響應面法優化機械力輔助提取千里光酚類

俞靜波,王英瑤,蘇為科

(浙江工業大學綠色制藥協同創新中心,浙江杭州 310014)

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響應面法優化機械力輔助提取千里光酚類

俞靜波,王英瑤,蘇為科*

(浙江工業大學綠色制藥協同創新中心,浙江杭州 310014)

以綠原酸和金絲桃苷為得率指標,考察機械球磨參數和提取參數,通過響應面法優化,獲得機械力輔助提取千里光酚類的最佳工藝條件。結果表明:最佳提取工藝參數為填充率27.6%,轉速308 r/min,球磨時間11.5 min。隨后經單次水提10 min,綠原酸得率為(5.040±0.042) mg/g,金絲桃苷得率為(0.485±0.004) mg/g。與乙醇熱回流和水煎法相比,機械力輔助提取法能在較低的溫度,無需使用有機溶劑下即可快速高效地獲得酚類化合物,同時大大提高金絲桃苷的得率,減少提取物中吡咯里西啶類生物堿殘留。

千里光,酚類,機械球磨提取,響應面優化

千里光(SenecioscandensBuch-Ham.)為菊科千里光屬多年生草本植物,主要分布于我國浙江、江蘇、安徽等地[1],具有清熱解毒、殺蟲、明目、涼血、生肌、祛風除濕等功效[2]。其主要成分為富有生物活性的酚類物質和黃酮[3],包括以綠原酸為主的酚酸[4]及以金絲桃苷[5]為主的黃酮。此外,千里光植物中通常含有肝毒性吡咯里西啶類生物堿[3,6],可被醇和酸水提取[7-8],影響千里光提取物的安全使用,中國藥典規定千里光草藥中阿多尼弗林堿含量不超過0.004%[7]。酚酸和黃酮兩類物質多采用熱醇回流[9-10]和水煎法[11-12]直接提取獲得,或采用超聲法[13-14]和微波[15-16]輔助提取獲得,目前尚未見采用機械球磨輔助提取千里光酚類物質的研究報道。傳統醇提耗時久廢液多且成本高;水煎提取時,由于綠原酸穩定性差,在水中加熱時易發生酯鍵遷移形成其同分異構體,聚合成二咖啡酰奎寧酸,或者降解為咖啡酸[17],使其含量減少。超聲提取與微波提取對設備要求較高,不利于產業化,因此迫切需要開發綠色高效的千里光黃酮與酚酸提取方法。機械力輔助提取不但能夠避免使用有機溶劑、顯著縮短提取時間,還能降低提取溫度,大大減少綠原酸在提取過程中的不穩定變化。本實驗將研究一種高效環保的機械球磨輔助提取千里光酚酸和黃酮的方法,以代表性酚酸(綠原酸)和代表性黃酮苷(金絲桃苷)得率為指標,采用響應面法優化機械球磨輔助提取千里光的酚類的工藝,并將優化后的提取工藝與傳統加熱回流提取及水煎提取工藝進行對比。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

千里光干品 購于江西膨氏國藥堂飲片有限公司,制成粗粉(過40目篩)備用;綠原酸對照品、金絲桃苷對照品 購于中國食品藥品檢定研究院;阿多尼弗林堿對照品 購于北京普天同創生物科技有限公司;Ehrlich試劑 購于上海遠幕生物科技有限公司;其它試劑 購于上海國藥集團。

PM 200行星式球磨儀,不銹鋼球磨罐50 mL,不銹鋼球磨珠10 mm 德國Retsch;島津LC-20AT型高效液相色譜儀(色譜柱:Inertsi ODS-3 反相柱、4.6 mm×25 mm、5 μm,DAD檢測器)、UV1800紫外分光光度計 日本島津;SIGMA 3-18KS型高速臺式離心機 德國Sartorius;AS200振蕩篩分儀 德國Retsch。

1.2 實驗方法

1.2.1 機械化學輔助提取千里光酚類 取千里光粉末3 g,球磨(考察球磨球填充率、球磨轉速、球磨時間),粉末充分轉移出后精密加入一定體積溶劑,提取(考察不同濃度的醇溶液、料液比、提取時間、提取溫度),過濾,得提取液并測量體積。

