復合菌固態發酵豬骨素產谷氨酸發酵條件優化

李 婧,王新惠,*,張 超,朱文優,肖龍泉,黃艷淋

(1.成都大學藥學與生物工程學院,四川成都 610106;2.宜賓學院發酵資源與應用四川省高校重點實驗室,四川宜賓 644000)

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復合菌固態發酵豬骨素產谷氨酸發酵條件優化

李 婧1,王新惠1,*,張 超2,朱文優2,肖龍泉1,黃艷淋1

(1.成都大學藥學與生物工程學院,四川成都 610106;2.宜賓學院發酵資源與應用四川省高校重點實驗室,四川宜賓 644000)

優化米曲霉-紅曲霉復合菌固態發酵豬骨素產谷氨酸的發酵條件以提高谷氨酸產量。通過單因素實驗和正交實驗,以谷氨酸產量為指標,研究發酵時間、發酵溫度、培養基初始pH和培養基含水量對谷氨酸產量的影響并對其進行優化。結果表明,培養基初始pH為6,培養基含水量為30%,發酵溫度32 ℃,發酵5 d谷氨酸產量達到194.2 g/kg,總氨基酸產量達到768.5 g/kg,比優化前分別提高了15.7%和5.5%。

米曲霉,紅曲霉,豬骨素,谷氨酸

生豬屠宰加工過程中產生大量的肉類副產物,據統計其中鮮骨可達2000萬噸/年以上,但其精深加工率不足10%[1-2]。鮮骨營養極為豐富,含有蛋白質、脂肪、骨膠原、軟骨素、磷脂質、磷蛋白,還有豐富的鈣、磷、鐵、鋅等礦物質,其量是鮮肉的數倍,骨蛋白是可溶性蛋白質,其吸收率和生物學效價較高,然而這些寶貴的資源僅簡單利用或被直接遺棄[3]。目前,眾多屠宰加工廠對鮮骨的處理仍停留在直接出售的水平上,由于缺乏相應的處理技術,不僅對環境造成了污染,而且其經濟價值遠遠沒有體現出來。如何開發利用屠宰分割副產物-豬骨,已經成為肉類加工業亟待解決的重要問題之一。

近年來,以豬骨素為代表的豬骨提取物,不僅提升肉類加工副產品的附加值,而且使一些較難開發的蛋白質資源,以多肽類食品的形式得以利用,具有積極的意義[4-6]。提取的豬骨素其主要成分為膠原、骨膠原及軟骨素(酸性粘多糖),其中膠原蛋白分子形成一種十分穩定的三股超螺旋結構,不利于人體吸收消化[7],若能將其水解成多肽和氨基酸,則有利于提高豬骨素的鮮味、吸收力、營養特性、功能性特征和風味等優勢。目前,對豬骨素中蛋白質的水解主要采用酸堿水解法和酶解法。利用化學方法水解豬骨素,存在某些缺陷,如堿法水解可使L-氨基酸轉變為D-氨基酸,形成有毒物質,且水解過程中氨基酸破壞比較嚴重,從而導致呈味效果不突出[5]。酶解法可有效釋放出氨基酸和多肽物質,顯著提高營養價值,但酶解易使酶解液產生苦味肽,使酶解液呈苦味,導致豬骨素的應用范圍受限[6]。因此,尋求一種既可增強豬骨素鮮味,又能避免苦味產生的技術已迫在眉睫。

利用微生物發酵是一種傳統而古老的食品加工及儲藏方法,發酵食品因其加工價格低廉、食品風味特征凸顯和營養價值高,并且有較強的穩定性等得到世界的廣泛認同,尤其是發酵高蛋白食品[8]。張宇等[9]報道紅曲霉、米曲霉可發酵豬骨素,可產生多肽、氨基酸和一些揮發性風味物質,增加呈味效果。微生物發酵過程中,發酵條件會對發酵效果產生一定的影響,因此,優化發酵條件對最終發酵效果的好壞尤為重要。為了進一步提高菌種發酵產氨基酸的產率,本文以紅曲霉-米曲霉雙菌組合為出發菌種固態發酵豬骨素,利用復合菌分泌的蛋白酶酶解豬骨素產谷氨酸和其它氨基酸。以谷氨酸產量為指標,在單因素實驗的基礎上,采用正交實驗進一步優化發酵條件,確定復合菌固態發酵豬骨素產谷氨酸的最佳發酵條件。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

