解淀粉芽孢桿菌誘變菌株NCU116-1的生物學特性及其酶系分析

趙榮彬,鄢祥輝，龍俊敏,余 平,*,曾 誠,歐陽少林,曾哲靈,*

(1.南昌大學資源環境與化工學院,江西南昌 330031;2.南昌大學食品科學與技術國家重點實驗室,江西南昌 330047;3.江西省食用藥食同源植物資源高值化利用重點實驗室,江西南昌 330031;4.江西生物科技職業學院動物科學系,江西南昌 330200;5.南昌大學第一臨床醫學院,江西南昌 330031;6.吉安林業科學研究所,江西吉安 343000)

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解淀粉芽孢桿菌誘變菌株NCU116-1的生物學特性及其酶系分析

趙榮彬1,2,3,鄢祥輝1，龍俊敏4,余 平1,2,3,*,曾 誠5,歐陽少林6,曾哲靈1,2,3,*

(1.南昌大學資源環境與化工學院,江西南昌 330031;2.南昌大學食品科學與技術國家重點實驗室,江西南昌 330047;3.江西省食用藥食同源植物資源高值化利用重點實驗室,江西南昌 330031;4.江西生物科技職業學院動物科學系,江西南昌 330200;5.南昌大學第一臨床醫學院,江西南昌 330031;6.吉安林業科學研究所,江西吉安 343000)

以解淀粉芽孢桿菌誘變菌株NCU116-1為出發菌,對其生物學特性和培養特征進行研究。并用國標法、羧甲基纖維素糖化法等對該突變株的主要酶系的發酵時間和酶學性質進行分析測定。結果表明,淀粉酶、糖化酶和纖維素酶的最佳發酵時間是40 h;中性蛋白酶最佳發酵時間是44 h,果膠酶最佳發酵時間是42 h。中性蛋白酶在50 ℃時活力最高,Mn2+對其有激動作用,最適宜酶解溫度為40～45 ℃、適宜酶解pH為8;糖化酶在35 ℃時活力最高,Cu2+、Fe3+和Mn2+對其有激動作用,最適宜酶解溫度為35 ℃左右、適宜酶解pH為8.0;果膠酶在40 ℃時活力最高,Mn2+和Ca2+對其有激動作用,最適宜酶解溫度為35～40 ℃、適宜酶解pH為6.0;纖維素酶在50 ℃時活力最高,Ca2+和Cu2+對其有激動作用,最適宜酶解溫度為40～45 ℃,適宜酶解pH為7.0。該菌株生產的胞外酶符合水酶法提取植物油脂復合酶制劑的要求,本文為該類菌株的應用奠定理論基礎。

解淀粉芽孢桿菌,復合酶,發酵時間,酶系分析

出于對食品安全、環境保護和油料資源綜合利用等方面的深度需求,水酶法提取植物油脂技術已成為國內外研究熱點。水酶法提取植物油脂的原理是:油料經過機械破碎后,加入生物酶充分破壞油料細胞組織釋放油脂,最后經離心分離得到植物油脂和水解蛋白質[1]。根據其原理,能夠破壞植物油料細胞組織的生物酶(除脂肪酶外)都可應用于水酶法提取植物油脂,多種生物酶的復合水解更有利于植物油脂的釋放。該觀點已被相關的文獻報道證實,例如慧君等[2]將中性蛋白酶、果膠酶、纖維素酶、β-葡聚糖酶等用于水酶法提取菜籽油,結果顯示上述幾種酶都有提高油脂提取率的作用,其中中性蛋白酶作用最為明顯。趙瑋等[3]將蛋白酶、纖維素酶、淀粉酶及這些酶的混合酶等用于水酶法提取玉米胚油,結果顯示纖維素酶∶淀粉酶為4∶3的混合酶提油效果最好。劉志強等[4]將蛋白酶、纖維素酶、果膠酶和復合酶(蛋白酶∶纖維素∶果膠=5∶3∶2)用于水酶法提取菜籽油,結果顯示使用復合酶的提取效果最好,油脂提取率與蛋白質提取率較空白組(無酶)分別提高了30%和20%,較使用單一種酶分別提高了5%和6%以上。目前水酶法使用的復合酶基本上是由幾種純種酶制劑按一定比例配制而成,該方法制得的復合酶生產工藝復雜、成本高。因此,研究選育酶系豐富、產酶量大且不產脂肪酶的菌株,并由該菌株生產成本低、酶系全面的復合酶制劑是當前水酶法提取植物油脂研究的迫切任務。

