超聲-微波協同提取蟬花蟲草腺苷條件優化及不同產地腺苷測定

張紅芳,吳次虎,楊東瑤,左 瑞,黃文華,陳 曄

(九江學院藥學與生命科學學院,江西九江 332000)

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超聲-微波協同提取蟬花蟲草腺苷條件優化及不同產地腺苷測定

張紅芳,吳次虎,楊東瑤,左 瑞,黃文華,陳 曄*

(九江學院藥學與生命科學學院,江西九江 332000)

以野生蟬花蟲草子實體為材料,采用超聲-微波協同法提取蟬花蟲草腺苷并對其提取條件進行優化,經單因素及正交實驗,確定優化的提取條件:微波功率150 W、超聲-微波協同提取時間120 s、料液比為1∶30、甲醇體積分數為20%,蟬花蟲草腺苷提取率為(0.53±0.02) mg/g;并利用高效液相色譜法測定不同產地蟬花蟲草菌絲體腺苷含量,結果表明:測得4個產地的蟬花蟲草菌絲體腺苷含量為0.14～0.40 mg/g,其中井岡山分離獲得JJS0017菌株的菌絲體腺苷含量最高(0.40 mg/g),其次為九江市蓮花鎮蓮花林場分離獲得JJS0007菌株,江西省鄱陽縣饒埠鎮分離獲得JJS0032菌株的菌絲體腺苷最低(0.14 mg/g)。本文可為蟬花蟲草的開發利用提供一定的理論依據。

蟬花蟲草,超聲-微波協同提取,高效液相色譜法,腺苷

蟬花蟲草(Isariacicadae)是蟬擬青霉寄生山蟬(Cicadaflammatus)、竹蟬(Platylomiapieli)若蟲后的復合體[1-3],是我國傳統中藥材之一[4-5]。經研究分析,蟬花的化學成分復雜,蟬花含有腺苷、多種必需氨基酸、甘露醇、多種生物堿及麥角甾醇等成分[6-12];藥理作用較廣泛,能增強機體免疫調節、改善腎功能、抑菌、抗腫瘤、抗病毒、抗輻射、抗疲勞、抗應激、抗氧化、抗驚厥等功效[13-17]。可見蟬花具有冬蟲夏草相似的組分和功效,尤其蟬花所含蟲草酸及腺苷的量均高于冬蟲夏草[8],近年來,有的學者在臨床上用蟬花作為冬蟲夏草的代用品并取得較好的效果。

腺苷是評價蟲草內在質量的主要指標。腺苷具有舒張血管,降低血壓,改善心腦血液循環,抑制神經遞質的釋放和調節腺苷酸活化酶活性等多種功能活性[18]。目前,關于蟬花蟲草腺苷的提取主要采用熱水浸提、超聲波提取、室溫攪拌提取等方法,研究表明這些提取方法對蟲草腺苷類物質的提取效果差異極顯著,尤其超聲波提取蟲草腺苷類物質的提取效果最好,超聲波提取技術和微波萃取技術均可大大簡化操作、縮短提取時間、增加得率,在食品、天然產物和環境等領域得到廣泛的應用[19-22]。近年來,超聲-微波協同提取技術以其高效性、強選擇性以及操作簡便、副產物少、產率高等優點,被應用于天然活性成分的提取,而有關超聲-微波協同提取蟬花蟲草腺苷鮮見報道。本研究以天然蟬花為材料,甲醇為溶劑,以蟬花蟲草腺苷提取率為考核指標,采用單因素和正交實驗設計考察超聲-微波提取時間、微波功率、料液比等因素對蟬花蟲草腺苷提取率的影響,旨在篩選出蟬花蟲草腺苷的超聲-微波協同提取最佳工藝;同時,采用高效液相色譜法測定不同產地蟬花蟲草菌絲體中腺苷的含量,旨在篩選出產蟬花蟲草腺苷含量高的菌株,為蟬花蟲草的開發利用提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