米曲霉A-3(Aspergillusoryzae)、紅曲霉M-4(Monascuspurpureus) 由成都大學食品加工四川省高校重點實驗室提供;種子培養基：馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基(PDA培養基) 馬鈴薯200 g,葡萄糖20 g,瓊脂20 g,蒸餾水1000 mL,pH7[10];固態培養基 麩皮100 g,豬骨素600 g,硫酸銨15 g,三聚甘油單硬脂酸酯3 g,補水至1000 g,攪拌均勻,121 ℃濕熱滅菌20 min;豬骨素 蛋白質73.1%、氨基酸7.2%、脂肪0.28%、水分16.93%、其它成分2.49%,由四川天添調味品食品公司提供;谷氨酸標品 購于上海生物工程股份有限公司。

pHS-3C型數字酸度計 上海日島科技有限公司;FA2004電子分析天平 上海舜宇恒平科學儀器有限公司;SH-020恒溫恒濕發酵箱 上海上器集團實驗設備有限公司;LRH系列生化培養箱 上海一恒科學儀器有限公司;LDZX-50KBS手輪式不銹鋼立式壓力蒸汽滅菌鍋 上海申安醫療器械有限公司;TGL-20M高速臺式冷凍離心機 湖南湘儀科學儀器設備有限公司;XW-80A漩渦混合器 江蘇麒麟科教設備有限公司;SZ-93A自動雙重純水蒸餾器 上海亞榮生化儀器有限公司;UV741型可見紫外分光光度計 惠普上海分析儀器有限公司;VOSHIN-600R型均質器 江蘇無錫沃信儀器有限公司;Deckman 6300型氨基酸自動分析儀 美國貝克曼庫爾特有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 發酵條件對米曲霉-紅曲霉復合菌固態發酵豬骨素產谷氨酸和總氨基酸的影響

1.2.1.1 發酵培養基初始pH對發酵產氨基酸的影響 以0.1 mol/L檸檬酸或氫氧化鈉溶液調節培養基的初始pH為5、6、7、8和9,以1∶1比例接入米曲霉和紅曲霉孢子懸浮液(107個/mL),接種量10%,發酵培養基含水量25%,發酵溫度30 ℃,相對濕度95%～100%,通風量0.2 L·min-1·kg-1,每12 h翻松培養基一次,發酵5 d后測定谷氨酸和總氨基酸產量。

1.2.1.2 培養基含水量對發酵產氨基酸的影響 發酵培養基初始pH6,調節培養基中的含水量20%、25%、30%、35%、40%和45%,其他條件同1.2.1.1。

1.2.1.3 發酵溫度對發酵產氨基酸的影響 發酵培養基初始pH6,水分含量30%,采用不同發酵溫度26、28、30、32、34 ℃和36 ℃進行固態發酵,其他條件同1.2.1.1。

1.2.1.4 發酵時間對發酵產氨基酸量的影響 分別在發酵時間1、2、3、4、5、6、7 d測定谷氨酸和總氨基酸產量,其他條件同1.2.1.1。

1.2.1.5 正交實驗設計 在單因素實驗基礎上,設計三因素三水平正交實驗,以谷氨酸產量為評價指標,進一步優化發酵條件,確定最佳發酵條件。正交實驗因素水平見表1。

表1 正交實驗因素水平表Table 1 Factors and levels table of orthogonal test

1.2.2 氨基酸的測定 取發酵樣品加入等體積的8%磺基水楊酸除去蛋白質和多肽,10000 r/min離心20 min,取上清液經0.5 μm濾膜過濾后,采用氨基酸自動分析儀測定樣品中的谷氨酸和總氨基酸量。測定條件:緩沖液流量:20 mL/h,茚三酮流量:10 mL/h,柱溫:60 ℃,色譜柱:20 cm,分析時間:42 min。

1.3 數據處理

數據統計分析,采用SAS軟件(SAS Institute,2000)的ANOVA進行分析,采用普通線性模型(GLM)計算,用最小顯著性差異檢驗平均值間的差異,設定5%為顯著性差異水平。對每次實驗的每個樣品做三次重復測定。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗

2.1.1 發酵培養基初始pH對復合菌發酵產氨基酸的影響 發酵培養基初始pH對復合菌發酵豬骨素產氨基酸的影響如圖1所示。隨著培養基初始pH的逐漸增加,谷氨酸和總氨基酸產量呈現先增加后降低的趨勢,pH為6.0～7.0時谷氨酸和總氨基酸產量較高,pH為6時,谷氨酸和總氨基酸的量分別達到164.5 g/kg和712.6 g/kg,隨著培養基堿度增加,谷氨酸和總氨基酸量受到顯著抑制(p<0.05),培養基初始pH為9時谷氨酸和總氨基酸量與培養基初始pH為6時相比分別降低10.9%和8.3%。pH主要通過影響菌體膜滲透性以及物質離子化程度,進而影響米曲霉和紅曲霉對營養成分的吸收和蛋白酶的產生[11]。米曲霉和紅曲霉的最適生長pH為6～7,強酸強堿條件都不利于菌體的生長代謝,從而影響蛋白酶的合成[12-13]。張宇等[9]報道米曲霉和紅曲霉在堿性環境下產酶能力低下,堿性環境對菌株的產酶能力有強力的抑制作用,本研究結果與張宇等研究結果一致,米曲霉和紅曲霉發酵豬骨素產氨基酸的最適pH為6～7。

