響應面法優(yōu)化白靈菇多糖超聲輔助提取工藝及其體外抗氧化性

王耀輝,王景雪,邱現創(chuàng),李 芳,李 晨

(山西大學生命科學學院,山西太原 030006)

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響應面法優(yōu)化白靈菇多糖超聲輔助提取工藝及其體外抗氧化性

王耀輝,王景雪*,邱現創(chuàng),李 芳,李 晨

(山西大學生命科學學院,山西太原 030006)

利用響應面法優(yōu)化超聲波處理輔助提取白靈菇多糖工藝,并研究其體外抗氧化活性。在單因素實驗的基礎上,根據Box-Behnken實驗設計對超聲波處理時間、提取溫度和液料比進行分析與優(yōu)化,確定了超聲波輔助提取的最佳工藝參數:提取溫度56 ℃、超聲波處理時間45 min、提取的液料比為41∶1,在此條件下進行2次提取,得到白靈菇多糖得率為12.26%,相比于傳統(tǒng)熱水提取法(提取溫度77 ℃、提取時間189.6 min、液料比46∶1、提取次數為2次)多糖得率提高了44.41%。白靈菇多糖體外抗氧化活性實驗表明:超聲波輔助提取法得到的白靈菇多糖在質量濃度4 mg/mL時,清除羥基自由基的能力和DPPH自由基的能力分別為98.39%和60.8%。

白靈菇,多糖,超聲波輔助,響應面分析,抗氧化性

白靈菇(Pleurotusnebrodensis)屬于真菌門側耳科、側耳屬,富含多種生物活性物質,如碳水化合物、蛋白質、膳食纖維、微量元素和維生素等[1]。白靈菇子實體多糖(P.nebrodensispolysaccharides,PNPs)具有增強免疫力、抗腫瘤、抗氧化、治療缺血性心臟病的功效[2-4],比化學藥物毒副作用小,是一種亟待開發(fā)的藥用產品和功能性食品。

目前白靈菇多糖的提取方法主要是熱水提取法[5-6],據報道經過響應面法優(yōu)化熱水提取工藝,得率可達8.93%[7]。近年來關于白靈菇多糖的提取有不同方向的研究:用3%NaOH浸提白靈菇多糖,多糖得率為8.74%[8];酶法提取白靈菇多糖得率可達12.37%[9],但是酶法提取生產成本高,對提取工藝要求苛刻,不能廣泛應用到生產實踐中。超聲波輔助提取多糖的技術因為其能耗較低,所需溶劑較少,生產成本小、提取效率較高且操作簡單,已被廣泛使用。但關于超聲波輔助提取白靈菇多糖的得率較低[10-11],提取條件還有待進一步優(yōu)化。

Box-Behnken實驗設計(BBD)是響應面設計的一種高效、實用的方法,與正交實驗相比,能夠直觀的反映出各因素間的相互作用關系,分析得出各因素的最佳水平,廣泛應用于優(yōu)化多糖及黃酮等生物活性物質的提取工藝中[12-13]。本文在單因素實驗的基礎上,利用響應面法對超聲波輔助提取白靈菇多糖的超聲波處理時間、提取溫度和液料比進行優(yōu)化,并對超聲波輔助提取的白靈菇多糖的抗氧化活性進行研究,為白靈菇資源的進一步開發(fā)利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮白靈菇子實體 由山西省農業(yè)科學院食用菌研究所提供,采摘后清洗,切成薄片,45～60 ℃逐漸升溫烘干,粉碎后,密封儲存?zhèn)溆?1,1-二苯基-2-苦肼基(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH) 美國Sigma公司;無水乙醇、苯酚、無水葡萄糖、濃硫酸、三氯甲烷、正丁醇、硫酸亞鐵等 均為國產分析純。

