黑糯玉米芯花色苷提取工藝優化及抗氧化活性研究

孫夢洋,張 燦,陳亞淑,謝筆鈞,孫智達

(華中農業大學食品科技學院,湖北武漢 430070)

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黑糯玉米芯花色苷提取工藝優化及抗氧化活性研究

孫夢洋,張 燦,陳亞淑,謝筆鈞,孫智達*

(華中農業大學食品科技學院,湖北武漢 430070)

以黑糯玉米芯為實驗對象,以花色苷提取液的吸光值作為提取效果指標,采用響應面法優化了黑糯玉米芯中花色苷的提取工藝條件。在單因素實驗的基礎上,采用響應面分析法中的Box-Behnken 模式進行三因素三水平的實驗設計,結果表明:當乙醇濃度62%,液料比24∶1 (mL/g),提取溫度47 ℃,提取時間為120 min,pH為2時,黑糯玉米芯花色苷提取效果最好;在該條件下,采用pH示差法測得到黑糯玉米芯中花色苷含量為57.29 mg/g。通過高效液相色譜-二極管陣列-電噴霧-串聯質譜法鑒定了黑糯玉米芯中花色苷的組成,主要為三種花色苷:矢車菊素-3-葡萄糖苷、天葵色素-3-葡萄糖苷、芍藥色素-3-葡萄糖苷。抗氧化活性實驗表明:黑糯玉米芯花色苷提取物具有一定的清除DPPH自由基和ABTS自由基的能力,同時也顯示了較強的還原能力和鐵還原力。

響應面法,黑糯玉米芯,花色苷,抗氧化性

黑糯玉米是一種保健果蔬玉米,口感黏糯,外觀烏黑發亮。黑糯玉米籽粒富含水溶性黑色素及人體必需的各種微量元素和氨基酸,營養成分含量明顯高于其他谷類作物,黑糯玉米芯中還富含較多的花色苷[1]。花色苷(Anthocyanin)是一類天然水溶性天然色素,廣泛存在于植物根、莖、葉、花、穗、果實等器官細胞液中,是一類由花色素苷配基與糖通過糖苷鍵結合而成的類黃酮化合物[2]。研究結果表明:花色苷天然安全無毒,資源豐富,且具有清除體內自由基、抗炎、抗氧化、抑制脂質過氧化和預防糖尿病、保護視力、減少低密度脂蛋白和抑制血小板聚集等保健功能,現已被廣泛應用于食品、保健品、化妝品、醫藥等行業中[3]。

我國的黑糯玉米資源十分豐富,每年生產加工過程中會產生大量的黑糯玉米芯廢棄物。如能對其進行有效的開發利用,不僅可以避免資源浪費,也能增加天然食品色素的種類,促進食品工業的發展[4]。本研究先通過單因素實驗確定乙醇濃度、提取溫度和料液比三個因素,然后進行中心組合設計,利用響應面法優化黑糯玉米芯花色苷的最佳提取工藝參數[5],同時采用HPLC-ESI-MS技術對花色苷進行鑒定,并利用多種體系對提取物的抗氧化活性進行了研究,為深入開發利用黑糯玉米芯提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

黑糯玉米 由安徽淮北師范大學提供;AB-8大孔樹脂 購于南開大學化工廠;乙酸、乙腈 均為色譜純;無水乙醇、鹽酸、醋酸鈉、氯化鉀、抗壞血酸、DPPH(1,1-二苯基-2-三硝基苯肼)、鐵氰化鉀、三氯乙酸、三氯化鐵、過硫酸鉀、ABTS(2,2-聯氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽)、磷酸氫二鈉、磷酸二氫、TPTZ(2,4,6-三(2-吡啶基)三嗪) 均為分析純。

ZK-82B型真空干燥箱 德國CHRIST公司;恒溫水浴鍋 北京長安科學儀器廠;分析天平 上海倫捷公司;818型pH計 瑞士 Mettler-Toledo FE20;RE-111旋轉蒸發儀 瑞士Buchi公司;JP-100A-02型高速多功能破碎機 上海久品工貿有限公司;UV-2100型紫外可見分光光度計 上海尤尼柯儀器有限公司;2695型高效液相色譜儀 美國Waters公司;帶自動進樣器的高效液相色譜與質譜聯用儀 美國Agilent公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 工藝流程 黑糯玉米芯→干燥→粉碎→溶劑浸提→離心、抽濾→減壓蒸餾濃縮→大孔樹脂純化→冷凍干燥→花色苷提取物