圖1 培養基初始pH對復合菌發酵豬骨素產谷氨酸和總氨基酸的影響Fig.1 Effects of initial pH in medium on Glutamic acid and total amino acids production

2.1.2 發酵培養基含水量對復合菌發酵豬骨素產氨基酸的影響 發酵培養基含水量對復合菌發酵豬骨素產氨基酸的影響如圖2所示。培養基含水量對復合菌發酵豬骨素產谷氨酸和總氨基酸有顯著影響(p<0.05),當培養基的含水量低于25%或是高于40%,谷氨酸和總氨基酸產量顯著偏低;當培養基含水量為20%時,培養基較干,發酵過程中隨著水分的蒸發,到發酵第4 d時培養基中幾乎無水分,菌體生長緩慢,導致谷氨酸和總氨基酸產量低;當培養基含水量在30%～35%時,谷氨酸和總氨基酸產量較高,培養基含水量為30%時谷氨酸和總氨基酸產量達到最高,分別為176.4 g/kg和724.3 g/kg;當培養基含水量45%時,培養基透氣性差,菌體生長和產酶能力受到嚴重抑制,谷氨酸和總氨基酸產量顯著降低。培養基含水量對固體發酵尤為重要,培養基含水量過低,則營養物質及氧氣的溶解及運輸受到抑制,導致微生物的生長代謝緩慢,影響發酵效率;培養基含水量過高則會影響培養基中空氣的流通,導致氧氣供給受到限制[14-15]。本實驗結果表明,米曲霉-紅曲霉復合菌固態發酵豬骨素產谷氨酸和總氨基酸適宜培養基含水量為30%～35%。

圖2 培養基含水量對復合菌發酵豬骨素產谷氨酸和總氨基酸的影響Fig.2 Effects of moisture content in medium on Glutamic acid and total amino acids production

2.1.3 發酵溫度對復合菌發酵豬骨素產氨基酸的影響 發酵溫度對米曲霉-紅曲霉復合菌固態發酵產谷氨酸和總氨基酸的影響如圖3所示。發酵溫度對米曲霉和紅曲霉的生長代謝產生顯著影響。隨著發酵溫度的逐漸增加,谷氨酸和總氨基酸產量呈現先增加后降低的趨勢,發酵溫度為32 ℃,發酵5 d谷氨酸和總氨基酸產量達到最高,分別為180.5 g/kg和736.7 g/kg。當發酵溫度為32 ℃,菌體生長迅速,發酵至36 h培養基變白長滿菌絲體,至60 h培養基開始轉為紅灰色。當發酵溫度為26 ℃,培養基上菌體生長緩慢,發酵至60 h培養基才開始變白,至80 h培養基開始轉為紅灰色;當發酵溫度為36 ℃,發酵5 d時培養基上只有一些發黃或白色的菌體,這可能是由于發酵溫度高時,培養基中的水分迅速蒸發,嚴重影響菌體的生長,甚至導致菌體老化。根據實驗結果初步確定適合的發酵溫度為30～32 ℃。

圖3 發酵溫度對復合菌發酵豬骨素產谷氨酸和總氨基酸的影響Fig.3 Effects of fermentation temperature on Glutamic acid and total amino acids production

2.1.4 發酵時間對復合菌發酵豬骨素產氨基酸的影響 發酵時間對米曲霉-紅曲霉復合菌固態發酵豬骨素產谷氨酸和總氨基酸的影響如圖4所示。隨著發酵時間的延長,谷氨酸和總氨基酸產量呈現先增加后趨于穩定的趨勢,發酵5 d谷氨酸和總氨基酸量趨于穩定。發酵開始時,由于孢子剛剛萌發,菌絲初步形成,菌體量少,分泌蛋白量少,因而酶活力低,谷氨酸和總氨基酸量低;發酵2 d,菌體進入快速生長和產酶旺期,谷氨酸和總氨基酸產量迅速增加;發酵至第5 d谷氨酸和總氨基酸產量趨于穩定,這可能是發酵培養基中豬骨素被逐漸耗盡,因而從第5 d開始隨著發酵時間延長谷氨酸和總氨基酸產量增加非常緩慢,趨于穩定。因此,確定米曲霉-紅曲霉復合菌固態發酵豬骨素產谷氨酸和總氨基酸的發酵時間為5 d。

