菠蘿蜜果皮黃酮提取工藝優化及比較

段宙位,何 艾,竇志浩,王世萍,劉 佳,謝 輝,*

(1.海南省農業科學院農產品加工設計研究所,海南海口 571100; 2.海南大學食品學院,海南海口 570228)

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菠蘿蜜果皮黃酮提取工藝優化及比較

段宙位1,何 艾1,竇志浩1,王世萍1,劉 佳2,謝 輝1,*

(1.海南省農業科學院農產品加工設計研究所,海南海口 571100; 2.海南大學食品學院,海南海口 570228)

為篩選適合菠蘿蜜果皮黃酮的提取方法,以得率為評價指標,應用酶法和有機溶劑浸提法提取其果皮中的黃酮類化合物,在單因素基礎上,通過正交實驗,優化提取工藝,并對兩種提取方法結果進行比較評價。結果表明,酶法提取菠蘿蜜果皮黃酮最佳工藝條件為：果膠酶用量300 U/g、乙醇濃度80%(v/v)、溫度55 ℃、pH5.5、底物質量濃度45 g/L,時間2.0 h;有機溶劑浸提最佳工藝條件為：乙醇濃度80%(v/v),溫度55 ℃,料液比1∶20(g/mL),時間2.5 h;酶法提取黃酮類化合物得率和純度分別為4.98%、12.60%,高于有機溶劑浸提法的3.05%、8.92%,提取物的抗氧化性強于有機溶劑浸提法,說明酶法提取菠蘿蜜果皮黃酮優于傳統有機溶劑浸提法。

菠蘿蜜果皮,黃酮,提取,抗氧化活性

菠蘿蜜又稱苞蘿、牛肚子果,是桑科植物木菠蘿(ArtocarpusheterophyllusLam.)的果實,有“熱帶水果皇后”之稱[1]。據統計,每年我國熱區菠蘿蜜產量接近120萬噸[2],菠蘿蜜產量高,果實碩大營養豐富,以鮮食為主,在此過程中產生大量的副產物——果皮、果腱等約占整果的40%～60%[3],這些物質常被丟棄,既浪費資源又污染環境。研究表明,菠蘿蜜果皮中含有糖類、多酚、黃酮、果膠等多種具有生物活性的營養物質[4],應用前景廣闊。

黃酮主要存在于植物根、葉、皮等組織中,具有抗凝血、降血糖、抗氧化、抗腫瘤、抗抑郁等[5-6]功效。國內外關于黃酮的提取研究報道較多,主要有溶劑萃取法[7],微波、超聲波和酶輔助提取法[8]等,關于菠蘿蜜黃酮的研究也有相關報道,如郝倩等[8]用溶劑浸提法從菠蘿蜜葉中提取黃酮,提取率為5.796%;鄧夢琴等采用溶劑浸提法[9]和超聲波輔助提取法[10]從菠蘿蜜果皮中提取黃酮,提取率分別為20.35%和6.92%。然而,關于酶輔助提取菠蘿蜜果皮黃酮及提取工藝比較的研究較少,而酶法(主要是纖維素酶、果膠酶、蛋白酶等)提取黃酮,具有反應條件溫和、效率高等優點。本實驗以菠蘿蜜果皮為原料,應用酶法提取其中的黃酮類化合物,比較酶法與傳統方法提取菠蘿蜜果皮黃酮得率、純度及體外抗氧化性,以期篩選出適合菠蘿蜜果皮黃酮的提取方法,為綜合利用菠蘿蜜資源提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

菠蘿蜜 購于海口市水果市場;1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、2,2-聯氮-雙-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二銨鹽(ABTS)、過硫酸鉀 Sigma公司;果膠酶(100000 U/g)、纖維素酶(50000 U/g) 江蘇銳陽生物技術有限公司。

TU-1810分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司;TH2-C-1搖床 太倉市實驗設備廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 菠蘿蜜果皮黃酮提取工藝流程 菠蘿蜜果皮→清洗→烘干(55 ℃)→粉碎→過篩(40目)→浸提(酶法和有機溶劑浸提法)→過濾→粗提物。

1.2.2 菠蘿蜜果皮黃酮得率的測定

1.2.2.1 黃酮含量的測定 參考硝酸鋁顯色法[11]。移取0.25 mL樣液于10.0 mL比色管中,用蒸餾水定容至5.0 mL。加入5%亞硝酸鈉溶液0.5 mL,混勻靜置6 min;再加入10%硝酸鋁溶液0.5 mL,混勻靜置6 min;再向其中加入1 mol/L氫氧化鈉溶液4.0 mL,混勻靜置15 min。同時用蒸餾水做空白對照,于510 nm波長處測定吸光度。