1.2.2 操作要點 干燥粉碎:將黑糯玉米人工剝粒,取芯放入烘干箱中,干燥至恒重后放入高速多功能破碎機中破碎,過80目篩,密封放置備用。

浸提:稱取一定量粉碎后的黑糯玉米芯粉,按要求加入適量的酸性乙醇提取劑,在一定的條件下進行浸提,浸提結束后進行離心并抽濾,將濾渣與濾液分離。

濃縮:將所得的濾液放在旋轉蒸發器中進行濃縮,濃縮至原液1/10時結束,用AB-8大孔樹脂進行純化,然后將濃縮液-20 ℃冷凍。

冷凍干燥:將冷凍的濃縮液進行冷凍干燥,干燥至恒重后,冷凍密封儲存。

用紫外可分光光度計在520 nm[6]處測黑糯玉米芯花色苷提取物水溶液吸光值[7]。以各影響因素為橫坐標,吸光值為縱坐標,用軟件繪制標準曲線,得到黑糯玉米芯花色苷的提取效果曲線圖[8]。

1.2.3 黑糯玉米芯花色苷提取工藝單因素實驗

1.2.3.1 乙醇濃度對黑糯玉米花色苷提取效果的影響 稱取黑糯玉米芯粉10 g,在液料比為20∶1 (mL/g),提取溫度 50 ℃,pH為2,提取90 min條件下,研究乙醇濃度為20%、40%、60%、80%、100%時對黑糯玉米芯花色苷提取效果的影響。

1.2.3.2 提取時間對黑糯玉米花色苷提取效果的影響 稱取黑糯玉米芯粉10 g,在液料比 20∶1 (mL/g),乙醇濃度60%,提取溫度50 ℃,pH為2的條件下,研究提取時間分別為30、60、90、120、150 min時對黑糯玉米花色苷提取效果的影響。

1.2.3.3 提取溫度對黑糯玉米花色苷提取效果的影響 稱取黑糯玉米芯粉10 g,在液料比 20∶1 (mL/g),乙醇濃度60%,提取時間120 min,pH為2條件下,研究提取溫度分別為30、40、50、60、70 ℃時對黑糯玉米花色苷提取效果的影響。

1.2.3.4 pH對黑糯玉米花色苷提取效果的影響 稱取黑糯玉米芯粉10 g,在液料比 20∶1 (mL/g),乙醇濃度60%,提取時間120 min,提取溫度50 ℃條件下,研究pH分別為1、2、3、4、5時對黑糯玉米花色苷提取效果的影響。

1.2.3.5 液料比對黑糯玉米花色苷提取效果的影響 稱取黑糯玉米芯粉10 g,在乙醇濃度60%,提取時間120 min,pH為2,提取溫度50 ℃條件下,研究液料比分別為10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1 (mL/g)時對黑糯玉米花色苷提取效果的影響。

1.2.4 黑糯玉米芯花色苷提取的響應面實驗 根據單因素實驗結果得出,當提取液的pH為2,提取時間在120 min時對花色苷提取影響非常小。結合上述單因素實驗結果,以乙醇濃度、提取溫度、料液比三個影響因素為自變量,以吸光值為響應值,采用Design-Expert 8.0.6軟件中Box-Behnken模式設計三因素三水平的響應面分析方法[9],因素水平見表1。

表1 響應面實驗因素水平表Table 1 Factors and levels table of response surface methodology

1.2.5 花色苷含量的測定 采用pH示差法[10],取1 mg/mL的樣品溶液1 mL,分別用pH1.0(0.2 mol/L KCl∶0.2 mol/L HCl=25∶67,v/v)和pH4.5(0.2 mol/L NaAc∶0.2 mol/L HAc=45∶50,v/v)的緩沖溶液稀釋至5 mL,40 ℃下靜置平衡0.5 h,用等量溶劑加相應緩沖溶液為空白對照,分別在520 nm和700 nm波長下測定吸光值,總花色苷含量以矢車菊色素-3-葡萄糖苷計,計算公式如下:

