內蒙古絨山羊不同部位骨骼肌的轉錄組分析

趙 珺,王 樂,蘇 蕊,張燕軍,劉志紅,李金泉,*

(1.內蒙古農業大學,動物遺傳育種重點實驗室,內蒙古呼和浩特 010018;2.內蒙古化工職業學院,內蒙古呼和浩特 010010)

?

內蒙古絨山羊不同部位骨骼肌的轉錄組分析

趙 珺1,2,王 樂1,蘇 蕊1,張燕軍1,劉志紅1,李金泉1,*

(1.內蒙古農業大學,動物遺傳育種重點實驗室,內蒙古呼和浩特 010018;2.內蒙古化工職業學院,內蒙古呼和浩特 010010)

本實驗旨在研究內蒙古絨山羊背最長肌、臂三頭肌和臀肌3個部位骨骼肌差異表達的主要信號通路和關鍵基因的表達規律,以提高絨山羊基因組的注釋水平。以3只在相同飼養背景下的絨山羊成年母羊為研究對象,屠宰后取3個部位骨骼肌肌肉組織并提取總RNA,反轉錄建立cDNA文庫,利用Illumina MiSeq高通量測序技術,建立了絨山羊3個骨骼肌其mRNA水平上的轉錄組分析平臺。結果得到了18.64 Gb的信息量,92278723對雙端reads,發現影響絨山羊骨骼肌生長發育的差異基因多來自輕鏈肌球蛋白家族、重鏈肌球蛋白家族。內蒙古絨山羊背最長肌、臂三頭肌和臀肌3個部位骨骼肌在轉錄組水平上存在差異。

絨山羊,骨骼肌,轉錄組,高通量測序

內蒙古絨山羊不僅絨質好,且肉質優良,屬于絨肉兼用品種。目前,我國對絨山羊的研究主要集中在絨質上,而作為同時可以肉用的品種來說,其肉質的特性還沒有進行全面而系統的研究。對絨山羊肉質的理化性質分析后發現,內蒙古絨山羊羊肉在不飽和脂肪酸、礦物質含量方面都有明顯的優勢,特別是膽固醇和脂肪含量更低,且性涼,一年四季皆適合食用[1]。

肉品質的研究往往集中于動物屠宰和加工后肉的外觀、營養、風味、衛生等一些物化性狀方面,近年來對肉質的分析正逐漸轉向分子層面,且限于豬、綿羊等品種間的差異研究[2-4],有關內蒙古絨山羊羊肉品質分子層面的研究較少。前期筆者對內蒙古絨山羊背最長肌、臂三頭肌和臀肌3個部位的差異蛋白進行了分析,建立了絨山羊骨骼肌差異蛋白譜,發現骨骼肌的差異主要體現在控制肌肉收縮機制的結構蛋白上[5]。隨著高通量測序技術的發展,科學研究已經邁入了后基因組時代[6]。轉錄組(Transcriptome)的研究為基因表達調控、揭示遺傳信息等提供了大量可靠的信息[7-8]。轉錄組是指在某種生理條件下,細胞內全部轉錄產物的總和,包括信使RNA、核糖體RNA、轉運RNA及非編碼RNA[9-11]。轉錄組測序(RNA-Seq)技術無需對數據集進行復雜的標準化即可捕捉不同組織或狀態下的轉錄組動態變化[12-13]。有研究認為利用RNA-Seq技術對綿羊肌肉表達基因的研究比傳統的芯片技術更能為人們敏感地檢測樣本間基因的差異表達[14-16]。

表1 山羊β-actin基因和肌肉差異相關基因RT-qPCR擴增引物的序列Table 1 The table of primer sequences of β-actin gene and genes relative with muscle

本研究選取較好的背最長肌、臂三頭肌以及臀肌3個部位的骨骼肌為研究對象,利用Illumina高通量測序技術,以內蒙古絨山羊為材料,研究個體不同部位骨骼肌的差異,以期從mRNA水平解析3個部位骨骼肌肌肉品質差異可能存在的分子調控機制,初步篩選與肌肉發育相關的差異基因,試圖從mRNA水平揭示絨山羊肌肉發育的分子基礎提供依據,為絨山羊育種、肉品質鑒定提供重要依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

