一株產黃色素海洋真菌的分離、鑒定及黃色素特性的研究

周 靜,劉 姝,胡晟源,來蔣麗,顧張慧

(1.連云港市產品質量監督檢驗中心,江蘇連云港 222006;2.江蘇省海洋資源開發研究院,江蘇連云港 222000;3.淮海工學院海洋生命與水產學院,江蘇連云港 222005)

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一株產黃色素海洋真菌的分離、鑒定及黃色素特性的研究

周 靜1,劉 姝2,3,*,胡晟源3,來蔣麗3,顧張慧3

(1.連云港市產品質量監督檢驗中心,江蘇連云港 222006;2.江蘇省海洋資源開發研究院,江蘇連云港 222000;3.淮海工學院海洋生命與水產學院,江蘇連云港 222005)

海洋真菌可代謝生成豐富的色素,其中部分色素具有應用于醫藥或開發為食品添加劑的潛力。本研究從海州灣海域的海泥樣品中篩選產黃色素真菌,獲得黃色素高產真菌菌株MP-16。通過對該菌株的形態觀察和ITS基因序列比對分析,鑒定菌株MP-16為Penicilliumcitreonigrum。該菌株所產黃色素在330 nm波長處有最大吸收峰,具有良好的光熱穩定性,在紫外及自然光下放置36 h,黃色素光吸收值無顯著變化;在pH6～10,20～100 ℃下較穩定;該色素對大部分金屬離子穩定。本研究結果為Penicilliumcitreonigrum黃色素的應用提供了理論基礎。

海洋真菌,黃色素,菌株鑒定,性質

色素在人們的生活與食品工業的生產中扮演著重要的角色[1]。在食品工業生長中主要使用的有天然色素和人工合成色素兩大類。人工合成色素著色能力強、成本低廉、種類繁多,但對于食品工業中合成色素的選擇與使用劑量，各個國家有著嚴格的要求和規范[2-4]。天然色素具有安全性高,有營養價值等優點,但是生產量少、價格昂貴、穩定性較差,在使用和存儲過程中會出現掉色和脫色現象,很大程度上限制了天然色素的使用[5]。因此,開發安全、廉價、高效的色素成為研究熱點。

微生物特別是海洋真菌可以產生豐富的色素,可通過發酵培養的方式大批量的生產,具有培養周期較短、生產成本低廉、對人體無毒害作用、不受資源、環境的限制等優點,是高效的天然色素生產途徑,具有廣闊的市場前景[6]。海洋真菌大多分泌具有抗氧化功能的黑色素和不同結構的孢粉素來對抗惡劣的生存環境[7]。部分海洋真菌亦可以分泌鮮亮的屬于聚酮類化合物的色素,如分離于湛江紅樹林內生菌Alternariasp.可以分泌黃色素[8],海南紅樹林分離的Eurotiumrubrum可以分泌橙色、黃色和紫色色素[9],高鹽環境分離的Periconiasp.分泌非常特殊的綠色素[10]。目前,國際上已有多種來源于海洋真菌色素被廣泛應用于醫藥、化妝品、食品、紡織品等行業[11-13]。

本研究組從海洋海泥樣品海洋樣品中分離了一株產黃色素的真菌,并對菌株進行鑒定,對色素性質進行研究,為進一步開發利用該菌產生的黃色素奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

海泥和海水樣品 采集于海州灣連島海域,放置于冰盒,并盡快帶回實驗室;真菌基因組提取試劑盒、PCR試劑盒 Promega公司;PDA培養基和發酵培養基 杭州微生物試劑有限公司;乙酸乙酯、無水乙醇 國藥集團化學試劑有限公司;其它化學試劑 均為分析純;引物和合成即測序鑒定 由南京金斯瑞有限公司完成。