花色苷含量(mg/L)=A×MW×DF×1000/(ε×1)

A=(A520-A700)pH1.0-(A520-A700)pH4.5

式中,ε:矢車菊-3-葡萄糖苷消化系數,26900 L·(cm·mg)-1;DF:稀釋因子;MW:矢車菊-3-葡萄糖苷相對分子質量,449.2。

1.2.6 HPLC-MS法鑒定黑糯玉米芯中花色苷組成 取純化后的黑糯玉米芯花色苷提取物配成1 mg/mL的溶液,過0.22 μm水相濾膜后備用。

Waters2695型高效液相色譜儀,檢測器為二極管陣列檢測器(Diode Array Detector,DAD),波長:520 nm。

黑糯玉米芯花色苷檢測條件[11]:流動相A:體積分數5%的乙酸溶液;流動相B:乙腈;分離柱:C18(4.6 mm×150 mm,5 μm)。流速為1 mL/min,進樣量20 μL,溫度25 ℃。梯度洗脫程序:0～25 min,12%～30% B;25～34 min,30%～100% B;34～40 min,100%～12% B。

質譜條件:電噴霧電離離子源(Electrospray Ionization,ESI),正離子掃描模式,霧化氣壓力40 psi,干燥氣溫度325 ℃,干燥器流量10 L/min,毛細管電壓3500 V,離子掃描范圍100～2000(m/z)。

1.2.7 DPPH自由基的清除能力的測定 取不同質量濃度的樣品溶液2 mL和2×10-4mol/L的DPPH自由基乙醇溶液2 mL,加入同一具塞試管后搖勻,在室溫條件下避光反應0.5 h,于517 nm波長條件下測其吸光值,空白組用等體積無水乙醇代替DPPH自由基溶液,對照組用等體積蒸餾水代替樣品溶液,計算黑糯玉米芯花色苷提取物對DPPH自由基的清除率。以VC作為陽性對照,操作方法同上[12]。

式中:A0為對照組吸光值;Ai為樣品組吸光值;Aj為空白組吸光值。

1.2.8 ABTS自由基的清除能力的測定 取7 mmol/L ABTS水溶液和2.45 mmol/L-過硫酸鉀水溶液各取5 mL混合,置于暗處反應12 h,產生ABTS+·,用水將ABTS+·溶液稀釋使其在734 nm波長條件下的吸光值為0.70±0.02。將1 mL不同質量濃度的黑糯玉米芯花色苷溶液加到2 mL ABTS+·溶液中混合均勻,10 min后測其在734 nm處的吸光值,記作A1;測2 mL ABTS+·溶液與1 mL溶劑混合后在734 nm處的吸光值,記作A0;2 mL蒸餾水與1 mL樣品溶液在734 nm處的吸光值記作A2。以VC作為陽性對照,操作方法同上[13]。

1.2.9 總還原力的測定 取不同質量濃度的樣液1 mL于試管中,按次序加入0.2 mol/L磷酸鹽緩沖液(PBS,pH6.6)2.5 mL和1%六氰合鐵酸鉀溶液2.5 mL,在50 ℃條件下水浴保溫20 min后快速冷卻,加入10%三氯乙酸溶液2.5 mL,以3000 r/min離心10 min,取上清液2.5 mL,按次序加入2.5 mL蒸餾水、0.1%的三氯化鐵溶液0.5 mL,均勻混合后靜置10 min,于700 nm波長條件下測定其吸光值,吸光值越大即表示還原力越強,以VC作為陽性對照,操作方法同上[14]。

1.2.10 鐵還原力實驗 TPTZ工作液:0.3 mol/L醋酸緩沖液(pH3.6)∶10 mmol/L TPTZ溶液∶20 mmol/L氯化鐵=10∶1∶1(現配現用);空白組:200 μL蒸餾水+1.8 mL TPTZ工作液,室溫暗處靜置10 min,593 nm處測吸光值A0;實驗組:200 μL不同濃度黑糯玉米芯花色苷溶液+1.8 mL TPTZ工作液,室溫暗處靜置10 min,593 nm處測吸光值A1;對照組:200 μL不同濃度黑糯玉米芯花色苷溶液+1.8 mL蒸餾水,室溫暗處靜置10 min,593 nm處測吸光值A2;以VC為陽性對照,操作方法同上[15]。按下列公式計算鐵還原力:

