2.3.2 pH測定 稱取2.00 g蝦肉,用無菌研缽研磨,并置于試管中,加入18 mL滅菌蒸餾水,攪拌均勻靜置10 min,過濾后用精密酸度計測定其pH。

1.2.3.3 菌落總數測定 根據食品安全國家標準GB 4789.2-2010[10]中食品微生物學檢驗菌落總數的測定方法測定,平行3次。

1.2.3.4 TVB-N含量測定 根據中國人民共和國水產行業標準SC/T 3032-2007[11]中水產品中揮發性鹽基氮的測定方法測定。

1.2.4 山棯子黃酮提取物、茶多酚、Nisin和溶菌酶的抑菌效果測定 用濾紙片法探究Nisin、溶菌酶、山棯子黃酮提取物和茶多酚對冷藏南美白對蝦腐敗菌的抑菌效果。Nisin用pH為2～3檸檬酸配制出1 g/100 mL的母液,山棯子黃酮提取物、溶菌酶和茶多酚用蒸餾水分別配制成5、0.5、2 g/100 mL母液,用二倍稀釋法探究其最小抑菌濃度(MIC)[12],以有抑菌圈形成的保鮮劑濃度作為依據,稀釋成連續的5個濃度梯度,接入用生理鹽水稀釋而成的細菌濃度約為 5×105CFU/m L的菌懸液1 mL,120 r/min、30 ℃條件下振蕩培養12 h,期間每隔2 h在600 nm波長處測定一次光密度值,每次均以無菌培養基為標準調零,觀察光密度的變化,以OD值不變的最小濃度為該保鮮劑對該腐敗菌的最小抑菌濃度。

1.3 數據處理

實驗數據采用3次平行實驗的平均值,數據間的差異性使用SPSS 19.0中的Duncan法進行方差分析和多重比較。結果采用平均值±標準偏差表示,數據曲線利用Origin Pro V8.5軟件繪制。

2 結果與分析

2.1 南美白對蝦貯藏特性的變化

2.1.1 感官評定 由圖1可看出,隨著貯藏時間的延長,整蝦呈現出下降趨勢。初始評分值為9分,蝦體具有光澤,體節連接緊密,肌肉結實,有海蝦固有的氣味,冷藏1 d后,幾乎沒什么變化,但第4 d時,整蝦的感官評分只有5.30分,蝦頭黑變嚴重,有異味,肉殼易分離,已腐敗不能食用。貯藏期間,蝦體內的微生物分解含氮及含硫大分子而產生揮發性鹽基氮、三甲胺、硫化氫等腥臭物質,蝦頭的多酚氧化酶催化黑色素生成,使整蝦變黑,影響整蝦的外觀[13]。

圖1 南美白對蝦貯藏期間感官評分的變化Fig.1 Changes in sensory score of Penaeus Vannamei during refrigerated storage

2.1.2 pH測定 由圖2可知,在0 d時,整蝦的pH為7.12,冷藏1 d后,體內的糖原被降解,pH有所下降,但隨后蝦體內的蛋白質等物質被微生物分解成氨類物質,pH逐漸升高。

圖2 南美白對蝦貯藏期間pH變化Fig.2 Changes in pH of Penaeus Vannamei during refrigerated storage

2.1.3 菌落總數測定 整蝦菌落總數變化如圖3所示,呈現先下降后上升的趨勢,這是因為在冷藏期間,一些不耐寒細菌,繁殖較慢或者死亡,導致細菌總數下降,隨后微生物開始大量繁殖,菌落總數逐漸上升。冷藏初期(0～2 d),菌落總數(cfu/g)≤105為一級鮮度,第3 d,菌落總數為5.28304 lg cfu/g,仍處于貨架期,第4 d,菌落總數為6.36837 lg cfu/g≥106腐敗已不能食用[14]。

圖3 南美白對蝦貯藏期間菌落總數的變化Fig.3 Changes in bacteria amount of Penaeus Vannamei during refrigerated storage