5418型高速冷凍離心機 Eppendorf公司;PCR儀 Eppendorf公司;凝膠成像系統 Bio-red公司;Nano Drop 2000 Thermo公司;JSM-6390LA型掃描電鏡 日本電子公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 產黃色素真菌的篩選 將放置于室溫2周的海水于121 ℃,滅菌20 min,得到滅菌陳海水(本實驗中所有培養基均采用滅菌陳海水配制)。稱取1.0 g海泥樣品加入9 mL滅菌陳海水中混勻,按10倍梯度系列稀釋成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5的稀釋液,選取濃度為10-4、10-5的稀釋液1 mL涂布在PDA培養基上,倒置于28 ℃恒溫箱培養96 h;挑取產黃色素顏色較深的菌落,采用多次劃線分離法進行分離純化得到單菌落;挑取獲得的單菌落接種至250 mL三角瓶裝有50 mL發酵培養基中,150 r/min,28 ℃條件下,搖床振蕩培養72 h;將發酵液8000 r/min離心10 min,選取上清液黃色最深的菌株進行菌種鑒定、色素提取和色素性質研究。

1.2.2 菌株的鑒定 菌株接種于平板,滅菌的蓋玻片以45 ℃傾角插入靠近接菌位點的培養基平板上,25 ℃培養。定期觀察菌落形態,待菌絲接觸蓋玻片,取下蓋玻片敲成適當大小,粘貼于樣品臺導電膠上,真空電鍍后,電鏡觀察。

利用DNA提取試劑盒按照說明書提取菌株MP-16基因組DNA。以基因組為模板ITS1F(TCC GTAGGTGAACCTGCG)和ITS4F(TCCTCCGCTTATTG ATATGC)為引物進行PCR擴增。反應體系(50 μL):模板1 μL;上下游引物各1 μL;2× Buffer 25 μL;Taq酶 1 μL;雙蒸水22 μL。反應參數:95 ℃預熱3 min,95 ℃變性3 min,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,設置30個循環,72 ℃延伸10 min。PCR產物送南京思普金生物科技有限公司測序后,BLAST搜索同源序列,并構建進化樹。

1.2.3 色素提取 將斜面保存的菌株接種到裝有50 mL發酵培養基的三角瓶中,30 ℃、160 r/min、振蕩培養72 h。將三角瓶中加入50 mL乙酸乙酯,20 ℃、160 r/min,振蕩30 min后,過濾,濾液用分液漏斗分液,獲得有機相,采用旋轉蒸發儀40 ℃蒸干,用3 mL無水乙醇溶解轉移裝入至玻璃瓶中,氮氣吹干,并用無水乙醇配制成1 mg/mL的色素溶液。

1.2.4 色素的光譜特性分析 以無水乙醇為對照,使用NanoDrop2000在210～900 nm對1 mg/mL色素溶液進行全波長掃描,觀察其吸收光譜特征,確定其最大吸收波長。

1.2.5 光照對色素穩定性的影響 取0.5 mg/mL色素溶液各5 mL,分別置于暗室、室內自然光及15 W紫外光下36 h,每隔6 h測定其在330 nm處的光吸收值(吸光度)。

1.2.6 色素的溫度穩定性 取0.5 mg/mL色素溶液10 mL,分別置于20、40、60、80、100 ℃水浴24 h后,迅速冷卻至室溫,測定330 nm吸光度。

1.2.7 pH對色素穩定性的影響 取0.5 mg/mL色素溶液,用5 mol/L HCl、5 mol/L NaOH將pH分別調為2、4、6、8、10、12后,于室溫下放置24 h,然后測330 nm吸光度。

1.2.8 金屬離子對色素穩定性的影響 在5 mL 0.5 mg/mL色素溶液中分別加入1 mL濃度為0.05 mol/L和1 mol/L的下列金屬離子(Mg2+、Ca2+、Cu2+、Fe3+、Na+)溶液。并以無水乙醇加入相同濃度的金屬離子作為對照。振蕩搖勻后于黑暗中靜置24 h,測定330 nm處的吸光度。

