啤酒糟多糖提取工藝及其抗腫瘤活性

姜福佳,翟思羽,孫香盟,馬 帥,李 欣,代云飛,逯家富

(長春職業技術學院,吉林長春 130033)

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啤酒糟多糖提取工藝及其抗腫瘤活性

姜福佳,翟思羽,孫香盟,馬 帥,李 欣,代云飛,逯家富*

(長春職業技術學院,吉林長春 130033)

采用響應面法優化啤酒糟中多糖的提取工藝,并對多糖的抗腫瘤活性進行評價。在單因素實驗基礎上,以浸提溫度、浸提時間和固液比為影響因素,利用Box-Behnken中心組合方法進行三因素三水平實驗設計,以多糖得率為響應值,進行響應面分析,采用MTT法分別考察啤酒糟多糖于24、48、72 h對HeLa、A549和HepG2細胞增殖的抑制能力。結果顯示,多糖提取的最佳工藝:浸提溫度為96.7 ℃、浸提時間為1.83 h、固液比為1∶27 g/mL時,最大多糖得率為6.24%,驗證值為6.07%,相對誤差為2.72%;啤酒糟多糖對HeLa,A549和HepG2細胞具有較好的抑制增殖能力,其72 h的IC50值分別為34.85、91.50和162.39 μg/mL。表明本研究所得的啤酒糟多糖提取工藝高效、簡單且可重復性強,同時該多糖可以作為一種潛在的輔助抗腫瘤成分應用在保健食品及醫藥領域。

啤酒糟,多糖,響應面法,抗腫瘤

啤酒糟,又稱麥糟,是麥汁經過濾之后的副產物,占啤酒工業副產物的80%以上[1-4]。啤酒糟的主要成分為蛋白質和膳食纖維以及少量多糖、脂肪等[5-6]。啤酒糟主要用作飼料,近年來,國內外很多學者在尋求利用啤酒糟的新途徑[7]。我國是啤酒生產大國,每年約有三百余萬噸含水量83%的濕糟需要處理,對啤酒糟的深度開發利用,不僅將給生產廠家帶來巨大的經濟效益,更將給我國帶來巨大的經濟效益和社會效益[8-10]。

近年來,基于多糖具有諸如免疫調節、抗氧化、抗腫瘤、降血糖血脂等廣泛的藥理作用,而倍受研究人員的重視[11-13]。多糖的提取方法主要有:溶劑提取法、復合酶輔助法、超聲輔助法和微波輔助法等[14-15]。而目前,大多研究者認為多糖的抗腫瘤作用通過增強機體的免疫功能達到殺傷腫瘤細胞的目的,即抗癌作用經過宿主中介作用,增強機體的非特異性和特異性免疫作用,而非直接殺傷腫瘤細胞[16]。

本研究采用響應面法優化啤酒糟中多糖的提取工藝,并考察對不同腫瘤細胞的增殖能力以確定其抗腫瘤活性能力,以期提高啤酒糟的綜合利用價值。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

啤酒糟 華潤雪花啤酒長春有限公司提供;維生素C、DPPH、MTT Sigma公司;胎牛血清、RPMI1640培養基 Invitrogen公司。

DL-5C離心機 上海安亭科學儀器廠;SHZ-88水浴恒溫振蕩器 金壇市開發區吉特實驗儀器廠;UV2550紫外可見分光光度計 日本島津公司;多功能酶標儀 美國BioRod公司;電子分析天平 上海恒平科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 啤酒糟中多糖的提取工藝流程

結合前期研究基礎進行啤酒糟干粉中水溶性多糖的提取。稱取啤酒糟干粉,置于室溫條件下,添加適量蒸餾水并高溫浸提,提取后7000 r/min離心10 min,棄去沉淀,收集上清液并濃縮醇沉,收集醇沉沉淀并干燥,即得啤酒糟水溶性多糖。

1.2.2 提取工藝的單因素實驗

1.2.2.1 浸提溫度對多糖得率的影響 稱取1 g啤酒糟干粉,按照固液比1∶20添加蒸餾水,按照浸提溫度40、50、60、70、80、90、100 ℃條件進行浸提,提取時間為1 h,每組3平行,以啤酒糟多糖得率為評價指標,考察浸提溫度對多糖得率的影響。