絨山羊 由內蒙古阿爾巴斯白絨山羊(Caprahircus)種羊場提供,飼養管理條件一致。分別采取3只成年周歲母羊的背最長肌、臀肌及臂三頭肌3個部位的肌肉組織,按部位混合后存放于-80 ℃冰箱,用于總RNA提取。

2-16P冷凍離心機 德國西格瑪(Sigma);VCX130超聲破碎儀 美國索尼克斯(Sonics);MS3混合儀 德國艾卡(IKA);CFX96實時定量PCR儀、GelDocXR凝膠成像儀 美國伯樂(Bio-Rad);3500基因測序儀 美國應用生物系統公司(ABI);ULTS超低溫冰箱 德國賽默飛(Thermo)。

1.2 實驗方法

1.2.1 cDNA文庫的制備及轉錄組測序 根據合格的肌肉組織RNA反轉錄建立cDNA文庫,并以山羊參考基因組建立測序文庫,以內蒙古絨山羊背最長肌為對照對3個部位的骨骼肌進行分析。測序工作委托北京百邁克公司進行。利用編程的手段將測序獲得的reads其質量不高的接頭即堿基數Q≤10并占half number of whole reads和“N”基超過3%的reads過濾掉,隨后利用FastQC軟件評價,以備后續分析。

1.2.2 差異表達基因篩選 本研究采用FPKM(Fragment Per Kilobase of exon model per Million mapped reads[17-18],每1百萬個map上的reads中map到外顯子的每1K個堿基上的Fragments個數)表征每個基因的表達豐度,采用FPKM>0.1作為表達的基因被檢測到的標準。通過差異表達基因{ fold change≥2或≤0.5,p-value≤0.01且FDR(False Discovery Rate)<0.01}尋找內蒙古絨山羊3個部位肌肉兩兩樣品間(臂三頭肌-背最長肌、臀肌-臂三頭肌、臂三頭肌-臀肌)的差異表達基因,并統計差異樣本的上調、下調基因。

1.2.3 差異表達基因的生物信息學分析 GO功能注釋分為細胞組分、分子功能和生物學過程3大類。使用GO注釋(http://wego.genomics.org.cn/cgi-bin/wego/index.pl)對差異基因進行功能聚類分析。利用KEGG平臺(http://www.genome.jp/kegg/pathway. htML)對差異基因進行KEGG通路分析,通過KEGG通路分析確定差異基因參與的主要信號轉導途徑。

1.2.4 差異基因的實時定量PCR驗證 參照GeneBank中公布的山羊β-actin基因,篩選與骨骼肌發育相關的差異表達基因肌紅蛋白(Mb),肌球蛋白輕鏈激酶(MLCK)和肌球蛋白輕鏈2(MyLC2),采用2-ΔΔCt法對差異基因的表達量進行統計計算。采用Primer 5.0進行特異實時熒光定量引物的設計,委托上海生工合成,詳細信息見表1。

2 結果與分析

2.1 總RNA質量檢測

3個部位的肌肉RNA其OD260/280值大于1.8且小于2.2,說明沒有蛋白質和DNA的污染,同時也沒有水解為單核苷酸;可見兩條清晰的28S和18S條帶,表明3個樣品的RNA沒有降解,此外RIN(RNA integrity number)檢測都符合要求,即肌肉組織樣本滿足轉錄組測序的條件(表2)。

表2 絨山羊肌肉組織測序表Table 2 The sequencing information of cashmere muscle

表3 測序數據評估表Table 3 The table of sequencing data on evaluation

2.2 測序數據結果分析

本次實驗構建了內蒙古絨山羊骨骼肌肌肉表達譜文庫,共獲得922278723雙reads,堿基總數為18.64 Gb。原始數據經過濾去除低質量的序列后,得到可供轉錄組拼接的有效reads>90%,表明樣品測序質量較高。

2.3 差異表達基因篩選

圖1 背最長肌-臂三頭肌差異基因GO分析Fig.1 Gene ontology of differential expression genes in longissimus muscle vs triceps muscle注:圖中縱坐標柱形圖左側為全部非重復序列基因,右側為差異非重復序列基因。