解淀粉酶芽孢桿菌NCU116-1是由本課題組從樟樹籽仁油生產廢渣中篩選并通過物理誘變和化學誘變后得到的產中性蛋白酶能力強、產脂肪酶能力很弱的耐中碳鏈脂肪酸型菌株,非常適用于水酶法提取樟樹籽仁油等中碳鏈油脂[5-6]。將該菌株生產的酶制劑用于水酶法提取樟樹籽仁油工藝中,可顯著提高樟樹籽仁油和水解蛋白的得率。解淀粉酶芽孢桿菌,拉丁名Bacillusamyloliquefaciens,屬于芽孢桿菌屬,與枯草芽孢桿菌的親緣關系很高,在自然界分布廣泛,常見于土壤、植物根部體表和植物體內,易分離培養,對人畜無毒無害,由解淀粉酶芽孢桿菌制成的菌制劑已獲得我國農業部的認可。根據相關文獻報道[7-8],解淀粉芽孢桿菌可能產的胞外酶有蛋白酶、淀粉酶、纖維素酶、糖化酶、果膠酶等,但未曾有文獻系統的分析報道解淀粉芽孢桿菌胞外酶酶系。本實驗測定分析了解淀粉芽孢桿菌NCU116-1生物學特性,系統分析了胞外酶的種類及其與發酵時間之間的關系,并對其主要酶系的性質進行分析,為該類菌株的應用奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

解淀粉芽孢桿菌NCU116-1 課題組從樟樹籽油生產廢渣中篩選出,經誘變獲得;玉米粉、麥麩、豆粕、脫脂奶粉 均為市售;Na2HPO4·12H2O、KH2PO4、Na2CO3、NaCl、NaOH、H2SO4、Na2S2O3、葡萄糖、牛肉膏、蛋白胨、酵母粉、瓊脂、干酪素、福林酚、三氯乙酸、果膠 均為分析純;LB肉湯培養基;營養瓊脂培養基;發酵培養基:玉米粉4.5%,麩皮2.5%,豆粕4%,CaCl20.2%,KH2PO40.03%,Na2HPO4·12H2O 0.4%,pH7.5。以上培養基均在1×105Pa滅菌20 min。

WFZ765PC型紫外可見分光光度計 重慶光電儀器有限公司、CT-6023型pH計 深圳鑫寶萊檢測儀器有限公司;XMTI-8112電熱恒溫水浴鍋、SKP-02420型電熱恒溫培養箱、TQZ-312型臺式全溫振蕩器、全自動高壓滅菌鍋 上海精宏實驗設備有限公司;超凈工作臺 吳江市凈化設備總廠;FA1604電子天平 德國賽多利斯有限公;XSZ-4G型中級生物顯微鏡 重慶光電儀器有限公司;JSM 6701F型場發射掃描電鏡帶能譜儀 日本電子株式會社。

1.2 實驗方法

1.2.1 發酵培養條件 取一環已經活化好的解淀粉芽孢桿菌NCU116-1,接入到50 mL肉湯培養基中,37 ℃、220 r/min搖瓶培養24 h,制得種子液。向發酵培養基中接入1%的種子液,37 ℃、220 r/min搖瓶發酵培養至所需時間,取出發酵液8000 r/min離心分離10 min,所得上清液即為發酵復合酶液。

1.2.2 酶活力測定方法

1.2.2.1 中性蛋白酶活力測定 參照國標GB 23527-2009規定的福林酚法測定[9]。中性蛋白酶活力定義:1 g酶粉或1 mL酶液,在一定溫度和pH條件下,1 min水解酪蛋白產生1 μg酪氨酸,即為1個酶活力單位,以U/g或U/mL表示。