1.2.2.2 浸提時間對多糖得率的影響 稱取1 g啤酒糟干粉,按照固液比1∶20添加蒸餾水,按照浸提溫度70 ℃進行浸提,提取時間分別為0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5 h,每組3平行,以啤酒糟多糖得率為評價指標,考察浸提時間對多糖得率的影響。

1.2.2.3 固液比對多糖得率的影響 稱取1 g啤酒糟干粉,分別按照固液比1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40添加蒸餾水,以浸提溫度70 ℃,提取時間1 h進行浸提,每組3平行,以啤酒糟多糖得率為評價指標,考察浸提固液比對多糖得率的影響。

1.2.3 響應面優化實驗 在單因素實驗基礎上,采用Box-Behnken模型,以浸提溫度(A)、浸提時間(B)、固液比(C)作為自變量,以啤酒糟多糖得率(Y)為響應值,響應面因素水平設計如表1所示。

表1 響應面分析實驗因素與水平Table 1 Factors and levels of the design of response surface analysis

1.2.4 標準曲線制備 精密稱取105 ℃干燥的葡萄糖10.0 mg,置于100 mL量瓶中,去離子水定容,精密量取0.1、0.2、0.3、0.4、0.6、0.8、1.0 mL置20 mL具塞試管中,用去離子水補足至1.0 mL,向試液中加入1.0 mL 5%苯酚溶液,快速加入5.0 mL硫酸,靜置10 min,振蕩混合并30 ℃水浴反應20 min,于490 nm測定吸光度。以葡萄糖質量濃度為橫坐標,吸光度為縱坐標,制定標準曲線。

1.2.5 多糖得率的測定 浸提后樣本,5000 r/min離心10 min,收集上清液并添加無水乙醇至體積分數為80%,4 ℃靜置12 h,7000 r/min離心10 min,棄上清收集沉淀,并用蒸餾水復溶定容至10 mL,混勻并精密量取1.0 mL以待測,按照苯酚硫酸法進行測定,并按照以下公式計算多糖得率:

式中:c-通過標準曲線獲得的樣品測定液含糖濃度,單位為mg/L;V-樣品定容體積,10 mL;m-樣品質量,1 g;0.9-葡萄糖換算成葡聚糖的校正系數。

1.2.6 啤酒糟粗多糖的干燥 稱取1000 g啤酒糟干粉,按照響應面法優化的最佳提取工藝條件進行浸提,浸提后抽濾并濃縮至1.0 L,添加無水乙醇至乙醇體積分數80%,靜置12 h后7000 r/min離心10 min,保留沉淀并真空干燥,即得啤酒糟多糖樣本。

1.2.7 啤酒糟多糖體外抗腫瘤活性研究 按照參考文獻[17-20]的方法,采用MTT法分別考查啤酒糟多糖對人宮頸癌細胞(HeLa)、人肺癌細胞(A549)、人肝癌細胞(HepG2)生長的抑制效果。細胞于96孔板的培養濃度為5×104cell/mL,分別于24、48和72 h添加含有培養基的多糖樣品溶液。采用MTT法測定細胞抑制效果。根據以下公式計算:

細胞活性(%)=實驗組吸光值/空白組吸光值×100

1.2.8 數據處理 實驗中每個處理重復三次,采用SPSS 16.0軟件進行數據的顯著性分析,數據比較采用單因素方差分析(ANOVA),數據以mean±S.D.表示。當p<0.05時表示具有顯著差異性。應用Orign7.0軟件作圖。

2 結果與討論

2.1 多糖含量測定標準曲線

應用苯酚硫酸法建立多糖含量測定標準曲線,以吸光度為縱坐標,糖的濃度為橫坐標,回歸方程Y=0.032+0.098X,R2=0.999,如圖1所示。

圖1 多糖測定標準曲線Fig.1 The standard curve of polysaccharides content

2.2 熱水浸提啤酒糟多糖單因素實驗

2.2.1 浸提溫度對多糖得率的影響 由圖2可知,浸提溫度在40～90 ℃范圍內,啤酒糟多糖得率伴隨溫度的遞增逐漸增大,當浸提溫度達到90 ℃時,其多糖得率可達4.85%,繼續增加浸提溫度,其多糖得率無顯著變化,細胞破碎充分且細胞內物質溶解,多糖已充分溶出,溫度過高可能會破壞多糖結構并且消耗能量,故最佳浸提溫度為90 ℃。