野生蟬花蟲草干燥子實體 采自九江市濂溪區蓮花鎮蓮花林場,經九江學院藥學與生命科學學院真菌研究室陳曄教授鑒定為蟬花蟲草(Isariacicadae);蟬花蟲草菌株編號JJS0017 江西省井岡山市大井分離獲得;蟬花蟲草菌株JJS0032 江西省鄱陽縣饒埠鎮分離獲得;蟬花蟲草菌株JJS0007 九江市濂溪區蓮花鎮蓮花林場分離獲得;蟬花蟲草菌株JJS0010 江西省武寧縣羅溪鄉朱山林場分離獲得;甲醇、乙腈 為色譜純,MERCK公司;腺苷 上海東風生物技術有限公司生產,純度≥98%;其它試劑 均為分析純;培養基 PDA培養基;實驗用水 超純水。

UItiMate 3000RSLC超高效液相色譜儀 Thermo Fisher公司;CW-2000 超聲波微波協同提取儀 上海新拓分析儀器科技有限公司;Sartorius BS124S萬分電子分析天平 德國賽多利斯公司。

1.2 蟬花蟲草腺苷的測定

1.2.1 蟬花蟲草腺苷標準曲線的繪制 準確稱取腺苷標品0.0125 g,用甲醇溶解并定容于10 mL容量瓶中,配成1.25 mg/mL儲備液。再取1 mL置于100 mL容量瓶中,加入甲醇稀釋至刻度,搖勻,制得標準儲備液,備用[18-19]。

標準儲備液1.0、2.0、4.0、6.0、8.0 mL,分別置于10 mL容量瓶中,加入甲醇稀釋至刻度,每個濃度進樣兩次,各進5 μL,取平均峰面積。以對照品進樣量(ng)為橫坐標,峰面積為縱坐標,繪制校準曲線,得線性回歸方程為y=0.0386X+0.0527(R2=0.9967)。

1.2.2 蟬花蟲草腺苷的測定 將提取物置于20 ℃,5000 r/min的離心機中離心10 min,得提取液,用20%的甲醇定容。用0.45 μm有機相微孔濾膜過濾后供分析。每種樣品重復3次。

色譜柱為Kromasil C18(150 mm×4.6 mm,5 μm),流動相為乙腈∶水=5∶95,流速為1.0 mL/min,檢測波長為260 nm,柱溫為室溫,進樣量為5 μL[18-21]。按照以上條件進行蟬花蟲草腺苷測定,并計算腺苷提取率,腺苷提取率(mg/g)=提取得到腺苷質量/蟬花蟲草子實體(或菌絲體)質量。

1.3 超聲波-微波協同提取蟬花蟲草腺苷工藝優化

1.3.1 單因素實驗設計 將野生蟬花蟲草子實體置于40 ℃烘干箱中烘干至質量恒定,經粉碎機粉碎后過100目篩,精確稱取干粉1.0 g,在開啟超聲波(50 W/40 kHz)的條件下,固定超聲-微波協同提取時間150 s,料液比1∶30,甲醇體積分數20%,考察微波功率50、100、150、200、250、300 W對蟬花蟲草腺苷提取率的影響。

固定微波功率120 W,料液比1∶30,甲醇體積分數20%,考察不同超聲-微波協同提取時間90、120、150、180、210、240 s對蟬花蟲草腺苷提取率的影響。

固定微波功率120 W,甲醇體積分數20%,超聲-微波協同提取時間為150 s,考察不同料液比1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60、1∶70(g∶mL)對蟬花蟲草腺苷提取率的影響。

固定微波功率120 W,料液比1∶30,超聲-微波協同提取時間150 s,考察不同甲醇體積分數10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%對蟬花蟲草腺苷提取率的影響。