對內蒙古絨山羊3個部位肌肉兩兩樣品間的差異表達基因進行數目統計(表4)。臂三頭肌與背最長肌的差異表達基因總數為790個,上調基因和下調基因分別為448、342個,上調基因中有5個屬于MyLC家族,其中MyLC2和MyLC4在臂三頭肌中上調顯著(p<0.05);臀肌與背最長肌的差異表達基因總數為571個,上調基因和下調基因分別為357、214個,上調基因中有3個基因與肌動蛋白(Actin)相關,29個基因與骨骼肌的發育相關;臂三頭肌與臀肌的差異表達基因總數為300個,上調基因和下調基因分別為161、139個,上調基因中與骨骼肌發育相關的基因有31個,其中1個基因功能預測為Actin。

表4 差異表達基因數目統計表Table 4 The number of differential expression genes

2.4 差異表達基因的生物信息學分析

2.4.1 差異基因GO分類 通過GO對基因、蛋白質進行功能分類和注釋,按分子功能、細胞組分和生物學過程進行分類。差異表達基因GO的分類注釋包括3個本體,細胞成分(Cellular component)、分子功能(Molecular function)和生物學過程(Biological process)。3個對照文庫通過GO富集檢驗(p<0.05)的差異表達基因所對應的GO條目與顯著富集GO條目基本一致,差異體現在參與基因的數目上。背最長肌與臂三頭肌之間共有1623條差異表達基因獲得GO數據庫注釋,這些差異基因被分在上述3大類的56個亞類中。其中,生物過程分為23個亞類中獲得的注釋信息較多,共有548條差異基因,占全部注釋信息的33.76%,這里涉及細胞過程(Cellular process)和生物協調(Biological regulation)和代謝過程(Metabolic process)比較多;其次是細胞成分,分為18 個亞類,共有539條差異基因,占全部注釋信息的33.21%,涉及到細胞部分(Cell part)、細胞(Cell)和細胞器(Organelle)的比較多;分子功能的注釋信息有16個亞類,共有536條差異基因,占33.03%,這其中的催化活性(Catalytic activity)與結合(Binding)排在前2位。

表5 絨山羊骨骼肌差異基因KEGG代謝途徑分類Table 5 KEGG classification of skeletal differential expression genes

2.4.2 差異表達基因KEGG通路富集結果分析 KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)數據庫是與通路相關的開放的重要數據庫,Kanehisa等[19-20]根據BLAST 2 GO把實驗中得到的差異表達基因和該數據庫進行blast,會更深入的了解基因的具體功能,因為在動植物體內,更多情況下某一個功能或性狀是許多基因產物共同協作的結果。將得到的差異基因映射到KEGG數據庫中,通過3個對照組得到的差異表達基因在通路的富集顯著性的可靠分析。最可靠(P-value最小)的通路中,多數基因注釋到脂肪酸代謝途徑,糖代謝途徑以及心肌系統疾病途徑等。在上述通路中篩選了8條與肉質相關的差異基因KEGG的代謝途徑進行展示(表5),參與肌動骨架蛋白調節信號通路的差異表達基因數量為16;其次為過氧化物酶增殖激活受體信號通路,參與的基因數量為11。

2.5 Q-PCR法對測序數據可靠性驗證

篩選與骨骼肌發育相關的差異表達基因肌紅蛋白(Mb)、肌球蛋白輕鏈激酶(MLCK)和肌球蛋白輕鏈2(MyLC2)對測序結果進行驗證,結果發現肌紅蛋白(Mb)、肌球蛋白輕鏈激酶(MLCK)和肌球蛋白輕鏈2(MyLC2)在臂三頭肌中顯著高于背最長肌,說明高通量測序結果可靠(圖2)。

圖2 絨山羊肌肉差異表達基因表達量趨勢圖Fig.2 The chart of differential expression genes of cashmere skeletal muscle