2.1.4 TVB-N測定 由圖4可知,隨著冷藏天數的增加,TVB-N逐漸增大,在第4 d時整蝦的TVB-N為34.88 mg/100 g,不在可接受范圍之內。TVB-N是蛋白質在微生物和酶的作用下降解而產生的氨和胺類等堿性含氮物質的總稱,是判斷水產品腐敗的指標之一。根據SC/T 3032-2007[11]規定,TVB-N(mg/100 g)≤25 處于一級鮮,TVB-N(mg/100 g)≤30在可接受范圍之內。綜合感官評定、pH、菌落總數和TVB-N這4個指標分析,南美白對蝦的貨架期為3 d。

圖4 南美白對蝦貯藏期間TVB-N的變化Fig.4 Changes in TVB-N of Penaeus Vannamei during refrigerated storage

2.2 山棯子黃酮提取物、茶多酚、Nisin和溶菌酶的抑菌效果

由表2～表6可知,山棯子黃酮提取物、茶多酚、溶菌酶和Nisin對惡臭假單胞菌、嗜水氣單胞菌、魯氏不動桿菌、腐敗希瓦氏菌、蠟樣芽胞桿菌、哥倫比亞腸球菌和藤黃微球菌有一定的抑制作用。溶菌酶對蠟樣芽胞桿菌、哥倫比亞腸球菌和藤黃微球菌有抑制作用,MIC分別為0.18、0.04和0.02 g·100 mL-1,Nisin可以抑制魯氏不動桿菌、哥倫比亞腸球菌和藤黃微球菌,MIC分別為0.20、0.05和0.04 g·100 mL-1。據研究,Nisin通過與G+的細胞膜結合,插入、孔道形成等多步過程形成孔道復合物,從而引起細胞液的滲漏[15]。溶菌酶對革蘭氏陰性菌幾乎沒無抑制作用,一是因為肽聚糖對溶菌酶很敏感,而G-的細胞壁主要成分不是肽聚糖,并且位于內層,不能與溶菌酶很快地直接接觸。二是因為G-細菌特殊的細胞壁外層結構——脂質雙層,具有屏障作用,能阻止多種物質透過[16]。茶多酚對惡臭假單胞菌、腐敗希瓦氏菌、藤黃微球菌、魯氏不動桿菌和嗜水氣單胞菌的MIC分別為0.12、016、0.06、0.18和0.14 g·100 mL-1;山棯子黃酮提取物對惡臭假單胞菌、腐敗希瓦氏菌、藤黃微球菌、蠟樣芽胞桿菌和魯氏不動桿菌的MIC分別0.40、0.50、0.20、0.90和0.40 g·100 mL-1。茶多酚是兒茶素、黃酮和花色苷等一類物質的總稱,關于茶多酚抑菌機理的相關報道較少,孫京新等人認為茶多酚處理假單胞菌能夠逐步破壞其細胞壁的完整性,使得堿性磷酸酶滲出,繼而破壞細胞膜的完整性[17],而山棯子黃酮類提取物,其分子結構上有較多的酚羥基,這些官能團與蛋白質或酶通過氫鍵方式結合,導致細胞質的固縮和解體[18]。

表2 山棯子黃酮提取物對腐敗菌的抑菌圈直徑(mm)Table 2 The inhibition zone of flavonoids extracts of Fructus rhdomyrti to spoilage bacteria(mm)

注:“-”表示無抑制效果;表3～表6同。

表3 茶多酚對腐敗菌的抑菌圈直徑(mm)Table 3 The inhibition zone of tea polyphenols to spoilage bacteria(mm)

表4 Nisin對腐敗菌的抑菌圈直徑(mm)Table 4 The inhibition zone of Nisin to spoilage bacteria(mm)

表5 溶菌酶對腐敗菌的抑菌圈直徑(mm)Table 5 The inhibition zone of lysozyme to spoilage bacteria(mm)