1.3 數據處理

所有實驗均為三次平行操作;采用SPSS 17.0軟件進行數據統計分析,應用Origin 9.0軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 產黃色素菌株的篩選

通過平板篩選,獲得能夠分泌黃色素的菌株16株。將16株菌進行搖瓶發酵培養后,離心獲得發酵上清液,觀察發酵液顏色,發現菌株MP-16黃色最深,因此選取菌株MP-16進行下一步研究。

2.2 菌株MP-16的形態

菌株MP-16在發酵培養基中培養72 h后,菌落直徑11.5 mm,黃色菌絲,表面有黃色分泌物產生。電鏡觀察表明菌絲光滑,有隔,具分枝,直徑2～6 μm;分生孢子梗帚狀;分生孢子單輪生,較疏松;呈扁球形,鏈生于短枝頂端,表面光滑,直徑為2.5～5 μm(圖1)。

圖3 NJ法構建菌株MP-16與參比菌株ITS基因序列系統發育樹Fig.3 Phylogenetic tree based on homologous sequences of ITS and Neighbor-Joining analysis

圖1 菌株MP-16電鏡觀察Fig. 1 Electron microscope of strain Mp-16注:上圖放大倍數為1600,下圖放大倍數為1900。

2.3 菌株MP-16 ITS序列的擴增與分析

以菌株MP-16基因組DNA為模板,ITS1和ITS4為引物進行擴增(圖2),產物測序后將其提交至GenBank,并將序列進行BLAST比對,與Penicilliumcitreonigrum的ITS序列(GU934551)的同源性最高,為98%。下載同源性較高的序列,用Clustal X軟件進行多序列比對后,用MEGA5.1按N-J法聚類構建系統發育樹,菌株MP-16同Penicilliumcitreonigrum(GU934551)聚為同一簇群(圖3)。綜合形態學特征及ITS序列分析,初步確定MP-16菌株為Penicilliumcitreonigrum。Penicilliumcitreonigrum分布廣泛,可以產生多種次級代謝產物[14-16],但是對色素的研究鮮有報道。

圖2 菌株MP-16瓊脂糖凝膠電泳Fig.2 Agarosegel electrophoretogram of ITS of MP-16注:M,DNA Marker;1,PCR產物。

2.4 色素的光譜特性分析

以無水乙醇作為對照,全波長掃描色素溶液,該色素有2個吸收峰,且在波長330 nm左右處吸收峰最強(圖4)。故本文以故本實驗選擇330 nm作為特征吸收波長。

圖4 菌株Penicillium citreonigrum P-16色素的吸收光譜Fig.4 The absorption spectra of the pigment from Penicillium citreonigrum

2.5 光照對色素穩定性的影響

在暗室(避光)、室內自然光和紫外燈下(紫外光)放置一定時間,測定色素溶液330 nm處吸光度,結果見圖5。在以上3種條件下,色素溶液吸光度隨存放時間的延長無顯著變化(p>0.05),表明該色素具有較強的光穩定性。色素的光穩定性是評價色素質量的重要標準之一,良好的光穩定性是色素用于食品加工的前提條件。

圖5 光照對菌株Penicillium citreonigrum色素穩定性的影響Fig.5 Effect of light on the stability of the pigment from strain Penicillium citreonigrum

2.6 色素溫度穩定性

如圖6所示,菌株Penicilliumcitreonigrum黃色素的吸光度隨溫度的增加呈先增后降的趨勢,但在100 ℃保持24 h后,色素仍保持91%的吸光度,表明該色素耐熱性較好。色素溫度穩定性好,在加工過程中不易脫色,而有些色素在加熱時,不僅會氧化分解,還會引起聚合反應,造成顏色損失[17]。

圖6 溫度對菌株Penicillium citreonigrum色素穩定性的影響Fig.6 Effect of temperature on the stability of the pigment from strain Penicillium citreonigrum