1.2.2.2 脂肪酶活力測定 參照國標GB 23535-2009測定[10]。脂肪酶活力定義:1 g酶粉或1 mL酶液,在一定溫度和pH條件下,1 min水解底物產生1 μmol可滴定脂肪酸,即為1個酶活力單位,以U/g或U/mL表示。

1.2.2.3 淀粉酶活力測定 采用碘比色法測定,參照國標GB 8275-2009測定[11]。淀粉酶活力定義:1 g酶粉或1 mL酶液,在一定溫度和pH條件下,1 h液化1 g可溶性淀粉,即為1個酶活力單位,以U/g或U/mL表示。

1.2.2.4 糖化酶活力測定 參照國標GB 8276-2006中規定的碘量法測定[12]。糖化酶活力定義:1 g酶粉或1 mL酶液,在一定溫度和pH條件下,1 h水解可溶性淀粉產生1 mg葡萄糖,即為1個酶活力單位,以U/g或U/mL表示。

1.2.2.5 果膠酶活力測定 參照輕工業標準QB1502-92中規定的碘量法測定[13]。果膠酶活力定義:1 g酶粉或1 mL酶液,在一定溫度和pH條件下,1 h分解果膠產生1 mg半乳糖醛酸為一個酶活力單位,以U/g或U/mL表示。

1.2.2.6 纖維素酶活力測定 采用CMC-DNS法測定[14]。纖維素酶活力定義:1 g酶粉或1 mL酶液,在一定溫度和pH條件下,每分鐘水解羧甲基纖維素鈉(CMC-Na),產生1.0 μg的葡萄糖,即為1個酶活單位,以U/g或U/mL表示。

1.2.3 發酵時間對解淀粉芽孢桿菌NCU116-1胞外酶活力影響 搖瓶培養至38～48 h時,每隔2 h取樣一次。將發酵液8000 r/min離心分離10 min,所得上清液即為不同發酵時間的發酵酶液,40 ℃條件下分別測定各胞外酶活力。因為在水酶法提取植物油脂工藝中,酸性或堿性酶解條件都會促進油脂水解從而導致酸價升高。實踐表明在中性條件下進行酶解催化,所得油脂酸價增加幅度最小,最適合用于水酶法提取植物油脂工藝[15]。為了盡量貼近實際使用環境,各胞外酶活力都是在中性條件(pH=7.0)下測定的。

1.2.4 解淀粉芽孢桿菌NCU116-1胞外酶系分析 取發酵44 h制得的發酵酶液,在不同pH(4、5、6、7、8、9、10)條件下分別測定菌株所產胞外酶活力,確定其最適作用pH;在不同溫度(35、40、45、50、55、60、65 ℃)條件下分別測定菌株所產胞外酶活力,確定其最適作用溫度;在不同溫度(35、40、45、50、55 ℃)保溫不同時間(30、66、90、120 min)后測定菌株所產胞外酶活力,確定其熱穩定性能;在菌株所產粗酶液中添加10 mmoL/mL不同的金屬離子(Mn2+、Mg2+、Ca2+、Cu2+、Zn2+、Fe2+、Fe3+)后檢測菌株所產胞外酶活力,確定不同金屬離子對其激動作用[16]。

2 結果與討論

2.1 菌株生物學特性

解淀粉芽孢桿菌拉丁名為Bacillusamyloliquefaciens,屬于細菌界(Subkingdom),細菌門(Bacteriophy),芽孢亞門(Bacillussubphylum),枯草芽孢桿菌屬(BacillussubtilisCohn),同枯草芽孢桿菌有很高的親緣性。

菌株在營養瓊脂培養基上生長迅速(圖1),培養18 h后,菌落呈圓形、大小5.0～9.0 mm、厚度約2 mm,表面光滑,顏色為淺黃色、邊緣有不規則波狀圓形突起,菌苔粘稠,革蘭氏染色為陽性(圖2)。用分析型掃描電子顯微鏡下觀察(圖3),菌株形態為桿狀,直或略帶彎曲,表面光滑,兩端呈鈍圓形態,菌體較細長,單個或多個首尾相連排列,無莢膜,長度在1.5～2.5 μm之間,直徑為0.4～0.5 μm。菌株的菌落形態、革蘭氏染色結果、電鏡下的形態與原始菌株相比并無明顯差異,但胞外酶活力發生較大變化[6]。這樣的結果可能是由于物理化學誘變對該原始菌株胞外酶的基因產生影響較大,使控制胞外酶性狀的DNA發生了一定程度的突變,而對其菌落和細胞形態并無引起較大改變[17-18]。