1.2.2 單因素實驗 按1.2.1方法,以機械球磨參數與溶劑提取參數為實驗因素,分別以綠原酸和金絲桃苷得率以及原料粉末粒度(D50)為實驗指標,做單因素實驗,按1.2.5方法測定,對實驗條件進行優化。

1.2.2.1 機械球磨參數考察 在固定的提取條件(料液比1∶30 g/mL,室溫水提20 min)下考察機械球磨各參數的影響。

轉速:固定填充率(20.4%),球磨時間(10 min),考察球磨轉數(200、300、400、500 r/min)對綠原酸和金絲桃苷得率以及原料粉末粒度(D50)的影響。

球磨時間:固定填充率(20.4%),轉速(300 r/min),考察球磨時間(5、10、15、20、25 min)對綠原酸和金絲桃苷得率以及原料粉末粒度(D50)的影響。

填充率:固定轉速(300 r/min),球磨時間(10 min),考察磨球填充率(9.6%、20.4%、30%、39.6%)對綠原酸和金絲桃苷得率以及原料粉末粒度(D50)的影響。

1.2.2.2 提取參數考察 在固定的機械球磨條件(填充率30%,轉速300 r/min,球磨時間10 min)下考察各提取條件的影響。

提取溶劑:固定料液比(1∶30 g/mL),提取溫度(室溫),提取時間(10 min),考察提取溶劑乙醇濃度(0%、19%、38%、57%、76%、95%)對綠原酸和金絲桃苷得率的影響。

提取時間:固定料液比(1∶30 g/mL),提取溫度(室溫),提取溶劑(水),考察提取時間(5、10、20、30、40、50 min)對綠原酸和金絲桃苷得率的影響。

提取溫度:固定提取溶劑(水),料液比(1∶30 g/mL),提取時間(10 min),考察提取溫度(25、35、40、50、60 ℃)對綠原酸和金絲桃苷得率的影響。

料液比:固定提取溶劑(水),提取溫度(室溫),提取時間(10 min),考察料液比(1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50 g/mL)對綠原酸和金絲桃苷得率的影響。

提取次數:固定提取溶劑(水),料液比(1∶40 g/mL),提取溫度(室溫),提取時間(10 min),重復提取2次,分別測提取1、2次的綠原酸和金絲機苷得率。

1.2.3 響應面優化實驗 根據單因素實驗結果,選擇對綠原酸和金絲桃苷得率影響顯著的三個因素:填充率(A)、球磨時間(B)、轉速(C),每個因素設定三個水平進行響應面優化實驗。采用Box-Behnken Design進行響應面實驗設計,因素水平編碼見表1,以綠原酸和金絲桃苷得率為評價指標,其他條件均取實驗條件下最優。

表1 響應面實驗因素水平Table 1 Factors and levels of Box-behnken design

1.2.4 三種提取方法對比

1.2.4.1 熱回流提取法 綠原酸提取中常用的醇濃度為70%,根據文獻[9,18]選取優化的熱回流提取方法:取粉末3 g,加70%乙醇90 mL,85 ℃回流2次,分別為2 h和1 h,過濾,得提取液,測量體積,冷凍干燥后稱重。

1.2.4.2 水煎提取法 根據文獻[11,19]選取優化的水煎提取法:取粉末3 g,加水60 mL,60 ℃加熱20 min,提取2次。過濾,得提取液,測量體積,冷凍干燥后稱重。

1.2.4.3 機械力輔助提取法 取粉末3 g,于填充率27.6%,轉速308 r/min條件下,球磨時間11.5 min,加水120 mL,室溫提取10 min,過濾,得提取液,測量體積,冷凍干燥后稱重。

1.2.5 綠原酸和金絲桃苷含量的測定

1.2.5.1 色譜條件 流速:1 mL/min;檢測波長:325、360 nm;柱溫:35 ℃;進樣量10 μL;流動相:A:0.05%甲酸溶液;B:乙腈;梯度洗脫:0～20 min、B 13%～15%,20～30 min、B 15%～17%,分析45 min;流速:1 mL/min。