2.7 pH對色素的影響

在不同pH下測定黃色素的吸光度,結果見圖7。黃色素在pH6～10均較穩定,而在pH2～4之間的酸性條件和高于pH10的極堿條件下,黃色素的穩定性較差。

圖7 pH對菌株Penicillium citreonigrum色素穩定性的影響Fig.7 Effect of pH on the stability of the pigment from strain Penicillium citreonigrum

2.8 金屬離子對色素穩定性的影響

在色素溶液和對照組中分別加入不同濃度的金屬離子,振蕩搖勻,于黑暗中靜置24 h后,進行目測及330 nm處吸光度測定,結果見表1。目測發現添加了Cu2+的黃色素溶液變成了黃綠色,添加了Fe3+黃色素溶液變成了深黃色,而添加了Mg2+、Ca2+、Na+的黃色素溶液無明顯變化;因為實驗發現Cu2+和Fe3+在乙醇溶液中分別呈現藍色和黃色,它們自身呈現的顏色影響了色素溶液的顯色結果;而Mg2+、Ca2+、Na+在乙醇溶液中呈現無色,故對色素溶液顯色結果無顯著影響。通過檢測還發現,添加的所有金屬離子對色素溶液的吸光度均無顯著影響(p>0.05),這是因為金屬離子的最大吸收波長與黃色素均不同,因而色素溶液添加各種金屬離子后的吸光度未產生顯著變化。

表1 金屬離子對色素穩定性的影響(n=3)Table 1 Effect of metal ions on the stability of the pigments(n=3)

注:同列不同字母表示差異顯著(p<0.05)。

3 結論

從海州灣海域海泥樣品中篩選獲得產黃色素真菌菌株MP-16,通過形態學及分子生物學方法將菌株MP-16鑒定為Penicilliumcitreonigrum。Penicilliumcitreonigrum黃色素在330 nm波長處有最大吸收峰。該色素具有良好的光、pH(6～10)和熱穩定性,并且對Mg2+、Ca2+、Cu2+、Fe3+、Na+金屬離子穩定。本結果可為菌株Penicilliumcitreonigrum黃色素的進一步應用研究奠定基礎。

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Isolation and identification of yellow pigment producing marine fungi strain and characterization of the melanin pigment

ZHOU Jing1,LIU Shu2,3,*,HU Sheng-yuan3,LIAI Jiang-li3,GU Zhang-hui3

(1.Lianyungang Products Quality Supervision and Inspection Center,Lianyungang 222006,China;2.Jiangsu Institute of Marine Resources,Lianyungang 222000,China; 3.College of Marine Life and Fisheries,Lianyungang 222005,China)

Marine fungi can excrete many kinds of pigments with the potential to be applied in food and pharmaceutical industrials. Yellow pigments are widely used in the process of alcohol,beverage,and other food. In the present study,the melanin-producing fungi strains were screened from the mud collected from Haizhou Bay. The yellow pigment-producing fungi strain MP-16 was identified asPenicilliumcitreonigrumbased on morphological characteristics and ITS rDNA sequence analysis. The pigment showed a maximum absorption peak at 330 nm. The pigment showed good resistance to heat,natural sunlight,and UV light. The pigment was stable form pH6 to pH10,and the temperature form 20 to 100 ℃. Metal ions had little effects on its stability. The results laid the foundation for the further study of the pigment.

marine fungi;yellow pigment;strain identification;characterization

2016-11-01

周靜(1970-),女,碩士,高級工程師,研究方向:食品營養與化學,E-mail:zhoujing158@163.com。

*通訊作者:劉姝(1975-),女,博士,副教授,研究方向:食品營養與加工,E-mail:jdliushu@163.com。

江蘇省自然科學基金面上項目(BK20151282)；淮海工學院科研創新基金(Z2014016)。

TS201.3

A

1002-0306(2017)10-0217-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.10.033