圖1 菌株NCU116-1菌落形態Fig.1 Colony morphology of strain NCU116-1

圖2 菌株NCU116-1革蘭氏染色Fig.2 Gram staining results of strain NCU116-1

圖3 菌株NCU116-1在掃描電鏡下形態Fig.3 Shape of strain NCU116-1 observed by transmission electron microscope注:圖3(A)為放大30000倍圖像,圖3(B)為放大15000倍圖像。

2.2 最佳發酵時間的確定

解淀粉芽孢桿菌NCU116-1所產中性蛋白酶活力與發酵時間的關系列于圖4(A)和圖4(B)中。由圖可知,NCU116-1胞外酶分別為蛋白酶、糖化酶、果膠酶、纖維素酶、淀粉酶。糖化酶、淀粉酶和纖維素酶的最佳發酵時間是40 h;中性蛋白酶最佳發酵時間是44 h,果膠酶最佳發酵時間是42 h。蛋白酶和糖化酶的產量較高,其次是果膠酶和纖維素酶,淀粉酶的產量不是很高,未測出脂肪酶活力。接下來對酶活力較高的蛋白酶、糖化酶、果膠酶、纖維素酶進行酶學性質分析。

圖5 蛋白酶的酶學性質Fig.5 Enzymatic properties of proteinase注:圖5(A)表示pH對蛋白酶活力影響,圖5(B)表示溫度對蛋白酶活力影響,圖5(C)表示蛋白酶的熱穩定性,圖5(D)表示金屬離子對蛋白酶活力的影響。

圖4 解淀粉芽孢桿菌NCU116-1所產胞外酶活力與發酵時間的關系Fig.4 The relationship between fermentation time and the exoenzyme activity注:圖4(A)中包括蛋白酶、糖化酶、果膠酶;圖4(B)中包含纖維素酶和淀粉酶。

2.3 解淀粉芽孢桿菌NCU116-1胞外酶酶系分析

2.3.1 蛋白酶的酶學性質 pH、溫度、保溫時間和金屬離子對菌株NCU116-1所產蛋白酶活力的影響分別繪于圖5(A～D)中。由圖5(A)可知,當pH為8時,解淀粉芽孢桿菌NCU116-1所產蛋白酶活力最高,適宜水酶法提取植物油脂的pH環境。由圖5(B)可知,菌株NCU116-1所產蛋白酶活力在50 ℃時最高。由圖5(C)可知,當溫度達到50 ℃及以上時,解淀粉芽孢桿菌NCU116-1所產蛋白酶活力隨時間的延長而快速降低。結合圖5(B)可確定,菌株NCU116-1所產蛋白酶的最適宜作用溫度為40～45 ℃。由圖5(D)可知,Mn2+可以顯著提高菌株NCU116-1所產蛋白酶活力。這是因為大多數微生物所產中性蛋白酶都是金屬蛋白酶,其活性中心常含有一個金屬離子如Co2+、Fe3+、Cu2+、Mg2+等。金屬蛋白酶中的金屬離子可被透析或者金屬螯合物所螯合而失活,而這一過程通常是可逆的,可通過重新加入金屬離子恢復部分或者全部蛋白酶活力[19]。

圖6 糖化酶的酶學性質Fig.6 Enzymatic properties of glucoamylase注:圖6(A)表示pH對糖化酶活力影響,圖6(B)表示溫度對糖化酶活力影響,圖6(C)表示糖化酶的熱穩定性,圖6(D)表示金屬離子對糖化酶活力的影響。

圖7 果膠酶的酶學性質Fig.7 Enzymatic properties of pectase注:圖7(A)表示pH對果膠酶活力影響,圖7(B)表示溫度對果膠酶活力影響,圖7(C)表示果膠酶的熱穩定性,圖7(D)表示金屬離子對果膠酶活力的影響。