1.2.2.2 標準方程的建立 按照上述方法測定蘆丁標準品吸光值,以蘆丁質量濃度為橫坐標,吸光度為縱坐標,建立標準曲線方程:y=11.975x-0.0325,R2=0.9996,蘆丁標準溶液在0.02～0.10 mg/mL范圍內線性關系良好。

1.2.2.3 得率計算 按照公式y(%)=(A+0.0325)×40×V×100/(11.975×1000m)計算得率,式中:y為黃酮得率;A為樣液吸光值;m為樣品質量(g);40為稀釋倍數;V為樣液體積。

1.2.3 酶輔助有機溶劑提取菠蘿蜜果皮黃酮

1.2.3.1 酶的篩選 稱取20 g菠蘿蜜果皮樣品,按酶活力400 U/g添加果膠酶、纖維素酶、混合酶(纖維素酶活力∶果膠酶活力=1∶1),用80%乙醇(v/v),在底物質量濃度45 g/L,50 ℃,pH5條件下浸提3.0 h,測定樣液吸光值,計算得率。

1.2.3.2 乙醇濃度對黃酮得率的影響 變動乙醇濃度(50%、60%、70%、80%、90%,v/v),按酶活力400 U/g添加果膠酶,在50 ℃、pH5、底物質量濃度45 g/L下浸提3.0 h菠蘿蜜果皮,測定上清液吸光度,計算得率。

1.2.3.3 溫度對黃酮得率的影響 變動溫度(40、45、50、55、60 ℃),按酶活力400 U/g添加果膠酶,用80%乙醇(v/v),在底物質量濃度45 g/L,pH5條件下浸提菠蘿蜜果皮3.0 h,測定上清液吸光度,計算得率。

1.2.3.4 pH對黃酮得率的影響 調節浸提液pH(4.5、5.0、5.5、6.0、6.5),按酶活力400 U/g添加果膠酶,用80%乙醇(v/v),在底物質量濃度45 g/L,55 ℃條件下浸提菠蘿蜜果皮3.0 h,測定上清液吸光度,計算得率。

1.2.3.5 底物質量濃度對黃酮得率的影響 變動底物質量濃度(25、45、65、85、105 g/L),按酶活力400 U/g添加果膠酶,用80%乙醇(v/v),在55 ℃,pH5.5條件下浸提菠蘿蜜果皮3.0 h,測定上清液吸光度,計算得率。

1.2.3.6 酶用量對黃酮得率的影響 添加不同量果膠酶(100、200、300、400、500 U/g)于浸提液中,用80%乙醇，在底物質量濃度65 g/L,55 ℃,pH5.5條件下浸提菠蘿蜜果皮3.0 h,測定上清液吸光度,計算得率。

1.2.3.7 時間對得率的影響 變動提取時間(1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 h),按酶活力300 U/g添加果膠酶,用80%乙醇(v/v),在底物質量濃度65 g/L,55 ℃,pH5.5條件下浸提菠蘿蜜果皮3.0 h,測定上清液吸光度,計算得率。

1.2.3.8 酶輔助有機溶劑提取菠蘿蜜果皮黃酮工藝優化 選擇影響菠蘿蜜果皮黃酮得率較大的四個因素乙醇濃度、溫度、pH、底物質量濃度做正交實驗,因素水平如表1所示。

表1 酸輔助提取正交實驗因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogoral test of enzyme extraction

1.2.4 有機溶劑浸提菠蘿蜜果皮黃酮工藝優化 根據菠蘿蜜果皮黃酮的提取條件,選定乙醇濃度、溫度、時間、料液比作為有機溶劑浸提法的考察因素,以得率為評價指標,進行單因素預實驗。參照預實驗結果,選擇影響菠蘿蜜果皮黃酮得率的四個因素乙醇濃度、溫度、料液比、時間做正交實驗,因素水平如表2所示。

表2 有機溶劑提取正交實驗因素與水平Table 2 Factors and levels forms of orthogonal test of solvent extraction

1.2.5 體外抗氧化實驗

1.2.5.1 DPPH自由基清除率的測定 參考段宙位等[12]的方法,略有修改。取2 mL不同濃度的樣品溶液,加入2 mL 6.5×10-5mol/L DPPH溶液,混合后在室溫下避光反應30 min,以80%乙醇調零,在517 nm處測其吸光度Ai;同時測定2 mL 80%乙醇與2 mL樣品溶液混合后的吸光度Aj以及2 mL DPPH溶液與2 mL 80%乙醇混合后的吸光度A0。