1.3.2 正交實驗 在單因素實驗的基礎上,通過正交實驗進一步考察甲醇體積分數、微波功率、超聲-微波協同提取時間和料液比之間的相互影響,并確定超聲波-微波協同提取蟬花蟲草中腺苷的最佳工藝參數。

表1 正交實驗因素水平Table 1 Factors and levels of orthogonal test

1.4 方法學考察

1.4.1 精密度實驗 準確吸取對照品溶液5 μL,按液相色譜條件進樣5次,記錄峰面積并計算RSD值。

1.4.2 重復性實驗 精密稱量JJS0007樣品5份,各1 g。按供試品溶液處理方法處理,按“1.2.2”液相色譜條件,將樣品溶液分別進行測定并計算RSD值。

1.4.3 穩定性實驗 準確吸取供試液5 μL,按“1.2.2”色譜條件,在室溫條件下,每隔2～4 h進行一次腺苷含量的測定,記錄數據。記錄24 h內峰面積的變化并計算RSD值。

1.4.4 加標回收率實驗 精確稱量JJS0007處理后的樣品,分別加入不同量的對照品(平行做5份),按樣品處理方法,并按“1.2.2”色譜條件,測定含量,并計算加標回收率。

1.5 不同產地蟬花蟲草菌絲體腺苷測定

1.5.1 蟬花蟲草菌株樣品制備 菌株活化培養:將蟬花蟲草菌株接種到固體斜面培養基,于25 ℃培養6 d。液體發酵培養:在250 mL三角瓶中裝入50 mL發酵培養基,接種蟬花菌種后,置于25 ℃、180 r/min下振蕩培養5～6 d,得種子液。擴大培養:在500 mL三角瓶中裝入200 mL發酵培養基,并將培養好的種子液按5%的接種量接種到發酵培養基中振蕩擴大培養5～7 d。

將振蕩擴大培養好的蟬花蟲草菌株取出,進行真空抽濾,棄濾液,將菌絲體轉移到培養皿里(全過程在無菌條件進行),進行冷凍干燥,干燥后研磨成粉,過100目篩,做好標記,備用[8]。

1.5.2 蟬花蟲草菌絲體腺苷提取及測定 按照1.2節方法進行蟬花蟲草菌絲體腺苷的提取和測定。

1.6 數據處理

采用Origin7.5軟件進行數據處理分析。

2 結果與討論

2.1 單因素實驗

2.1.1 微波功率對蟬花蟲草菌絲體腺苷提取率的影響 由圖1可知,隨著微波功率的增加,物質的加熱程度隨之增加,蟬花蟲草腺苷也能夠較容易地被提取出來,腺苷的提取率增加;在微波功率達到150 W之后,隨微波功率升高,所測腺苷的提取率呈下降趨勢,這可能是由于高微波功率形成較高的熱效應,使腺苷分子內或分子間的羥基易形成氫鍵,從而導致腺苷分子結構發生變化[23],選擇微波功率為150 W。

圖1 微波功率對蟬花蟲草腺苷提取率的影響Fig.1 Effect of microwave power on the yield of adenosine from Isaria cicadae

2.1.2 超聲波-微波協同提取時間對蟬花蟲草腺苷提取率的影響 由圖2可知,在超聲波-微波協同提取時間為150 s之前,蟬花蟲草菌絲體腺苷不能充分的轉移到溶液中,隨著提取時間的增加,腺苷提取率增加；在150 s時達到峰值之后,繼續增加時間,蟬花蟲草腺苷提取率明顯下降,腺苷的熱穩定性差,溫度過高會分解。這可能是因為隨著提取時間的增加,溫度急劇升高,導致腺苷結構發生改變所致[23],選擇提取時間為150 s。

圖2 提取時間對蟬花蟲草腺苷提取率的影響Fig.2 Effect of extraction time on the yield of adenosine from Isaria cicadae