2.3.2 糖化酶的酶學性質 pH、溫度、保溫時間和金屬離子對菌株NCU116-1所產糖化酶活力的影響分別繪于圖3A～3D中。由圖6(A)可知,當pH為8時,菌株NCU116-1產酶活力最高。由圖6(B)可知,菌株NCU116-1所產糖化酶活力在35 ℃時最高。由圖6(C)可知,當溫度分別為30 ℃和35 ℃時,保溫120 min后,菌株NCU116-1所產糖化酶的活力與初始菌株相比保持穩定,當溫度達到40 ℃及以上時,菌株NCU116-1所產糖化酶活力隨時間的延長而快速降低。結合圖6(B)可確定,菌株NCU116-1所產糖化酶的最適宜作用溫度為35 ℃左右。該酶屬于低溫糖化酶。低溫糖化酶在自然溫度條件下仍具有高酶解活力及高催化效率,可大大降低能源消耗、簡化工藝流程,同時溫和的熱處理即可使其失活,易于產品質量控制,因此在水酶法提油、飼料加工等的許多領域較中溫糖化酶更有優勢[20]。由圖6(D)可知,Cu2+、Fe3+、Mn2+可以提高菌株NCU116-1所產糖化酶活力。

圖8 纖維素酶的酶學性質Fig.8 Enzymatic properties of cellulase注:圖8(A)表示pH對纖維素酶活力影響,圖8(B)表示溫度對纖維素酶活力影響,圖8(C)表示纖維素酶的熱穩定性,圖8(D)表示金屬離子對纖維素酶活力的影響。

2.3.3 果膠酶的酶學性質 pH、溫度、保溫時間和金屬離子對菌株NCU116-1所產果膠酶活力的影響分別繪于圖7(A～D)中。由圖7(A)可知,當pH為6時,菌株NCU116-1所產果膠酶活力最高。該酶的適宜pH為5.5～6.5。由圖7(B)可知,菌株NCU116-1所產果膠酶活力在40 ℃時最高。由圖7(C)可知,當溫度達到45 ℃及以上時,菌株NCU116-1所產果膠酶活力隨時間的延長而降低。結合圖7(B)可確定,菌株NCU116-1所產果膠酶的最適宜作用溫度為35～40 ℃。由圖7(D)可知,Mn2+和Ca2+都可以提高菌株NCU116-1所產果膠酶活力。

2.3.4 纖維素酶的酶學性質 纖維素酶是酶工業制劑中重要的酶,用于飼料添加劑、纖維素飼料、生物制品等領域[21]。pH、溫度、保溫時間和金屬離子對菌株NCU116-1所產纖維素酶活力的影響分別繪于圖8(A～D)中。由圖8(A)可知,當pH為7時,菌株NCU116-1所產纖維素酶活力最高。該酶的適宜pH為6～8,最佳pH為7。由圖8(B)可知,菌株NCU116-1所產纖維素酶活力在50 ℃時最高。由圖8(C)可知,當溫度分別為40 ℃和45 ℃時,保溫120 min后,菌株NCU116-1所產纖維素酶的活力較初始菌株保持穩定,當溫度達到50 ℃及以上時,菌株NCU116-1所產纖維素酶活力隨時間的延長而降低。結合圖8(B)可確定,菌株NCU116-1所產纖維素酶的最適宜作用溫度為40～45 ℃。該纖維素酶在中低溫下能保持較高活性,在低溫生物加工等領域起到重要應用價值。由圖8(D)可知,Ca2+和Cu2+可以提高菌株NCU116-1所產纖維素酶活力。

3 結論與討論

對解淀粉芽孢桿菌NCU116-1菌株形態和細胞形態進行了觀察,并分析了該菌株胞外酶活力隨發酵時間的關系,以及蛋白酶、糖化酶、果膠酶、纖維素酶的酶學性質,包括pH、溫度、熱穩定性和金屬離子的影響。在pH為7,溫度為40 ℃,發酵時間為42 h的條件下,解淀粉芽孢桿菌NCU116-1所產的胞外酶的酶活力都比較高,且無脂肪酶活性,在該溫度下進行酶解反應有利于降低水酶法提取植物油脂工藝中的能源消耗,符合水酶法提取植物油脂復合酶制劑要求。