清除率(%)=[1-(Ai-Aj)]/A0×100

1.2.5.2 ABTS自由基清除率的測定 參考Dudonne等[13]的方法,略有修改。取5.0 mL、7 mmol/L的ABTS溶液,加入88.0 μL、140 mmol/L的過硫酸鉀,置于暗處反應12～16 h,形成ABTS自由基儲備液。在734 nm處,用體積分數為70%(v/v)乙醇將ABTS自由基儲備液稀釋至吸光度為0.70±0.02,備用。準確量取0.1 mL不同濃度樣品溶液,加入3.9 mL ABTS+·溶液,混勻,在室溫下反應6 min,于734 nm處測定吸光度(AE)。同時吸取3.9 mL ABTS+·溶液,加入0.1 mL 70%的乙醇溶液于734 nm處測定吸光度(AB)。ABTS自由基清除率按下式計算:

ABTS自由基清除率(%)=[1-(AB-AE)]/AB×100

式中:AB空白樣吸光度;AE為試樣吸光度。

1.3 數據處理

所有實驗數據均為重復3次實驗的平均值,采用Excle 2007進行數據統計分析,Origin 8.5軟件繪制圖形。

2 結果與分析

2.1 酶輔助有機溶劑提取菠蘿蜜果皮黃酮

2.1.1 酶的篩選 由圖1可知,采用果膠酶輔助乙醇提取菠蘿蜜果皮黃酮,得率最高,這是因為菠蘿蜜果皮中果膠含量較多,根據酶的專一性特性,果膠酶較易破壞菠蘿蜜果皮中果膠的組織結構,便于黃酮溶出。因此,選擇果膠酶輔助提取菠蘿蜜果皮黃酮類化合物。

圖1 酶種類變化對菠蘿蜜果皮黃酮得率的影響Fig.1 Effect of different enzyme on the yield of flavonoid from jackfruit peel

2.1.2 乙醇濃度對黃酮得率的影響 由圖2可知,隨著乙醇濃度增加得率先增加后降低,80%(v/v)乙醇下菠蘿蜜果皮黃酮得率取得最大值。這可能是因為植物中黃酮的極性與結構不同,菠蘿蜜果皮黃酮極性與80%(v/v)乙醇極性相當,易溶于80%(v/v)乙醇,此時若變化乙醇濃度則改變了乙醇極性,不利于菠蘿蜜果皮黃酮的溶出。

圖2 乙醇濃度對菠蘿蜜果皮黃酮得率的影響Fig.2 Effect of ethanol concentration on the yield of flavonoid from jackfruit peel

圖3 溫度對菠蘿蜜果皮黃酮得率的影響 Fig.3 Effect of temperature on the yield of flavonoid from jackfruit peel

2.1.3 溫度對黃酮提取率的影響 由圖3可知,隨著溫度升高得率先增加后降低,55 ℃下,菠蘿蜜果皮黃酮得率最高。這可能是因為果膠酶破壞菠蘿蜜果皮(果膠)結構的最適溫度為55 ℃,在最適溫度下酶活力最強,升高或降低溫度都會降低酶的活力,減緩催化反應進程,引起得率降低。

2.1.4 pH對黃酮提取率的影響 由圖4可知,pH5.5時,菠蘿蜜果皮黃酮得率最高,調高或調低pH得率均降低。這是因為果膠酶在pH5.5條件下,較易破壞菠蘿蜜果皮中果膠組織結構,此時催化反應能力最強,若改變pH,均會降低果膠酶破壞菠蘿蜜果皮細胞壁能力,進而引起得率下降。

圖4 pH對菠蘿蜜果皮黃酮得率的影響Fig.4 Effect of pH value on the yield of flavonoid from jackfruit peel

2.1.5 底物質量濃度對黃酮提取率的影響 由圖5可知,當底物質量濃度為65 g/L時,菠蘿蜜果皮黃酮得率基本取得最大值。這是因為當底物質量濃度大于65 g/L時,隨著溶劑比例減小,溶劑未能充分萃取菠蘿蜜果皮黃酮,黃酮溶出減少;當底物質量濃度小于65 g/L時,溶劑萃取菠蘿蜜果皮黃酮趨于飽和,得率變化不大。

圖5 底物質量濃度對菠蘿蜜果皮黃酮得率的影響Fig.5 Effect of substrate concentration on the yield of flavonoid from jackfruit peel