AR124CN型電子天平 奧豪斯儀器(上海)有限公司;ML-800高速多功能粉碎機 永康市天褀盛世工貿有限公司;WFZ UV-2000型紫外可見分光光度計 尤尼柯(上海)儀器有限公司;RE-52A型旋轉蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠;GZX-9076MBE型電熱鼓風干燥箱 上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠;KQ2200E型超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 白靈菇粗多糖的提取 準確稱取0.300 g白靈菇粉末加入試管中,按照實驗設定條件(超聲波處理時間、提取溫度、液料比)進行超聲波輔助提取,額定功率100 W、工作頻率為40 kHz,提取液3500 r/min離心15 min后取上清液,提取次數為2次,合并上清液,用蒸餾水定容至50 mL,得白靈菇樣品溶液。

精確吸取2 mL白靈菇多糖樣品至10 mL離心管,加4倍體積無水乙醇于4 ℃下過夜沉淀,3500 r/min離心15 min,棄上清,將多糖用80%乙醇洗滌2次,烘干后復溶并定容至25 mL得到白靈菇多糖測定液。

1.2.2 多糖得率的測定 采用苯酚-硫酸法,以葡萄糖為標準品,依據《中華人民共和國藥典》[14]制作標準曲線。精確稱取無水葡萄糖0.9000 g,蒸餾水定容至100 mL,取1 mL溶液定容至100 mL,得到90 μg/mL的葡萄糖標準溶液。分別精確量取標準溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL,置于10 mL具塞試管中,各加水補至1.0 mL,精確加入5%苯酚溶液l mL(現用現配),振蕩混勻,使用移液管精確加硫酸5 mL,搖勻后沸水浴中加熱20 min,冰浴中冷卻5 min,以蒸餾水為空白對照,在488 nm的波長處測定吸光度,以吸光度(A)為橫坐標,葡萄糖糖濃度(ρ)為縱坐標,繪制標準曲線。精確吸取1 mL多糖測定液測定多糖含量。

式中:C多糖濃度(μg/mL);V樣品溶液的體積為50 mL;n:樣品溶液的稀釋倍數為12.5;W:白靈菇樣品干重(g);106單位為μg/g。

1.2.3 單因素實驗 根據1.2.1的方法提取白靈菇多糖,提取條件:固定提取溫度60 ℃、液料比20∶1 (mL/g),考察不同超聲波處理時間(10、20、30、40、50 min)對白靈菇多糖得率的影響;固定超聲波處理時間40 min、液料比20∶1 (mL/g),考察不同提取溫度(40、50、60、70、80 ℃)對白靈菇多糖得率的影響;固定提取溫度60 ℃,超聲波處理時間40 min,考察不同液料比(10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1)對白靈菇多糖得率的影響。

1.2.4 白靈菇多糖超聲波提取工藝的響應面優(yōu)化 在單因素實驗的基礎上,選擇提取溫度(A)、液料比(B)、超聲波處理時間(C)為自變量,白靈菇多糖得率(Y)為響應值,應用Design-Expert.V8.0.6軟件的Box-Behnken實驗原理設計響應面實驗,對超聲波輔助提取白靈菇多糖的工藝條件進行優(yōu)化。實驗設計因素水平及編碼見表1。

表1 Box-Behnken實驗設計的因素及水平Table 1 Factors and levels of Box-Behnken design

1.2.5 白靈菇多糖的純化 粗多糖的制備:將白靈菇多糖提取液3500 r/min離心15 min,旋蒸濃縮后,加入4倍體積無水乙醇,4 ℃沉淀12 h得到粗多糖,烘干復溶。

除蛋白:多糖溶液中加1/3體積Sevag試劑(氯仿∶正丁醇=4∶1),振蕩30 min,3500 r/min離心10 min,取上清,重復數次,直至無變性蛋白層的出現為止。