解淀粉芽孢桿菌NCU116-1所產的酶液為復合酶,與由多種單一酶混合的復合酶相比,其生產工藝更簡單、生產成本更低;與近些年報道的復合酶生產菌[22-24]相比,這些復合酶生產菌大都為霉菌,所產酶系以纖維素為主,主要應用于飼料行業;解淀粉芽孢桿菌NCU116-1的所產酶系以中性蛋白酶為主,其產中性蛋白酶和糖化酶能力高于前者,其產中性蛋白酶能力甚至高于現在國內常用的中性蛋白酶生產菌[25],是更適合生產用于水酶法提取植物油脂用的復合酶制劑。

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Biological characteristics and exoenzymes analysis of a mutated strainBacillusamyloliquefaciensNCU116-1

ZHAO Rong-bin1,2,3,YAN Xiang-hui1,LONG Jun-min4,YU Ping1,2,3,*,ZENG Cheng5,OU YANG Shao-lin6,ZENG Zhe-ling1,2,3,*

(1.School of Resource,Environmental and Chemical Engineering,Nanchang University,Nanchang 330031,China;2.State Key Laboratory of Food Science and Technology,Nanchang University,Nanchang 330047,China;3.Jiangxi Province Key Laboratory of Edible and Medicinal Plant Resources,Nanchang University,Nanchang 330031,China；4.School of Animal Science,Jiangxi Biotech Vocational College,Nanchang 330200,China;5.School of Medicine,The First Clinical Medical College,Nanchang University,Nanchang 330031,China;6.Ji’an Forestry Science Research Institute,Ji’an 343000,China)

The biological characteristics and culture characteristics ofBacillusamyloliquefaciensNCU116-1 were studied. Nation-standard method and carboxymethyl cellulose saccharification method were used to analyze the enzymes production fastigium and their properties. The result showed that the optimal fermentation time of amylase,amylase and cellulase was 40 h. The optimum fermentation time of the neutral protease was 44 h. The optimum fermentation time of pectinase was 42 h,The neutral protease had the maximum activity at 50 ℃. Mn2+was an activator of neutral protease. Its optimum temperature and pH value were 40～45 ℃and 8 respectively. The glucoamylase had the maximum activity at 35 ℃,and was activated by Ca2+,Fe3+and Mn2+. Its optimum temperatures and pH value were 35～40 ℃ and 8.0 respectively. The pectase had the maximum activity at 40 ℃,and was activated by Mn2+and Ca2+. Its optimum temperatures and pH value were 35～40 ℃and 6.0 respectively. The cellulase had the maximum activity at 50 ℃,and was activated by Ca2+and Cu2+. Its optimum temperatures and pH value were 40～45 ℃ and 7.0 respectively. The extracellular enzymes produced by the strain meet the requirements of aqueous enzymatic method and this paper lays a theoretical foundation for the application of this kind of strain.

Bacillusamyloliquefaciens;fermentation time;complex enzyme;enzyme analysis

2016-11-04

趙榮彬(1990-)男，碩士研究生，研究方向：應用微生物學，E-mail：robin0391@163.com。

*通訊作者:余平(1982- )男，博士，研究方向：天然產物研究與開發，E-mail：cpu_yuping@126.com。 曾哲靈(1965-)，男，博士，教授，研究方向：食物資源開發與生物質轉化，E-mail：zlzhengjx@163.com。

國家國際科技合作專項項目(2011DFA32770);江西省國際科技合作項目(20112BDH80004，20123BDH80011);食品科學及技術國家重點實驗室目標導向項目(SKLF-ZZA-201303);江西省科技支持計劃重大項目(20143ACG70015);江西省高等學校科技落地計劃項目(KJLD12012);重點實驗室目標導向項目(SKLF-ZZA-201610)。

TS201.2

A

1002-0306(2017)10-0221-07

10.13386/j.issn1002-0306.2017.10.034