圖2 浸提溫度對啤酒糟多糖得率的影響Fig.2 The influence of extraction temperature on the yield of polysaccharides

2.2.2 浸提時間對多糖得率的影響 由圖3可知,浸提時間在0.5～1.5 h范圍內,啤酒糟多糖得率伴隨浸提時間的延長而逐漸增大,當浸提時間達到1.5 h時,其多糖得率可達4.53%,繼續增加浸提時間,其多糖得率變化不大,可見當溫度及固液比達到最佳條件時,浸提時間達到1.5 h時,啤酒糟中的多糖提取充分,延長時間多糖的提取率變化不大,考慮工業能耗等問題,故選擇浸提時間為1.5 h。

圖3 浸提時間對啤酒糟多糖得率的影響Fig.3 The influence of extraction time on the yield of polysaccharides

2.2.3 固液比對多糖得率的影響 由圖4可知,當溫度達到最佳條件時,固液比在1∶10～1∶25范圍內,啤酒糟多糖得率伴隨固液比的增大而逐漸增大,當固液比為1∶25時,其多糖得率可達4.47%,這是由于增加浸提液體積可以增大溶劑與提取物的接觸面積,使多糖能夠充分的流出,繼續增加固液比,會使多糖達到飽和,多糖得率變化不大,為避免浪費原料選擇最佳固液比為1∶25。

圖4 固液比對啤酒糟多糖得率的影響Fig.4 The influence of solid-liquid ratio on the yield of polysaccharides

2.3 響應面優化實驗

在單因素實驗結果基礎上,以浸提溫度(A)、浸提時間(B)、固液比(C)作為自變量,以啤酒糟多糖得率(Y)為響應值,采用響應面法進行三因素三水平實驗設計,其設計方案及結果如表2所示,方差分析如表3所示。

表2 響應面分析設計方案結果Table 2 The design of response surface analysis and test results

采用多元二次回歸方程擬合實驗結果,再用F檢驗統計分析工具和響應面圖研究考察因子之間的交互關系及因子與響應值間的關系。

對表2中數據進行回歸分析,獲得啤酒糟多糖得率對編碼自變量浸提溫度、浸提時間、固液比的多元二次回歸方程:Y=5.70+0.90A+0.56B+0.31C-0.90A2+0.13AB+0.59AC-0.55B2+0.20BC-1.08C2

表3 回歸模型方差分析Table 3 Analysis of variance for fitted quadratic polynomial model

注：**，p<0.01，極顯著。

對模型進行方差分析(表3),可以看出,pModel=0.0002<0.05,表明模型顯著,多糖得率失擬項p=0.1421>0.05,表明失擬項不顯著,所選用的二次回歸模型是適當的,對模型進行回歸方程系數顯著性檢驗,可知模型一次項A(p<0.01)、B(p<0.01)、C(p<0.01),交互項AC(p<0.01),二次項A2(p<0.01)、B2(p<0.01)、C2(p<0.01)均有極顯著性差異,說明所選因素均對多糖得率影響顯著,且通過圖5所示,交互項AC的響應面圖,可知兩者交互作用良好。

圖5 Y=f(A,C)的響應面圖和等高線圖Fig.5 Y=f(A,C)of the respose surface and contour plot

從響應曲面圖及其等高線圖中可看出,曲面圖開口均為向下凸形曲面,表明在該范圍內響應值Y存在著極大值,表明該多元二次回歸模型能夠較好的用于描述響應值和自變量之間的顯著性。浸提溫度(A)和固液比(C)對響應值Y存在交互影響。當固液比(C)達到最適值時,隨著浸提溫度(A)的增加,Y值呈現不同的變化。表明AC交互項對響應值Y有著顯著的交互影響,與回歸分析中的AC項(p<0.05)相對應。計算多糖浸提法最優提取條件,編碼值A=0.6743,B=0.6565,C=0.3893,即浸提溫度為96.7 ℃、浸提時間1.83 h、固液比為1∶27時,多糖最佳提取率為6.24%。