1.2.5.2 標準曲線繪制 精密稱取綠原酸對照品7.1 mg,金絲桃苷對照品4.3 mg,分別用甲醇溶解并定容至10 mL,制得質量濃度為0.71 mg/mL的綠原酸對照品溶液和0.43 mg/mL的金絲桃苷對照品溶液。分別取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL稀釋至10 mL,按1.2.5.1色譜條件測定。

圖1 對照品和提取液HPLC圖Fig.1 HPLC chromatograms of the standards and extract注:對照品:325 nm(A),360 nm(B),提取液:325 nm(C),360 nm(D);綠原酸(a),金絲桃苷(b)。

回收率測定:取樣品3份,每份3 g,分別加入80%、100%、120%的綠原酸和金絲桃苷對照品,球磨后(填充率20.4%,300 r/min,10 min),加90 mL水,室溫下提取10 min,提取液按1.2.5.1中色譜條件測定樣品中綠原酸和金絲桃苷的量，根據公式：回收率(%)=(C-A)/B×100(A:樣品中被測成分含量;B:加入對照品量;C:實測值),計算回收率。

表2 相關物質標準品的標準曲線Table 2 Standard curve of standard substances

1.2.5.3 得率計算 提取液樣品稀釋一倍后過0.45 μm膜,按1.2.5.1條件測定。綠原酸和金絲桃苷得率計算公式:

式(1)

式中,C1:根據標準曲線計算所得綠原酸/金絲桃苷的濃度(mg/mL);N:稀釋倍數;V:提取液體積(mL);M:千里光質量(g)。

1.2.6 千里光粉末粒度測定 采用AS200振蕩篩分儀，選用孔徑400、250、200、150、100、65 μm篩對球磨后的千里光粉末進行篩分15 min，振幅為1 mm，取篩上和容器內粉末與樣品的質量比例對篩徑做篩上累計分布圖，用中位徑(D50)表示粉末的粒度大小[20]。

1.2.7 吡咯里西啶生物堿含量測定 吡咯里西啶生物堿(PAs)含量測定方法參照文獻[21]進行。以吸光度A為縱坐標，濃度X(μg/mL)為橫坐標繪制標準曲線，得到吡咯里西啶生物堿回歸方程：Y=0.0494X+0.0023(R2=0.999)，濃度在0.808～8.08 μg/mL范圍內，峰面積與濃度線性關系良好。

式(2)

式中,C2:根據標準曲線計算所得PAs的濃度(mg/mL);N:稀釋倍數；V：提取液體積(mL);m:提取物質量(g)。

1.3 數據處理

實驗均重復3次,數據取平均值,采用Excel,Design Expert 8.0.6軟件對數據進行作圖和統計分析。

2 結果與分析

2.1 綠原酸和金絲桃苷的含量測定方法

綠原酸和金絲桃苷對照品的液相圖譜如圖1(A、B),提取液圖譜如圖1(C、D)。分別選取綠原酸的紫外最大吸收波長325 nm和金絲桃苷的紫外最大吸收波長360 nm為分析波長,在上述色譜條件下,綠原酸和金絲桃苷峰形對稱,尖銳,響應高。提取液圖譜干擾峰少。以綠原酸和金絲桃苷標準品的液相峰面積Y為縱坐標,濃度X(mg/mL)為橫坐標繪制標準曲線,得到綠原酸回歸方程:Y=1.76×107X-6.49×104,金絲桃苷回歸方程:Y=2.4227×107X-58602。綠原酸和金絲桃苷濃度分別在0.0142～0.071 mg/mL,0.0086～0.043 mg/mL范圍內,峰面積與濃度線性關系良好,綠原酸R2=0.9998,金絲桃苷R2=0.9997(表2),且具有較好的回收率(表3)。