3 討論

對3個部位的轉錄組數據庫進行兩兩比對分析,并對差異基因中與肉質相關的基因進行統計,發現功能注釋基本包括肌動蛋白細胞骨架、循環調節、細胞的分化合成、信號轉導及脂肪的運輸和代謝等相關的功能。并發現有多個基因編碼產生肌球蛋白、肌鈣蛋白和肌紅蛋白,與絨山羊的肌肉生長速度差異有一定的相關,這些基因可能為骨骼肌生長中的保守基因,這與綿羊的研究基本一致[21]。MyLC3和MyHC2是調控骨骼肌生長發育并影響其生長速度和嫩度的主要基因,MLCK家族是調控絨山羊骨骼肌肌肉收縮能力的重要基因。Takashima[22]發現,MLCK是可溶性蛋白激酶,是細胞收縮力產生的關鍵因素,主要作用是調節MyLC2產生ATP酶以促進肌動蛋白-肌球蛋白的收縮。Chan等[23-25]認為在大多數細胞中,MLCK起到調節二價鈣離子與鈣調蛋白連接的MLCK信號轉導作用,MLCK在MyLC調控肌動蛋白對肌肉的收縮、細胞轉運等過程具有重要的作用,是細胞連接和轉運的信號關鍵。臂三頭肌相對背最長肌的MLCK上調,而臀肌中MLCK的表達很弱,說明臂三頭肌的肌肉收縮能力強于背最長肌,臀肌的收縮力最差,這與山羊的習性相符。

GO功能富集性分析顯示，許多差異表達基因參與了一些生物學過程,如細胞的結合、新陳代謝、細胞過程等,這些結果與在豬上的研究一致[26],說明這些差異表達基因間的相互作用共同執行了以上的生物學功能。KEGG通路注釋分析發現差異表達基因參與重要的信號通路:轉化生長因子信號系統(TGF-βsignaling system),肌動骨架蛋白調節系統(RegμLation of actin cytoskeleton),FAM信號通路(Fatty acid metabolism)以及心肌集合系統(Vascular Smooth Muscle Contracion)等與肌肉的生長、發育關系極為密切,說明肌細胞的增殖和分化與骨骼肌的生長發育過程有著復雜的基因調控網絡。特別是骨骼肌的生長、發育及再生等受到細胞外環境的調節,細胞生長因子的作用尤為顯著,轉化生長因子(TGF-β)、成纖維生長因子(FGF)等能夠有效調控肌肉發育基因表達[27]。TGF-β超家族的功能最為顯著,TGF-β通路對生物體和各種器官的發育過程起重要的調節作用[28-31]。TGFBR3作為TGF-β信號通路的一員,對細胞的增殖和分化具有抑制作用[32]。TGF-β可以抑制由新生成肌細胞遷移融合導致的肌管早熟,確保了骨骼肌在胚胎期的正常發育[33-34]。

αR肌纖維的直徑是3種類型中最長的,并且該類型的肌纖維在肌肉中的含量多少會負向影響肌肉的品質。即αR肌纖維在3種類型肌纖維中含量越高,肉的品質就相應越低,反之亦然,而βR型肌纖維的多少則正向影響肌肉的細嫩程度[35]。對豬的研究中發現,不同品種的豬具有不同生長速度,在研究各自的骨骼肌時發現,肌球重鏈中II b mRNA表達量對提高肌肉的生長是成正比的,該基因表達的愈多,肌肉的生長愈快[36]。對羊的研究表明,在有著近乎相同的直徑的情況下,纖維總數高的羊所含的II 型纖維也較高[37]。在本研究中,臂三頭肌相對背最長肌顯著上調的基因中有MyHC2,該基因屬于肌球重鏈家族,影響肌肉的生長速度,說明臂三頭肌的生長速度更快。

4 結論

本研究應用Illumina MiSeq高通量測序技術,共得到了18.64 Gb的信息量,92278723對雙端reads。結合GO注釋、KEGG富集分析等方法對本研究篩選的絨山羊骨骼肌差異基因進行分析,發現這些差異基因主要富集在脂肪酸代謝、肌動蛋白骨架調節等方面,說明這些代謝途徑對肌肉的生長和發育起重要作用。本研究通過高通量測序得到的數據為后續對絨山羊肉質的進一步研究奠定了基礎。

[1]孟麗云,張文廣,高愛琴,等. 畜禽肉質特性研究進展[J]. 中國畜牧獸醫,2011,38(9):143-148.

[2]趙曉,莫德林,張悅,等. 豬的骨骼肌生長發育研究進展[J].生命科學,2011(1):37-44.