圖4 發酵溫度對復合菌發酵豬骨素產谷氨酸和總氨基酸的影響Fig.4 Effects of fermentation time on Glutamic acid and total amino acids production

2.2 正交實驗

在單因素實驗的基礎上,選擇對米曲霉-紅曲霉復合菌固態發酵豬骨素產谷氨酸和總氨基酸發酵條件影響較大的三個因素,即培養基初始pH、培養基含水量和發酵溫度。以谷氨酸產量為評價指標,通過三因素三水平正交實驗確定培養基初始pH、培養基含水量和發酵溫度對發酵產谷氨酸的影響,發酵5 d測定谷氨酸量,正交實驗結果見表2。結果表明,RC>RA>RB,即各因素從主到次的順序為C(含水量),A(發酵溫度),B(初始pH),最優方案為A2B1C2,即發酵溫度32 ℃,發酵培養基初始pH為6,發酵培養基含水量30%,米曲霉-紅曲霉復合菌發酵豬骨素5 d時谷氨酸產量達到192.3 g/kg。

按正交實驗優化的發酵條件進行驗證實驗,以確保實驗的準確性。在A2B1C2最優組合條件下,米曲霉-紅曲霉復合菌發酵豬骨素5 d時,谷氨酸量達到194.2 g/kg,總氨基酸量達到768.5 g/kg。米曲霉-紅曲霉復合菌固態發酵豬骨素發酵優化前產谷氨酸和總氨基酸分別為167.8 g/kg和728.6 g/kg[16],優化后谷氨酸和總氨基酸產量分別提高15.7%和5.5%。

表2 正交實驗結果Table 2 L9(34)orthogonal array design and results

3 結論

本實驗以豬骨素為底物,采用米曲霉-紅曲霉復合菌固態發酵的方法,發酵產谷氨酸。對影響米曲霉-紅曲霉復合菌固態發酵產谷氨酸的培養基初始pH、發酵培養基含水量、發酵溫度和發酵時間等4個因素進行單因素實驗。在單因素實驗的基礎上,篩選出培養基初始pH、培養基含水量和發酵溫度等3個影響顯著的因素進行正交實驗優化,優化后最適固態發酵條件為:以1∶1比例接入米曲霉和紅曲霉孢子懸浮液(107個/mL),接種量10%,發酵培養基初始pH為6,培養基含水量30%,發酵溫度32 ℃,發酵時間為5 d后,谷氨酸量達到194.2 g/kg,總氨基酸量達到768.5 g/kg,比優化前分別提高了15.7%和5.5%。

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Optimization of fermentation conditions for Glutamic acid production by mixed starter cultures in solid state fermentation

LI Jing1,WANG Xin-hui1,*,ZHANG Chao2,ZHU Wen-you2,XIAO Long-quan1,HUANG Yan-lin1

(1.School of Pharmacy and Bioengineering,Chengdu University,Chengdu 610106,China;2.Key Laboratory of Fermentation Resource and Application of Institutes in Sichuan Higher Education,Yibin University,Yibin 644000,China)

The fermentation conditions for Glutamic acid production by a mixed starter culture composed ofAspergillusoryzaeandMonascuspurpureusin solid state fermentation were optimized. The effects of fermentation time,fermentation temperature,medium initial pH and moisture content on Glutamic acid were studied by single factor and orthogonal array design methods. Results suggested that the optimal fermentation conditions were the fermentation temperature 32 ℃,the fermentation time 5 d,the initial pH of fermentation medium 6 and the moisture content in medium 30%. Under these conditions,the yields of Glutamic acid and total amino acids were 194.2 g/kg and 768.5 g/kg,respectively,which were increased by 15.7% and 5.5% respectively compared to that before optimization.

Aspergillusoryzae;Monascuspurpureus;pig ossein;Glutamic acid

2016-06-30

李婧(1986-)，女，博士，講師，主要從事食品分析檢測方面的研究，E-mail：531536927@qq.com。

*通訊作者:王新惠(1982-)，女，博士，副教授，主要從事肉類加工及質量控制方面的研究，E-mail：wangxinhui19820319@163.com。

發酵資源與應用四川省高校重點實驗室開放基金項目(2015FJZ003)；成都大學大學生創新性實驗項目(CDU-CX-2016051)。

TS201.2

A

1002-0306(2017)10-0185-04

10.13386/j.issn1002-0306.2017.10.027