表3 回收率實驗Table 3 Recovery rate experiment

2.2 單因素實驗

2.2.1 機械球磨參數考察

2.2.1.1 球磨轉速的影響 結果見圖2、圖3,植物粉末粒度隨球磨轉速的提高而減小,當轉速超過400 r/min時,粉末粒度減小趨勢漸緩(圖2)。然而,綠原酸和金絲桃苷的得率隨轉速的增加均呈現先增后減的趨勢,當轉速為300 r/min時兩種成分得率均達到最佳(圖3)。隨著球磨轉數增大,供能增加,利于細胞壁破碎釋放有效成分,粉末粒度減小,提取率提高;然而轉速過高則產生過多能量,致使體系溫度升高,破壞有效成分,降低提取率。

圖2 轉速對粒度的影響Fig.2 Effect of milling speed on the grain size of plant powders

圖3 轉速對提取液綠原酸和金絲桃苷得率的影響Fig.3 Effect of milling speed on the yield of chlorogenic acid and hyperoside

2.2.1.2 球磨時間的影響 結果見圖4、圖5,球磨時間延長,植物粉末粒度逐漸減小,但趨勢較平緩(圖4)。綠原酸和金絲桃苷含量隨球磨時間的增加均呈現先增加后下降趨勢,球磨10 min兩種成分得率均達到最佳(圖5)。雖然延長球磨時間有利于充分球磨,減小粉末粒度,但也會導致體系內熱量聚集,繼而破壞有效成分。

圖4 球磨時間對粒度的影響Fig.4 Effect of milling time on the grain size of plant powders

圖5 球磨時間對提取液綠原酸和金絲桃苷得率的影響Fig.5 Effect of milling time on the yield of chlorogenic acid and hyperoside

2.2.1.3 磨球填充率的影響 結果見圖6、圖7,填充率對粒度的影響明顯,當填充率較小時,球磨作用有限,粒度減小緩慢;當填充率超過20.4%時,球磨作用增強,粒度減小明顯;進一步增加填充率達39.6%時,磨球運動空間減小,粒度減小趨勢相對減緩(圖6)。綠原酸的得率隨填充率增加而增加,當填充率超過30%時,得率幾乎不再增加;金絲桃苷的得率隨填充率的增加呈現先增后減的趨勢(圖7)。隨著磨球填充率增大,球磨效果提升,粉末粒度減小,提取物得率增加。然而,填充率過大時,磨球運動空間減小,球磨效果增加有限,且摩擦生熱增加,不利于提取物獲得。

圖6 填充率對粒度的影響Fig.6 Effect of filling degree on the grain size of plant powders

圖7 填充率對提取液綠原酸和金絲桃苷得率的影響Fig.7 Effect of filling degree on the yield of chlorogenic acid and hyperoside

2.2.2 提取條件參數考察結果

2.2.2.1 提取溶劑的影響 結果見圖8,在0%～76%乙醇下,綠原酸的得率有微量差異,可能由于不同濃度乙醇溶劑對植物細胞的滲透作用強弱不同,但總體差異不大。當醇濃度為95%時,綠原酸的得率明顯下降。金絲桃苷的得率在不同醇濃度下變化趨勢不明顯。考慮成本及環境因素選用水為提取溶劑。

圖8 醇濃度對提取液綠原酸和金絲桃苷得率的影響Fig.8 Effect of ethanol concentration on the yield of chlorogenic acid and hyperoside

2.2.2.2 提取時間的影響 結果見圖9,當提取時間過短時,不利于綠原酸和金絲桃苷的提取。隨著提取時間延長,綠原酸和金絲桃苷的得率均有所下降,可能與其結構穩定性有關,因此優選提取時間為10 min。

圖9 提取時間對提取液綠原酸和金絲桃苷得率的影響Fig.9 Effect of extract time on the yield of chlorogenic acid and hyperoside

2.2.2.3 提取溫度的影響 結果見圖10,綠原酸和金絲桃苷的得率受提取溫度影響較小:在球磨粉碎后,植物細胞壁破裂,有效成分能夠充分釋放,此時,在足量的提取液中,金絲桃苷和綠原酸成分均能在短時間內(10 min)充分溶出,提取溫度對兩種成分的溶解度未有明顯影響。因此,優選提取溫度為25 ℃(室溫)。