表6 生物保鮮劑對腐敗菌的最小抑菌濃度(g·100 mL-1)Table 6 The MIC of biological preservative to spoilage bacteria(g·100 mL-1)

3 結論

通過實驗探究,在4 ℃條件下,南美白對蝦的貨架期為3 d,這與徐麗敏[19]的研究結果相近,貨架期的長短與對蝦生活的環境有密切的聯系,初始菌落數目及細菌種類等因素都會影響對蝦的品質。茶多酚對惡臭假單胞菌、腐敗希瓦氏菌、藤黃微球菌、魯氏不動桿菌和嗜水氣單胞菌有抑制作用,MIC分別為0.12、016、0.06、0.18和0.14 g·100 mL-1;山棯子黃酮提取物可以抑制惡臭假單胞菌、腐敗希瓦氏菌、藤黃微球菌、蠟樣芽胞桿菌和魯氏不動桿菌,MIC分別0.40、0.50、0.20、0.90和0.40 g·100 mL-1。溶菌酶對蠟樣芽胞桿菌、哥倫比亞腸球菌和藤黃微球菌有抑制作用,MIC分別為0.18、0.04和0.02 g·100 mL-1,Nisin可以抑制魯氏不動桿菌、哥倫比亞腸球菌和藤黃微球菌,MIC分別為0.20、0.05和0.04 g·100 mL-1。綜合來說,Nisin和溶菌酶對革蘭氏陰性菌幾乎無抑制作用,但對革蘭氏陽性菌有很好的抑制效果;山棯子黃酮提取和茶多酚的抑菌譜相似,都能抑制部分的革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌,且抑菌效果較好。山棯子作為中國比較常見的植物,抗逆性強,價格低廉,易栽培,易分離提純,將其發展為一種天然的抑菌劑和保鮮劑具有實際應用價值。

[1]潘英,王如才,羅永巨,等. 海水和淡水養殖南美白對蝦肌肉營養成分的分析比較[J]. 青島海洋大學學報:自然科學版,2001,31(6):828-834.

[2]Nurhayati T,Ambarsari L,Suhandana M. Partial purification of polyphenoloxidase of black tiger shrimp(Penaeusmonodon)from Indonesian waters.[J]. International Food Research Journal,2015,22(6):2267-2273

[3]Mukhtar H. Tea polyphenols for health promotion[J]. Life Sciences,2007,81(7):519-533.

[4]Jollès P. Lysozymes:a chapter of molecular biology[J]. Angewandte Chemie,1969,8(4):227.

[5]Shirazinejad A R,Noryati I,Rosma A,et al. Inhibitory effect of lactic acid and nisin on bacterial spoilage of chilled shrimp[J]. World Academy of Science Engineering & Technology,2010(65):163.

[6]黃儒強,鄧衛文,伍靜蓮,等. 山稔子中總黃酮含量的測定及其黃酮種類的鑒別[J]. 食品科學,2006,27(10):455-458.

[7]田鳳. 冷藏南美白對蝦生物防腐保鮮技術的研究[D]. 湛江：廣東海洋大學,2013.

[8]黃儒強,李娘輝,黃科禮,等. 山稔子黃酮類提取物抗自由基作用及體內抗氧化功能的研究[J]. 食品科學,2008,29(9):588-590.

[9]Reilly A,Bernarte M A,Dangla E.Storage stability of brackishwater prawns during processing for export[J].Food Technology in Australia,1984,36(6):283-286.

[10]王曉紅,姜嫻. 食品中菌落總數檢測結果的不確定度評定[J]. 中國衛生檢驗雜志,2011(11):2799-2800.

[11]葛曉鳴,任飛,楊娟芬. 全自動凱氏定氮儀測定金槍魚肉中揮發性鹽基氮含量[J]. 化學分析計量,2008,17(4):78-79.

[12]宋丹. 丹皮酚體外抑菌作用研究[J]. 醫藥導報,2012,31(9):1135-1137.