脫色:多糖溶液中以2 g/100 mL的比例加入活性炭[15],50 ℃脫色2 h,3500 r/min離心30 min去除活性炭。

將除蛋白、脫色的多糖溶液旋蒸濃縮,去除氯仿、正丁醇等有機溶劑,醇沉后60 ℃烘干,即得白靈菇多糖,經苯酚-硫酸法測定多糖含量為89.57%。

1.2.6 體外抗氧化活性的測定 精確稱取純化后的白靈菇多糖0.2000 g,溶于少量60 ℃預熱的蒸餾水中,定容至25 mL,得到8 mg/mL的白靈菇多糖溶液。隨后采用梯度稀釋法將多糖配制成4.0、2.0、1.0、0.5、0.25、0.125 mg/mL的溶液后,以相同質量濃度的VC為陽性對照,進行體外抗氧化活性實驗。

1.2.6.1 羥基自由基的清除能力測定 采用Fetion反應產生·OH,并使用水楊酸顯色的方法測定羥基自由基清除能力[16]。在10 mL離心管中依次加入多糖溶液2 mL,2 mmol/L FeSO42 mL,2 mmol/L水楊酸2 mL,混勻后加入2 mmol/L H2O22 mL啟動反應,充分搖勻,室溫靜置反應30 min,在510 nm處測定吸光度。實驗中,本底組的H2O2由蒸餾水代替、空白組的多糖溶液由蒸餾水代替、對照組用同等濃度的VC代替多糖溶液。

式中:A0為空白液吸光度;A為樣品組吸光度;A1為本底組的吸光度。

1.2.6.2 DPPH自由基清除能力測定 DPPH·清除能力的測定參照Sun等[17]的方法進行。用95%乙醇配制0.2 mmol/L DPPH溶液。在10 mL離心管中依次加入多糖溶液2 mL和DPPH 2 mL,充分搖勻,室溫避光反應15 min,在517 nm處測定吸光度。實驗中,本底組的DPPH由95%乙醇代替、空白組的多糖溶液由蒸餾水代替、對照組用同等濃度的VC代替多糖溶液。

式中:A0為空白液吸光度;A為樣品組吸光度;A1為本底組的吸光度。

2 結果與分析

2.1 標準曲線的建立

以吸光度(A)為橫坐標,葡萄糖濃度(ρ)為縱坐標建立標準曲線,得到線性回歸方程(如圖1):ρ=96.91A-5.079(R2=0.999)。

圖1 苯酚-硫酸法測定葡萄糖的標準曲線Fig.1 The standard curve of dextrose concentration detection by phenol-sulfuric acid method

2.2 單因素實驗

2.2.1 超聲波處理時間對白靈菇多糖得率的影響 從圖2可以看出,在超聲波處理時間10～40 min內,白靈菇多糖得率隨著超聲波處理時間的增大而升高,當超聲波處理時間為40 min時,多糖得率最大,隨著超聲波處理時間進一步增加,多糖得率有所降低。本實驗選取超聲波提取時間30、40、50 min進行響應面優(yōu)化分析。

圖2 超聲波處理時間對多糖得率的影響Fig.2 Effect of ultrasonic treatment time on the extraction yield of PNPs

2.2.2 提取溫度對白靈菇多糖得率的影響 從圖3可以看出,在提取溫度40～80 ℃范圍內,多糖得率呈先升后降的趨勢,在60 ℃左右時多糖得率最高。當溫度較低時,多糖的溶解與滲透能力較低,相同提取時間內白靈菇多糖不能有效溶出。溫度較高時伴隨著超聲波的空化作用,可能引起多糖的裂解,導致多糖得率下降[18]。本實驗選取提取溫度50、60、70 ℃進行響應面優(yōu)化分析。

圖3 提取溫度對白靈菇多糖得率的影響Fig.3 Effect of temperature on the extraction yield of PNPs

2.2.3 液料比對白靈菇多糖得率的影響 從圖4可以看出,在液料比為10∶1～50∶1的范圍內,白靈菇多糖得率變化明顯,在液料比為40∶1時達到相對最大值。液料比也是影響多糖得率的因素之一,多糖在液料比為50∶1時下降可能是由于液料比過大,分散了超聲波對白靈菇粉末的作用,使得在相同提取條件下的多糖得率下降。本實驗選取液料比30∶1、40∶1、50∶1 (mL/g)進行響應面優(yōu)化分析。