圖10 溫度對提取液綠原酸和金絲桃苷得率的影響Fig.10 Effect of temperature on the yield of chlorogenic acid and hyperoside

2.2.2.4 料液比的影響 結果見圖11,隨著料液比增加,綠原酸和金絲桃苷得率逐漸增加,至1∶40(g/mL)后不再發生明顯變化,因此,優選料液比為1∶40(g/mL)。

圖11 料液比對提取液綠原酸和金絲桃苷得率的影響Fig.11 Effect of solid-liquid ratio on the yield of chlorogenic acid and hyperoside

2.2.2.5 提取次數的影響 結果見圖12,一次提取即能較為充分地提取出兩種成分,由于植物在球磨處理后,細胞壁破碎,細胞內成分在一次提取下就能得到有效溶出。因此,優選提取次數為一次。

圖12 提取次數對提取液綠原酸和金絲桃苷得率的影響Fig.12 Effection of extract times on the yield of chlorogenic acid and hyperoside

2.3 響應面設計

2.3.1 響應面結果 如表4所示,進行17個實驗點(5個中心點)的響應曲面分析。將實驗結果采用Design Expert 8.0.6 軟件進行多元回歸擬合,獲得綠原酸和金絲桃苷得率對填充率(A)、轉速(B)、球磨時間(C)的二次多項式回歸方程為:

綠原酸得率(Y1)=5.00-0.11A+0.12B+0.14C+3.674E-003AB-0.013AC-0.041BC-0.26A2-0.16B2-0.094C2。

金絲桃苷得率(Y2)=0.49-5.770E-003A-3.292E-003B+5.245E-003C-0.011AB-3.647E-003AC-3.224E-003BC-0.025A2-0.039B2-0.024C2。

表4 響應面設計和結果表Table 4 Experimental design and results table

表5 綠原酸得率的二次多項式回歸模型的方差分析Table 5 Analysis of variance table for quadratic model for chlorogenic acid yield

注:**p<0.01為極顯著,*p<0.05為顯著;表6同。

表6 金絲桃苷得率的二次多項式回歸模型的方差分析Table 6 Analysis of variance table for quadratic model for hyperoside yield

對回歸模型進行方差分析和系數顯著性檢驗,結果如表5及表6。模型極顯著,方程失擬項不顯著,表明所建立的二次多項式回歸模型成立。其中因素A、B、C、A2、B2對綠原酸得率影響均極顯著,C2影響顯著，影響大小為轉速>球磨時間>填充率。其中因素A、B、C、AB、A2、B2、C2對金絲桃苷得率影響均極顯著,AC、BC對金絲桃苷得率影響顯著,影響大小為填充率>轉速>時間。

圖13 交互項對綠原酸得率(A,B,C)和金絲桃苷得率(D,E,F)影響的響應面圖Fig.13 Response surfaces representations for chlorogenic acid yield(A,B and C)and hyperoside yield(D,E,F)

如圖13所示,根據Design Expert 8.0.6獲得響應面的3D曲面,分析各因素對綠原酸和金絲桃苷的得率的影響和各因素的交互作用。如圖13A～C,分別固定球磨時間、轉速、填充率為零水平,考察其余兩個條件對綠原酸得率的相互作用。由圖可得,各因素間交互作用的響應面圖呈似山丘狀曲面,存在極大值,各因素對綠原酸得率影響明顯(p<0.05),但因素間兩兩交互作用對綠原酸得率影響不明顯。如圖D～F,分別固定球磨時間、轉速、填充率為零水平,考察其余兩個因素對金絲桃苷得率的相互作用,因素間兩兩交互作用對金絲桃苷的得率影響顯著(p<0.05)。

表7 三種提取方法對比Table 7 Comparison of the three extract methods

以綠原酸得率為指標時,經Design Expert 8.0.6軟件優化,得最佳提取工藝條件:填充率27.61%,轉速327.5 r/min,球磨時間13.55 min,此條件下綠原酸得率為5.083 mg/g;以金絲桃苷得率為指標時,得最佳提取工藝條件:填充率28.83%,轉速296.8 r/min,球磨時間10.6 min,此條件下金絲桃苷得率為0.486 mg/g。兩者的最優條件有少許差異。可能與兩者的溶解度差異及其在千里光中含量不同有關。在Design Expert 8.0.6軟件中設定綠原酸和金絲桃苷的得率均為最大值,得最佳提取工藝條件:填充率28.05%,轉速308.3 r/min,球磨時間11.57 min,此條件下綠原酸得率為5.059 mg/g,金絲桃苷得率為0.485 mg/g。