黑糯玉米芯花色苷鐵還原力=A1-A0-A2

1.3 數據處理

采用Design Expert 8.0.6軟件進行響應面設計,用Origin 8.0軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗

2.1.1 乙醇濃度對黑糯玉米花色苷提取效果的影響 由圖1可以看出,乙醇濃度的大小直接影響吸光度的大小。隨著乙醇濃度的增加,吸光值逐漸增大。當乙醇體積分數在60%時,黑糯玉米芯花色苷提取物溶液的吸光值最大;乙醇體積分數為80%時吸光值下降較多。在乙醇體積分數較低時,糖類、果膠等物質溶解性好,減弱了花色苷的溶出,導致提取效果差,所以吸光值低;但當乙醇濃度過大時,提取溶劑極性降低反而減弱花色苷物質的溶出[16]。

圖1 乙醇濃度對花色苷提取的影響Fig.1 Effect of alcohol concentrations on the extraction efficiency

圖2 提取時間對花色苷提取的影響Fig.2 Effect of extracting time on the extraction efficiency

2.1.2 提取時間對黑糯玉米花色苷提取效果的影響 由圖2可以看出,隨著提取時間增加,吸光值逐漸增加。當提取時間為120 min時花色苷提取物溶液吸光值達到最大值,花色苷吸光值與30、60、90 min花色苷吸光值相比差異顯著,150 min時吸光值略有下降,但和120 min相比花色苷吸光值差異不顯著且會造成資源浪費,因此選擇120 min為最佳提取時間。

2.1.3 提取溫度對黑糯玉米花色苷提取效果的影響 由圖3可以看出,隨著提取溫度上升,吸光值逐漸增加。當提取溫度為50 ℃的花色苷提取物溶液吸光值最大,而在低溫提取時吸光值較低,當溫度高于50 ℃時提取液的吸光值開始下降,這是由于花色苷類物質耐熱性較差,在高溫下易發生分解而使吸光值降低。

圖3 提取溫度對花色苷提取的影響Fig.3 Effect of temperature on the extraction efficiency

2.1.4 pH對黑糯玉米花色苷提取效果的影響 由圖4可以看出,pH逐漸升高時吸光度值先增大后減少。pH在1～3之間時花色苷提取物溶液吸光值都明顯高于pH為3～5時花色苷的吸光值。隨著pH的上升,花色苷結構裂解,被分為花色素基元及糖基兩個部分,導致花色苷不穩定;當提取劑的pH過低時,造成花色苷的糖基水解,也會導致花色苷的穩定性下降,因此提取液的適宜pH為2。

圖4 pH對花色苷提取的影響Fig.4 Effect of pH on the extraction efficiency

2.1.5 液料比對黑糯玉米花色苷提取效果的影響 由圖5可以看出,隨著液料比的增加,花色苷吸光值先迅速增加后緩慢下降。當液料比為20∶1、30∶1、40∶1時花色苷吸光值差異不顯著,考慮到在液料比增大時吸光值變化并不顯著,而溶劑用量過大會造成實驗材料浪費,所以液料比過大不予考慮。

圖5 液料比對花色苷提取的影響Fig.5 Effect of liquid-solid ratio on the extraction efficiency

2.2 響應面法優化黑糯玉米芯花色苷提取工藝

2.2.1 響應面分析方案及結果 響應面實驗方案和結果見表2。實驗共有17個實驗點,其中5個為零點,12個為分析因子。零點實驗進行五次,以計算誤差。

表2 Box-Behnken響應面實驗設計及結果Table 2 Box-Behnken experimental design and results

2.2.2 回歸模型的建立及顯著性分析 利用Design-Expert 8.0.6 軟件對表2中數據進行二元多元回歸擬合得到的二次回歸方程:Y=1.35+7.250E-003A-6.875E-003B+0.085C-0.051AB+2.250E-003AC-0.016BC-0.053A2-0.040B2-0.11C2