2.1.3 料液比對蟬花蟲草菌絲體腺苷影響 由圖3可知,提取劑的增加,有利于蟬花蟲草菌絲體中腺苷的溶出,這是因為溶劑和原料間的濃度差越大,其提取效率就越高,然而在液料比增加到1∶30之后,蟬花蟲草中腺苷提取效率變化不大,表明提取基本完全,為節省后續處理時間,選擇液料比為1∶30。

圖3 料液比對蟬花蟲草腺苷提取率的影響Fig.3 Effect of solid-liquid ratio on the yield of adenosine from Isaria cicadae

2.1.4 甲醇體積分數對蟬花蟲草菌絲體腺苷影響 由圖4可知,甲醇體積分數較低時,所測蟬花蟲草腺苷的提取率較大。當甲醇體積分數為20%時,測得蟬花蟲草腺苷提取率最大,隨著提取液中甲醇體積分數的增大,蟬花蟲草中的腺苷提取效率明顯降低,可能與腺苷具有較強的水溶性有關。實驗表明:低甲醇體積分數更利于蟬花蟲草腺苷的提取,高甲醇體積分數不利于蟬花腺苷的提取,選擇甲醇體積分數為20%。

圖4 甲醇體積分數對蟬花蟲草菌絲體腺苷影響Fig.4 Effect of methanol volume fraction on the yield of adenosine from Isaria cicadae

2.2 正交實驗設計及結果

正交實驗結果見表2。由表2中R值可知,影響腺苷提取率的主次因素為D>A>B>C,即甲醇的體積分數對腺苷提取率的影響最大,微波功率、提取時間次之,料液比影響最小。考察A、B、C、D因素在3個水平上的變化,綜合各因素k值和直觀比較,得出理論上最佳提取產率的工藝條件為A2B1C1D2,即微波功率150 W、協同提取時間120 s、料液比為1∶30、甲醇體積分數為20%。

為了考察最優條件的再現性,則需進行3次驗證實驗,所測蟬花蟲草腺苷提取率為053、0.50、0.54 mg/g,平均值為(0.53± 0.02) mg/g,結果表明,在上述工藝條件下蟬花蟲草腺苷的提取率相對比較穩定,達到了優化目的。

表2 L9(34)正交實驗設計及結果Table 2 Results of L9(34)orthogonal tests

2.3 方法學考察結果

2.3.1 精密度實驗 精密度實驗結果顯示:按液相色譜條件,進樣5次,記錄峰面積,腺苷峰面積的RSD為0.54%(n=5),表明方法精密度良好。

表3 回收率實驗結果(n=5)Table 3 Recovery rates of adenosine and cordycepin in spiked samples(n=5)

2.3.2 重復性實驗 精密稱量JJS0007樣品5份,各1 g,按供試品溶液處理方法處理,按“1.2.2”液相色譜條件,將樣品溶液分別進行測定,峰面積相對標準偏差RSD為0.27%(n=5),表明采用本實驗方法對蟬花蟲草腺苷定量分析時重復性良好。

2.3.3 穩定性實驗 采用優化后的提取方法對JJS0007樣品進行前處理,分別在室溫條件下放置不同時間(0、4、8、12、16、20、24 h)測定。結果表明:在24 h內,采用本實驗提取條件提取的溶液,其腺苷保持相對穩定,腺苷5次實驗的平均RSD值為2.11%(n=5)。

2.3.4 加標回收實驗 準確稱取JJS0007樣品適量,分別加入不同量的對照品(平行做5份),按樣品處理方法,按“1.2.2”液相色譜條件測定含量,計算加標回收率,結果見表3。由表3可知,腺苷回收率為97.61%～98.36%,平均回收率為97.86%,RSD為0.23%。