圖4 液料比對白靈菇多糖得率的影響Fig.4 Effect of W/M ratio on the extraction yield of PNPs

2.3 響應面實驗設計優(yōu)化工藝參數

2.3.1 響應面實驗設計和結果 根據單因素實驗結果,以提取溫度(A),液料比(B)和超聲波處理時間(C)3個因素為自變量,以白靈菇多糖得率(Y)為響應值,采用Design-Expert.V8.0.6軟件進行三因素三水平的實驗設計。實驗方案及實驗結果見表2。對表2中數據進行回歸擬合,得到二次多項式回歸模型:Y=12.08-0.66A+0.058B+0.43C+0.012AB-0.30AC+0.038BC-1.03A2-0.31B2-0.57C2利用Design-Expert.V8.0.6軟件對實驗所得數據進行方差分析,結果見表3,可以看出:p模型<0.0001,表明模型極顯著;p失擬項=0.3116>0.05,表明實驗以外的其他因素對本實驗的影響小;模型的R2為97.51%,證明所選用的二次回歸模型成立,可用于預測不同提取條件下白靈菇多糖的得率。A、C、A2、C2對多糖得率影響極顯著(p<0.01)，AC、B2對多糖得率影響顯著(p<0.05)。且由各因素一次項的F值可知:影響白靈菇多糖得率的大小順序:提取溫度>超聲波處理時間>液料比。

表3 白靈菇多糖提取回歸模型的方差分析Table 3 Analysis of variance for the established regression model

注:*,p<0.05,差異顯著;**,p<0.01,差異極顯著。

表4 超聲波輔助提取法與熱水提取法對白靈菇多糖提取的比較Table 4 Comparison of ultrasonic-assisted extraction method and hot-water extraction method for the extraction of PNPs

表2 白靈菇多糖得率的響應面實驗方案及結果Table 2 Experiment design and results of response surface method analysis

2.3.2 模型各因素交互作用分析 為了直觀分析各因素交互作用對白靈菇多糖得率的影響,在一個因素為“0”水平的情況下,分析交互項對得率的影響。由回歸方程得出對應的響應面圖,如圖5所示。

圖5 各因素兩兩交互作用對白靈菇多糖得率的響應面圖和等高線圖Fig.5 Response surface and contour plots showing the interactive effects of on the extraction yield of PNPs

圖6 超聲波輔助提取的白靈菇多糖對羥基自由基的清除能力Fig.6 Hydroxyl radicals scavenging activity of PNPs

從圖5可以看出,圖5a響應面坡度最大,其次是圖5b,圖5c，超聲波溫度與提取時間對多糖的提取影響較大。

2.3.3 超聲波輔助提取白靈菇多糖最佳提取條件的確定 由Design-Expert V8.06軟件分析出超聲波輔助提取白靈菇多糖的最佳提取條件為提取溫度56.07 ℃、超聲波處理時間44.87 min、液料比41.15∶1 (mL/g),回歸方程預測值為12.31%。為了驗證該方法的可行性,結合實際的操作情況,在提取溫度56 ℃、超聲波處理時間45 min、液料比41∶1的條件下重復3次,得到白靈菇多糖得率為12.26%±0.12%,與方程預測值相吻合。

為了對比超聲波輔助提取與傳統(tǒng)熱水提取法的多糖得率,本實驗選用李敏杰[7]等優(yōu)化的熱水提取白靈菇多糖的方法進行提取。由表4結果可知,超聲波輔助提取法比熱水提取法多糖得率提高44.41%。