2.1.6 酶用量對黃酮提取率的影響 由圖6可知,隨著果膠酶用量增加,菠蘿蜜果皮黃酮得率先增加后基本不變。這是因為酶用量300 U/g時能保證果皮果膠酶解完全,增加酶用量對黃酮浸提影響不大。因此,酶用量選擇300 U/g為宜。

圖6 酶用量對菠蘿蜜果皮黃酮得率的影響Fig.6 Effect of enzyme dose on the yield of flavonoid from jackfruit peel

2.1.7 酶解時間對黃酮提取率的影響 由圖7可知,浸提時間大于2 h時,菠蘿蜜果皮黃酮得率基本不變。這是因為菠蘿蜜果皮黃酮溶出是一個緩慢-動態過程,浸提時間2 h時,黃酮溶出趨于完全。因此,浸提時間選擇2 h為宜。

圖7 時間對菠蘿蜜果皮黃酮得率的影響Fig.7 Effects of different extraction time on the yield of flavonoid from jackfruit peel

2.1.8 正交實驗 由表3可知,影響果膠酶輔助有機溶劑提取菠蘿蜜果皮黃酮的四個因素次序為A>B>D>C,最優水平A2B2C1D2,即乙醇濃度80%(v/v),溫度55 ℃,pH5.5,底物質量濃度45 g/L。按照A2B2C1D2條件進行驗證性實驗,菠蘿蜜果皮黃酮得率為4.98%(以干重計,w/w),高于鄧夢琴等[9]從菠蘿蜜果皮中提取黃酮得率為2.35%的研究結果,說明果膠酶輔助提取菠蘿蜜果皮黃酮效果較好。

表3 酶法提取菠蘿蜜果皮黃酮結果Table 3 Result of flavonoid with enzyme extraction from jackfruit peel

2.2 有機溶劑提取正交實驗

由表4可知,影響有機溶劑提取菠蘿蜜果皮黃酮得率的四個因素次序為A>B>C>D,最優水平A2B2C3D2,即乙醇濃度80%(v/v),溫度55 ℃,料液比1∶20 (g/mL),時間2.5 h。按照A2B2C3D2條件補加實驗,得黃酮得率為3.05%(以干重計,w/w),低于酶法輔助乙醇提取菠蘿蜜果皮黃酮的得率。

表4 有機溶劑提取菠蘿蜜果皮黃酮結果Table 4 Result of flavonoid with solvent extraction from jackfruit peel

2.3 兩種提取方法結果比較

由上述結果可知,酶法輔助提取菠蘿蜜果皮黃酮類化合物時間為2.0 h,低于有機溶劑浸提法的2.5 h;得率為4.98%(w/w),高于有機溶劑浸提法的3.05%(w/w);純度為12.60%,高于有機溶劑浸提法的8.92%,說明采用酶法提取黃酮耗時較短,得率、純度較高,優于有機溶劑浸提法。酶法輔助提取菠蘿蜜果皮黃酮浸提物清除DPPH與ABTS自由基IC50分別為0.041、0.092 mg/mL,低于有機溶劑浸提法的0.072、0.116 mg/mL,說明酶法提取菠蘿蜜果皮黃酮浸提物的抗氧化性強于有機溶劑浸提法。綜上,酶法輔助提取菠蘿蜜果皮黃酮優于傳統有機溶劑浸提法。

3 結論

以菠蘿蜜果皮為原料,采用酶法和傳統溶劑浸提法提取黃酮類化合物,在單因素的基礎上,通過正交實驗優化提取工藝。比較了酶法與有機溶劑浸提法提取菠蘿蜜果皮黃酮類化合物得率、純度與體外抗氧化性。酶法提取菠蘿蜜果皮黃酮最佳工藝條件為果膠酶用量300 U/g、乙醇濃度80%(v/v)、溫度55 ℃、pH5.5、底物質量濃度45 g/L、時間2.0 h;傳統有機溶劑提取最佳條件為乙醇濃度80%(v/v),溫度55 ℃,料液比1∶20(g/mL),時間2.5 h;酶法提取黃酮類化合物得率和純度分別為4.98%、12.60%,高于有機溶劑浸提法的3.05%、8.92%,提取物的抗氧化性強于有機溶劑浸提法,說明酶法提取菠蘿蜜果皮黃酮優于傳統有機溶劑浸提法。

[1]Jagtap U B,Waghmare S R,Lokhande V H,et al.Preparation and evaluation of antioxidant capacity of Jackfruit(ArtocarpusheterophyllusLam.)wine and its protective role against radiation induced DNA damage[J].Industrial Crops and Products,2011,34(3):1595-1601.