2.3.2 驗證實驗 為驗證回歸模型的可靠性,響應面法優化千里光中綠原酸和金絲桃苷提取工藝的可行性,在模型所得最優工藝條件下進行實驗。實際操作中,采用填充率27.6%,轉速308 r/min,球磨時間11.5 min,預測綠原酸得率為5.042 mg/g,金絲桃苷得率為0.486 mg/g,三次重復實驗得到的實際值為綠原酸得率為(5.040±0.042) mg/g,金絲桃苷得率為(0.485±0.004) mg/g。與理論值偏差較小,重復性好。

2.4 幾種提取方法的對比

采用優化后的機械球磨輔助提取方法與熱回流醇提取法及水煎提取法對比。結果見表7,球磨輔助提取綠原酸及金絲桃苷的得率均優于其他兩種方法,其中金絲桃苷得率優勢顯著,并且提取液中毒性吡咯里西啶類生物堿(PAs)含量最少。

3 結論

通過Box-Behnken設計實驗,建立了千里光中酚類和黃酮提取工藝參數的二次多項式回歸模型。方差分析結果表明,該模型準確可靠,可用于千里光綠原酸和金絲桃苷提取得率的預測和分析。優化得到千里光中綠原酸和金絲桃苷的最佳工藝條件為:填充率27.6%,轉速308 r/min,球磨時間11.5 min,此條件下綠原酸得率為(5.040±0.042) mg/g,金絲桃苷得率為(0.485±0.004) mg/g。與加熱回流提取和水煎提取法相比,機械球磨提取不但能夠獲得較高得率的綠原酸和金絲桃苷有效成分,還能大大縮減提取時間,提高提取效率,降低提取物中毒性生物堿殘留量。對千里光酚類提取物的應用開發具有較大的指導意義。

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Optimization of mechanically assisted extraction of phenolic compounds inSenecioscandensBuch.-Ham. by response surface methodology

YU Jing-bo,WANG Ying-yao,SU Wei-ke*

(Collaborative Innovation Center of Yangtze River Delta Region Green Pharmaceuticals,Zhejiang University of Technology,Huangzhou 310014,China)

Mechanical parameters and extraction parameters were studied by using the yields of chlorogenic acid and hyperoside as indicators,which afforded the optimal mechanically-assisted extraction condition for phenolic compounds fromSenecioScandensBuch.-Ham. by further employing response surface methodology. The results showed that the optimal mechanical parameters were as follows:milling ball filling degree 27.6%,milling speed 308 r/min and milling time 11.5 min,followed by single extraction in water for 10 min to give chlorogenic acid and hyperoside in (5.040±0.042) mg/g and (0.485±0.004) mg/g yield,respectively. Compared with heat reflux extraction and decoction,mechanically-assisted extraction was more efficient for rapid extraction of phenolic compounds at low extraction temperature without using organic solvent. Besides,the yield of hyperoside was increased substantially with obvious decrease of the residual pyrrolizidine in the extracts.

SenecioScandensBuch.-Ham.;phenolic compounds;mechanically-assisted extraction;response surface methodology

2016-12-12

俞靜波(1985-)，女，博士，講師，主要從事藥物綠色制備技術及機械化學反應技術方面的研究，E-mail：yjb@zjut.edu.cn。

*通訊作者:蘇為科(1961-)，男，博士，教授，主要從事綠色制藥技術方面的研究，E-mail：pharmlab@zjut.edu.cn。

國家自然科學基金資助項目(21406201)；2015浙江省博士后科研項目擇優資助。

TS201.1

B

1002-0306(2017)10-0257-08

10.13386/j.issn1002-0306.2017.10.041