2.4 體外抗氧化活性的測定

2.4.1 羥基自由基清除能力 由圖6可知:白靈菇多糖對·OH清除能力隨樣品的質量濃度的增加而升高,但其清除能力低于相同質量濃度的VC對·OH清除能力。白靈菇多糖在4 mg/mL時對·OH清除能力為98.39%。而陳晉明等[19]的熱水提取法提取的白靈菇多糖(純度為54.62%)為2 mg/mL時,對羥基自由基清除率為94.56%。

2.4.2 DPPH自由基清除能力 由圖7可知:白靈菇多糖對DPPH自由基的清除能力隨樣品的質量濃度的增加而增加,在4 mg/mL時為60.8%,但其清除能力低于相同質量濃度的VC。而陳晉明等[19]的熱水提取法提取的白靈菇多糖(純度為54.62%)2 mg/mL時,對DPPH自由基清除率為72.32%。

圖7 超聲波輔助提取的白靈菇多糖對DPPH自由基的清除能力Fig.7 DPPH radicals scavenging activity of PNPs

研究報道白靈菇多糖具有較好的抗氧化作用[19-20]。本實驗中純化得到的白靈菇多糖純度為89.57%，相比于陳晉明等[19]的研究多糖純度高,但是多糖的抗氧化能力卻相對較低。可能是由于過分脫除多糖提取物結合態(tài)蛋白,導致其抗氧化活性的降低[21]。多糖的抗氧化機理目前還不明確,還有待進一步研究。

3 結論

本研究在單因素實驗的基礎上,采用響應面實驗優(yōu)化白靈菇子實體多糖的超聲提取工藝:提取溫度56 ℃、超聲波處理時間45 min、液料比41∶1。在此條件下,白靈菇子實體多糖得率為12.26%,比熱水提取法高44.41%,明顯縮短了提取時間。本文得率雖與馬淑鳳等[9]的酶解法提取多糖相近,但操作方便,極大的降低了生產成本,具有較高的應用價值。體外抗氧化實驗表明,本實驗條件下超聲波輔助提取的白靈菇多糖在質量濃度4 mg/mL時,清除·OH的能力和DPPH自由基的能力分別為98.39%和60.8%,具有較高的抗氧化能力。

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Optimization of ultrasonic-assisted extraction process of polysaccharides fromPleurotusnebrodensisby response surface methodology and evaluation of antioxidant activityinvitro

WANG Yao-hui,WANG Jing-xue*,QIU Xian-chuang,LI Fang,LI Chen

(College of Life Science,Shanxi University,Taiyuan 030006,China)

Response surface analysis method was applied to optimize the ultrasonic-assisted extraction process ofPleurotusnebrodensispolysaccharides(PNPs),and evaluate the antioxidant activitiesinvitroof PNPs. On the basis of single-factor test,the ultrasonic treating time,extraction temperature and the ratio of water volume to raw material weight(W/M ratio)were analyzed and optimized by the Box-Behnken design. The optimized parameters of the ultrasonic-assisted extraction technology were obtained as follows:extraction temperature was 56 ℃,ultrasonic treating time was 45 min,W/M ratio was 41∶1,extraction frequency was 2 times,and the extraction rate of the PNPs was 12.26%. Compared with the hot water extraction method which the extraction temperature was 77 ℃,extraction time was 189.6 min,W/M ratio was 46∶1,extraction frequency was 2 times,the extraction rate of the polysaccharides was increased by 44.41%. Antioxidant activitiesinvitroof the PNPs indicated that the hydroxyl racials and DPPH racials scavenging rates of PNPs were 98.39% and 60.8% respectively when its concentration was at 4 mg/mL.

Pleurotusnebrodensis;polysaccharides;ultrasonic-assisted extraction;response surface methodology;antioxidant activity

2017-01-03

王耀輝(1990-)，男，碩士研究生，研究方向：植物活性成分研究，E-mail：15735171756@163.com。

*通訊作者:王景雪(1961-)，女，博士，教授，研究方向：植物活性成分研究，E-mail：jingxuew@sxu.edu.cn。

TS201.1

B

1002-0306(2017)10-0247-06

10.13386/j.issn1002-0306.2017.10.039