[2]張星啟,宋賢良,陳穎森,等. 響應面優化菠蘿蜜果皮果膠的酶法提取工藝[J].廣東農業科學,2015,11(3):89-93.

[3]姚定.菠蘿蜜果皮果膠提取及特性研究[D].合肥:安徽農業大學,2009.

[4]Tan Y,Li H,Lai W,et al. Crude Dietary Polysaccharide Fraction Isolated from Jackfruit Enhances Immune System Activity in Mice[J]. Journal of Medicinal Food,2013,16(7):663-668.

[5]Lin Yuheng,Shen Xiaolin,Yuan Qipeng,et al. Microbial biosynthesis of the anticoagulant precursor 4-hydroxy-coumarin[J]. Nature Communications,2013(4):2603.

[6]Baliga M S,Shivashankara A R,Haniadka R,et al. Phytochemistry,nutritional and pharmacological properties ofArtocarpusheterophyllusLam(jackfruit):A review[J]. Food Research International,2011,44(7):1800-1811.

[6]宋佳. 蘆筍廢棄物中黃酮化合物的純化及性質研究[D]. 無錫:江南大學,2012.

[7]羅堾子,張弘,鄭華,等.響應面分析法優化微波提取密蒙花總黃酮工藝[J]. 中國食品學報,2011,11(8):79-86.

[8]郝倩. 菠蘿蜜葉黃酮類化合物的提取及其浸膏的應用[D].北京:北京林業大學,2014.

[9]鄧夢琴,何夏怡,何慕怡,等.響應面法優化菠蘿蜜果皮黃酮提取工藝[J].食品工業科技,2016,37(5):222-227.

[10]鄧夢琴,林曉瑛,張明,等. 超聲波輔助提取菠蘿蜜果皮黃酮工藝優化[J]. 食品工業科技,2016,37(24):288-293.

[11]李石容.金花茶茶花黃酮類化合物的分離純化及抗氧化活性的初步研究[D]. 湛江:廣東海洋大學,2012.

[12]段宙位,申鉉日,李鵬,等. 羅非魚尾色素中抗氧化成分的提取及活性研究[J]. 食品工業科技,2012,33(10):143-150.

[13]Dudonne S,Vitrac X,Coutiere P,et al.Comparative study of antioxidant properties and total phenolic content of 30 plant extracts of industrial interest using DPPH,ABTS,FRAP,SOD,and ORAC assays[J].Journal of Agriculture and Food Chemistry,2009,57(5):1768-1774.

Optimization and comparison of extraction technology of flavonoids from jackfruit peel

DUAN Zhou-wei1,HE Ai1,DOU Zhi-hao1,WANG Shi-ping1,LIU Jia2,XIE Hui1,*

(1.Institute of Processing & Design of Agroproducts,Hainan Academy of Agricultural Science,Haikou 571100,China;2.Collage of Food Science and Technology,Hainan University,Haikou 570228,China)

The aim was to select the suitable method for extracting flavonoids from jackfruit peel,used extraction yield as evaluation index,the flavonoids was extracted by enzymatic assistant ethanol and organic solvent methods.Based on single factor test,an orthogonal design was applied to optimize extraction process.Comparison of the two methods was evaluated for extraction results.The optimum results for the extraction of flavonoids were achieved by ethanol and pectinase assistant extraction. The subsidiary conditions were as follows:additional amount of pectinase 300 U/g,extraction solvent 80%(v/v)ethanol,temperature 55 ℃,pH value 5.5,time 2.0 h and the substrate concentration 45 g/L.The optimum conditions of organic solvent were found to be extraction at 55 ℃ for 2.5 h using 80% aqueous ethanol with a solid-to-liquid ratio of 1∶20(g/mL).The highest extraction yield and purity of pectinase enzymolysis method were 4.98% and 12.60%,much higher than 3.05% and 8.92% of traditional extraction by organic solvent. Meanwhile,the extraction of enzymatic method revealed stronger antioxidant activity. The results of experiment indicated that the pectinase enzymolysis method was superior to traditional extraction by organic solvent.

jackfruit peel;flavonoids;extraction;antioxidant activity

2016-11-30

段宙位(1985-)，男，碩士，助理研究員，研究方向：營養與功能食品研究，E-mail:universeduan@163.com。

*通訊作者:謝輝(1975-)，男，碩士，副研究員，研究方向：農產品加工與保鮮，E-mail:790586793@qq.com。

海南省省屬科研院所技術開發研究專項(KYYS-2015-10)。

TS255.3

B

1002-0306(2017)10-0242-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.10.038