表3 方差分析表Table 3 Variance analysis table

注:**:表示極顯著(p<0.01);*:表示差異顯著(p<0.05)。2.2.3 響應面曲面分析 RSM方法的圖形是特定的響應值(Y)與對應的因素X1、X2、X3構成的一個三維空間在二維平面上的等高圖,每個響應面對其中的兩個因素進行分析,另外一個因素固定在零水平。通過該圖可以評估實驗因素對各個響應值的交互作用,確定最佳的水平范圍[9]。從中可以直觀的反應各因素對響應值的影響,從實驗所得的響應面分析圖上可以找到其在提取過程中的相互作用[17]。相應曲面比較陡,說明此時各因素對響應值的影響較為顯著,反之,則各因素對響應值的影響較小。

圖6～圖8直觀地反映了各因素交互作用對響應值的影響,提取溫度和液料比、乙醇濃度和提取溫度的交互作用對黑糯玉米芯花色苷提取率的影響顯著,表現為曲線較陡。

圖6 提取溫度與乙醇濃度提取花色苷影響的響應面圖Fig.6 Response surface diagram of effect between alcohol concentrations and extraction temperature

圖7 乙醇濃度與液料比對提取花色苷影響的響應面圖Fig.7 Response surface diagram of effect between alcohol concentrations and liquid-solid ratio

圖8 提取溫度與液料比對提取花色苷影響的響應面圖Fig.8 Response surface diagram of effect between extraction temperature and liquid-solid ratio

2.2.4 黑糯玉米芯花色苷提取工藝條件的確定 經軟件分析優化,結合二次回歸模型的數學分析,得出黑糯玉米芯皮花色苷的最佳工藝參數:乙醇濃度62.25%,液料比24.18∶1 (mL/g),提取溫度46.87 ℃,理論吸光值為1.365。考慮到實驗的可操作性,將最優工藝調整為乙醇體積分數62%、料液比24∶1 (mL/g)、提取溫度47 ℃,在提取時間為120 min,pH為2時進行驗證實驗,結果顯示實際吸光值為1.359,通過pH示差法計算得到提取一次黑糯玉米芯花色苷含量約為57.29 mg/g。

2.2.5 黑糯玉米芯中花色苷成分的鑒定 由圖9可知,提取物中花色苷主要有3種,根據表4的保留時間和MS數據,結合資料[15,18-19]分析可知,按照出峰順序依次為矢車菊色素(m/z 287)、天葵色素(m/z 271)以及芍藥色素(m/z 301)與之相連的糖殘基有葡萄糖。根據出峰順序,由文獻[15,18-19]推測1號峰為矢車菊素-3-葡萄糖苷、2號峰為天葵色素-3-葡萄糖苷、3號峰為芍藥色素-3-葡萄糖苷,含量最多的為矢車菊素-3-葡萄糖苷。

圖9 520 nm波長條件下黑糯玉米芯花色苷的HPLC圖Fig.9 HPLC chromatogram of the anthocyanin extract from black glutinous corncob detected at 520 nm

2.2.6 黑糯玉米芯花色苷提取物清除DPPH自由基活性 DPPH具有單電子,在517 nm處吸收最強,其醇溶液呈紫色。當體系加入抗氧化物質時,該物質能與DPPH的單電子配對,使其吸收逐漸消失,進而評價該物質的抗氧化能力。由圖10可知,黑糯玉米芯花色苷提取物和抗壞血酸(VC)均具有一定的清除DPPH自由基能力,弱于同濃度的VC。黑糯玉米芯花色苷提取物和VC的IC50值分別為18.26 mg/L和12.53 mg/L。隨著樣品濃度的增加,其清除能力增強,呈現一定的量效關系。

表4 黑糯玉米芯花色苷HPLC-DAD-MS/MS分離鑒定結果Table 4 HPLC-MS data and tentative identification of anthocyanins from black glutinous corncob

圖10 黑糯玉米芯花色苷提取物和VC對DPPH自由基清除能力Fig.10 Scavenging effects of the anthocyanin extracts from black glutinous corncob and VC on DPPH radical

2.2.7 黑糯玉米芯花色苷提取物清除ABTS自由基活性 由圖11可知,黑糯玉米芯花色苷提取物和VC均具有一定的清除ABTS自由基能力,弱于同濃度的VC。說明黑糯玉米芯花色苷能清除ABTS自由基,但是清除能力比VC低。黑糯玉米芯花色苷提取物和VC的IC50值分別為103.86 mg/L和76.27 mg/L。