2.4 驗證實驗

為了檢驗模型預測的準確性,按照上述最佳工藝進行3組平行實驗,所得多糖得率平均值為6.07%,與回歸方程預測最佳提取率為6.24%的相對誤差為2.72%,說明該回歸方程能夠較為真實的反應各個因素對啤酒糟多糖得率的影響,證實該模型真實可靠。

2.5 啤酒糟粗多糖抗腫瘤活性研究

采用MTT法檢測啤酒糟多糖抗腫瘤活性,提取粗多糖分別于24,48,72 h測定對Hela,A549和HepG2細胞增殖的抑制效果,結果如圖6～圖8所示。結果表明啤酒糟多糖抑制腫瘤細胞在一定劑量范圍內存在劑量依賴性,隨著劑量的增加,細胞增殖能力逐漸降低,且對不同腫瘤細胞表現的抑制效果存在一定的差異。

采用MTT法計算IC50,結果顯示72 h,啤酒糟多糖對Hela,A549和HepG2細胞的IC50值分別為34.85、91.50和162.39 μg/mL。

圖6 不同濃度多糖對HeLa細胞抑制效果Fig.6 Antitumor activity(HeLa)of polysaccharide with different concentrations cultured of 24,48 and 72 h

圖7 不同濃度多糖對A549細胞抑制效果Fig.7 Antitumor activity(A549)of polysaccharide with different concentrations cultured of 24,48 and 72 h

3 結論

本研究在單因素實驗的基礎上,通過響應面分析優化啤酒糟中多糖的提取工藝,并獲得最佳提取條件和最大多糖得率,即浸提溫度為96.7 ℃、浸提

圖8 不同濃度多糖對HepG2細胞抑制效果Fig.8 Antitumor activity(HepG2)of polysaccharide with different concentrations cultured of 24,48 and 72 h

時間1.83 h、固液比為1∶27 g/mL時,最大多糖得率為6.24%,且經過驗證實驗,證明用響應面法優化啤酒糟多糖得率(6.07%)的回歸模型可靠。

啤酒糟多糖抗腫瘤能力的實驗結果證實,該多糖對不同腫瘤細胞的抑制能力是不同的,且在一定劑量范圍內,存在劑量依賴性,表明該多糖可以作為一種潛在的輔助抗腫瘤成分應用在保健食品及醫藥領域。

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Extraction and antitumor activity of polysaccharide from beer vinasse

JIANG Fu-jia,ZHAI Si-yu,SUN Xiang-meng,MA Shuai,LI Xin,DAI Yun-fei,LU JIA-fu*

(Changchun Vocational Institute of Technology,Changchun 130033,China)

Box-Behnken response surface method was to optimize extraction process of polysaccharide from beer vinasse and the antitumor activity of polysaccharide was evaluated.Based on the single factor experiment,leaching temperature,leaching time and solid liquid ratio as factor,the Box-Behnken central composite method was used to make three factors,three levels experimental design. The polysaccharide yield was the response value to process response surface analysis. Adopting MTT method was inspected the inhibition capability of polysaccharide from beer vinasse at 24,48,72 h to the cell proliferation of HeLa,A549 and HepG2.It turned out that the best process of polysaccharide was when leaching temperature was 96.7 ℃,leaching time was 1.83 h,solid liquid ratio was 1∶27 g/mL,the maximum polysaccharide yield was 6.24%,verifying value was 6.07%,relative error was 2.72%. Polysaccharide of beer vinasse could better inhibit multiplication capacity was 34.85,91.50 and 162.39 μg/mL. It showed that the extraction process of polysaccharide from beer vinasse in the study was effective,easy and repeatable. Meanwhile,the polysaccharide could be a potential auxiliary antitumor components to apply in health food and medicine field.

beer vinasse;polysaccharide;response surface method;antitumor

2016-11-01

姜福佳(1983-),碩士研究生,主要從事生物技術及應用方面的研究,E-mail:lujiafu888@163.com。

*通訊作者:逯家富(1961-),本科,教授,主要從事食品與工業發酵工業方面的研究,E-mail:604771032@qq.com。

吉林省科技廳重點科技攻關項目(20140204007SF);吉林省產業技術研究與開發專項項目。

TS262.5

B

1002-0306(2017)10-0303-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.10.049