[13]熊青,謝晶,高志立,等. 不同生物保鮮劑對冷藏南美白對蝦的保鮮效果[J]. 食品工業科技,2014,35(1):270-274.

[14]過世東,王四維. 蝦類產品鮮度評價方法研究進展[J]. 食品研究與開發,2006,27(2):161-163.

[15]李增利. Nisin抗菌作用機制及抑菌效力[J]. 食品科技,2004(10):59-62.

[16]劉益麗,鄧霄禹,江明鋒. 溶菌酶抑菌活性及檢測方法研究進展[J]. 中國畜牧獸醫,2013,40(8):189-194.

[17]孫京新,王文娟. 茶多酚對假單胞菌抑菌機理研究[J]. 肉類研究,2009(10):48-51.

[18]黃曉冬,劉劍秋. 赤楠葉精油的化學成分及其抗菌活性[J]. 熱帶亞熱帶植物學報,2004,12(3):233-236.

[19]徐麗敏. 南美白對蝦與鷹爪蝦的保鮮及防黑變初步研究[D]. 青島:中國海洋大學,2008.

Refrigerated characteristics ofPenaeusVannameiand effects of biological preservatives against the spoilage bacteria

WU Pei-jun1,TANG Shu-ping2,PENG Ming-jun3,MA Guang-zhi1, WANG Guang-hua1,YANG Zhe1,WANG Jing-hui1,HUANG Ru-qiang1,*

(1.College of Life Science,South China Normal University,Guangzhou 510631,China; 2.Shanghai Joies Cosmetics Co.,Ltd.,Shanghai 201613,China; 3.Guangzhou Institute for Food Control,Guangzhou 510410,China)

In order to evaluate the shelf life ofPenaeusVannamei,sensory evaluation,pH,total bacteria count(TVC)and total volatile basic nitrogen(TVB-N)were determined. Using the method of paper disc to determine the antibacterial activity of Fructus rhdomyrti, tea polyphenols,lysozyme and Nisin to the spoilage bacteria ofPenaeusVannamei. Then fold dilution method was used to determine different preservative’s MIC of different spoilage bacteria. Results showed that the self life of shrimp was 3 d under 4 ℃. Tea polyphenols can inhibitPseudomonasputida,Shewanellaputrefaciens,Micrococcusluteus,AcinetobacterlwoffiiandAeromonashydrophilia. The MIC of tea polyphenols to these spoilage bacteria were 0.12,016,0.06,0.18 and 0.14 g·100 mL-1. flavonoids extracts ofFructusrhdomyrtican inhibitPseudomonasputida,Shewanellaputrefaciens,Micrococcusluteus,BacilluscereusandAcinetobacterlwoffii. The MIC of Fructus rhdomyrti to these spoilage bacteria were 0.40,0.50,0.20,0.90 and 0.40 g·100 mL-1. The MIC of lysozyme toBacilluscereus,ColumbiaenterococcusandMicrococcusluteuswere 0.18,0.04 and 0.02 g·100 mL-1. The MIC of Nisin toAcinetobacterlwoffii,ColumbiaenterococcusandMicrococcusluteuswere 0.20,0.05 and 0.04 g·100 mL-1. To summarize,tea polyphenol and flavonoids extracts of Fructus rhdomyrti can inhibit part of G+and G-when Nisin and lysozyme mainly inhibit the G+.

PenaeusVannamei;flavonoids extracts ofFructusrhdomyrti;tea polyphenol;Nisin;lysozyme;antibacterial

2016-11-28

吳佩君(1991-)，女，碩士研究生，研究方向：微生物與生化藥學，E-mail：1264414436@qq.com。

*通訊作者:黃儒強(1968-)，男，博士，教授級高級工程師，研究方向：食品生物技術、微生物與生化藥學，E-mail：qiangdoctor@126.com。

廣州市產學研協同創新重大專項(201604020068)。

TS254.4

A

1002-0306(2017)10-0341-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.10.057