2.4 不同產地蟬花蟲草菌絲體腺苷測定

以色譜峰保留時間為參數,對4個不同產地蟬花蟲草菌絲體進行色譜測定,將各產地蟬花蟲草菌絲體腺苷色譜圖與腺苷對照品色譜圖進行比較,見圖5、圖6。實驗結果表明:4個產地蟬花蟲草的腺苷含量為0.14～0.40 mg/g,其中井岡山大井分離獲得JJS0017菌株的菌絲體腺苷含量最高,為0.40 mg/g,其次為九江市濂溪區蓮花鎮蓮花林場分離獲得JJS0007菌株,江西省鄱陽縣饒埠鎮分離獲得JJS0032菌株的菌絲體腺苷含量最低,為0.14 mg/g。

圖6 不同產地蟬花蟲草菌絲體腺苷提取率(mg/g)HPLC色譜圖Fig.6 The yield of adenosine from Isaria cicadae in different area

3 結論

本實驗采用超聲-微波協同法對蟬花蟲草菌絲體腺苷及提取條件進行優化,最優化的提取條件為微波功率150 W、超聲-微波協同提取時間120 s、料液比為1∶30、甲醇體積分數為 20%,蟬花蟲草腺苷提取率為(0.52± 0.02) mg/g。利用高效液相色譜法測定4個產地蟬花蟲草菌絲體腺苷含量為0.14～0.40 mg/g,其中井岡山分離獲得JJS0017菌株的菌絲體腺苷含量最高,其次為九江市蓮花鎮蓮花林場分離獲得JJS0007菌株,江西省鄱陽縣饒埠鎮分離獲得JJS0032菌株的菌絲體腺苷最低,可見產地不同,蟬花蟲草菌絲體的腺苷含量不同,本文為深層開發蟬花菌絲體提供重要依據。

圖5 蟬花蟲草菌絲體樣品和腺苷對照品的HPLC圖(260 nm)Fig.5 The HPLC chromatogram Isaria cicadae sample and adenosine at 260 nm注:A:JJS0017菌株;B:JJS0007菌株;C:JJS0010菌株;D:JJS0032菌株;E:腺苷對照品。

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Determination and optimal extracted conditions of adenosine inIsariacicadaemycelium from different areas by ultrasonic-microwave synergistic extraction method

ZHANG Hong-fang,WU Ci-hu,YANG Dong-yao,ZUO Rui,HUANG Wen-hua,CHEN Ye*

(School of Pharmacology and Life Sciences,Jiujiang University,Jiujiang 332000,China)

Taking the fruiting bodies ofIsariacicadaeas materials,ultrasonic-microwave synergistic extraction method was used to extract adenosine inI.cicadaemycelium and the extraction conditions were optimized. According to the single factor and orthogonal experiments,the optimal extraction conditions were 150 W of microwave power,120 s of ultrasonic microwave synergistic extraction time,1∶30 of solid-liquid ratio and 20% of methanol volume fraction. The content of adenosine in mycelium ofI.cicadaedetermined was(0.53± 0.02) mg/g. The adenosine contents in different areas were determined by high performance liquid chromatography. The results showed that the adenosine contents ofI.cicadaeprovided from four areas were ranged from 0.14 to 0.40 mg/g. The content of mycelium adenosine in the strain JJS0017 isolated from Jinggangshan was highest,which was followed by the strain JJS0007 obtained from Lianhua town,Jiujiang city. The lowest content was 0.14 mg/g,which was from the strain JJS0032 from Rao town,Poyang county,Jiangxi province. This article could provide a theoretical basis for the development and utilization ofI.cicadae.

Isariacicadae;ultrasonic microwave synergistic extraction;high performance lquid chromatography;adenosine

2016-11-01

張紅芳(1971-)，女，碩士，講師，研究方向：蟲草資源及成分分析，E-mail:939044612@qq.com。

*通訊作者:陳曄(1966-)，男，碩士，教授，研究方向：真菌多樣性，E-mail:chenyejjtc@126.com。

江西省科技支撐計劃項目(20122BBF60128)。

TS201.1

B

1002-0306(2017)10-0291-06

10.13386/j.issn1002-0306.2017.10.047