圖11 黑糯玉米芯花色苷提取物和VC對ABTS自由基清除能力Fig.11 Scavenging effects of the anthocyanin extracts from black glutinous corncob and VC on ABTS radical

2.2.8 黑糯玉米芯花色苷提取物總還原力 由圖12可知,黑糯玉米芯花色苷提取物和VC均具有一定的總還原能力。隨著黑糯玉米芯和VC的提高,溶液的吸光值提高,即總還原力提高,并且在黑糯玉米花色苷提取物和VC濃度相同時,VC溶液的吸光值低于黑糯玉米芯花色苷溶液的吸光值,說明黑糯玉米芯花色苷提取物的總還原力強于VC。

圖12 黑糯玉米芯花色苷提取物和VC的總還原力Fig.12 The reduction ability of glutinous black corncob and VC

2.2.9 黑糯玉米芯花色苷提取物鐵還原力 由圖13可知,黑糯玉米芯花色苷提取物和VC均具有一定的鐵還原能力,且在實驗濃度范圍內,鐵還原力隨質量濃度的提高而提高,黑糯玉米芯花色苷提取物的鐵還原力比VC強,可能的原因為黑糯玉米芯花色苷在還原Fe3+的過程中可以提供較多的電子,使Fe3+-TPTZ還原成藍色Fe2+-TPTZ,從而使溶液的吸光值變大。

圖13 黑糯玉米芯花色苷提取物和VC的鐵還原力Fig.13 The ferric reducing ability of glutinous black corncob and VC

3 結論

黑糯玉米芯花色苷提取最佳條件:提取液乙醇濃度62%,液料比24∶1 (mL/g),提取溫度47 ℃,提取時間為120 min,pH為2。在此條件下進行提取,確定黑糯玉米芯花色苷含量約為57.29 mg/g。通過高效液相色譜-二極管陣列-電噴霧-串聯質譜法鑒定了黑糯玉米芯中花色苷的組成,鑒定出三種主要的花色苷:矢車菊素-3-葡萄糖苷、天葵色素-3-葡萄糖苷、芍藥色素-3-葡萄糖苷。抗氧化活性實驗表明:黑糯玉米芯花色苷提取物具有一定的清除DPPH和ABTS自由基能力,也有較強的總還原能力和鐵還原力,顯示了良好的抗氧化活性。

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Optimization of extraction technique and antioxidant activity determination of anthocyanins from black glutinous corncob

SUN Meng-yang,ZHANG Can,CHEN Ya-shu,XIE Bi-jun,SUN Zhi-da*

(College of Food Science and Technology,Huazhong Agricultural University,Wuhan 430070,China)

The UV absorbance of extracting solution was used to measure the content of anthocyanins from black glutinous corncob.Response surface analysis method was also used to optimize the extraction condition of black glutinous corncob anthocyanins. Based on the single factor experiments,the interaction of the respective variables and their influence on the extraction effect were studied using Box-Benhnken central composite design and response surface analysis. Results showed that the optimum condition was as follows:the ethanol concentration 62%,liquid-solid ratio 24∶1,temperature 47 ℃,water-bath time 120 min,pH2. Hence,the maximal content of anthocyanins from dry black glutinous corncob was determined,which was 57.29 mg/g. In this paper,high performance liquid chromatography with diode array detection combined with electrospray ionization tandem mass spectrometry(HPLC-DAD-ESI-MS/MS)was used to analyze the extracted anthocyanidin composition. Three mian anthocyanins were identified:cyanidin-3-glucoside,pelargondin-3-glucoside,and petunidin-3-glucoside.The antioxidant activity experiments indicated that anthocyanins from black glutinous corncob possessed certain ability to scavenge DPPH and ABTS free radical,meanwhile the anthocyanins also showed strong reducing power and ferric reducing power.

response surface methodology;black glutinous corncob;anthocyanidins;antioxidant activity

2016-11-28

孫夢洋(1992-),男,碩士研究生,主要從事天然產物化學方面的研究,E-mail:smy613@163.com。

*通訊作者:孫智達(1963-),男,博士，教授,主要從事天然產物化學和毒理學方面的研究,E-mail:sunzhida@mail.hzau.edu.cn。

TS255.1

B

1002-0306(2017)10-0307-07

10.13386/j.issn1002-0306.2017.10.050