[3]凌飛,方偉,杜紅麗,等. 基因 mRNA選擇性剪切體的鑒定及其在不同發育時期的藍塘與長白豬骨骼肌中的表達[J]. 廣東農業科學,2010(1):12-17.

[4]黃治國,謝莊.綿羊肌肉生長激素受體基因表達的發育性變化研究[J]. 農業科學與技術,2009(1):93-96.

[5]趙珺,張文廣,蘇蕊,等.內蒙古絨山羊骨骼肌蛋白差異表達譜分析[J].西北農林科技大學學報：自然科學版，2016,44(8):1-11.

[6]Pan Q,Shai O,Lee L J,et al. Deep surveying of alternative splicing complexity in the human transcriptome by high throughput sequencing[J].Nat Genet,2008,40(12):1413-1415.

[7]Pillai R S. MicroRNA function:MμLtiple mechanisms for atiny RNA?[J]. RNA,2005,11:1753-1761.

[8]Aravin A,Tuschl T. Identification and characterization of small RNAs involved in RNA silencing[J]. FEBS Lett,2005,579:5830-5840.

[9]Filichkin S A,Priest H D,Givan S A,et al. Genome-wide mapping of alternative splicing in Arabidopsis thaliana[J]. Genome Res,2010,20(1):45-58.

[10]Mortazavi A,Williams BA,McCue K,et al. Mapping and quantifying mammalian transcriptomes by RNA-Seq[J]. Nat Methods,2008,5(7):621-628.

[11]Ponting C P,Oliver P L,Reik W. Evolution and functions of long non-coding RNAs[J]. Cell,2009,136(4):629-641.

[12]Cloonan N,Forrest Alistair R,Kolle G,et al. Stem cell transcriptome profiling via massive-scale mRNA sequencing[J]. Nat Methods,2008,5(7):613-619.

[13]Wilhelm B T,Marguerat S,Watt S,et al. Dynamic repertoire of a eukaryotic transcriptome surveyed at single nucleotide resolution[J]. Nature,2008(7199):1239-1243.

[14]Byrne K,Vuocolo T,Gondro C,et al. A gene network switch enhances the oxidative capacity of ovine skeletal muscle during late fetal development[J]. BMC Genomics,2010,11:378.

[15]Ren H,Li L,Su H,et al. Histological and transcriptome-wide level characteristics of fetal myofiber hyperplasia during the second half of gestation in Texel and Ujumqin sheep[J]. BMC Genomics,2011,12:411.

[16]Wilhelm B T,Landry J R. RNA-Seq quantitative measurement of expression throughmassively parallel RNA-sequencing[J].Methods,2009(3):249-257.

[17]Benjamini Y,Yekutieli D. The control of the false discovery rate in mμLtiple testing under dependency[J]. Ann Statist,2001,29(4):1165-1181.

[18]Wickramasinghe S,Rincon G,Islas-Trejo A,et al. Transcriptional profiling of bovine milk using RNA sequencing[J]. BMC Genomics,2012,13:45-59.

[19]Kanehisa M,Susumu Goto,Shuichi Kawashima,et al. The KEGG resource for deciphering the genome[J]. Nucleic Acids Res,2004,1(32):277-280.

[20]Koning M,Werker P M,van Luyn M J,et al. Hypoxia promotes proliferation of human myogenic satellite cells:a potential benefactor in tissue engineering of skeletal muscle[J]. Tissue Eng Part A,2011(13-14):1747-1758.

[21]張春蘭.小尾寒羊和杜泊羊臂二頭肌轉錄組及肌球蛋白輕鏈基因家族結構特征分析[D]. 泰安:山東農業大學,2014.

[22]Takashima S. Phosphorylation of myosin regμLatory light chain by myosin light chain kinase,and muscle contraction[J]. Circ J,2009,73(2):208-213.

[23]Chan J Y,Takeda M,Briggs L E,et al. Identification of cardiac-specific myosin light chain kinase[J]. Circ Res，2008,102(5):571-580.

[24]Watterson D M,Schavocky J P,Guo L,et al. Analysis of the kinase-related protein gene found at human chromosome 3q21 in a mμLtigene cluster:organization,expression,alternative splicing,and polymorphic marker[J]. Cell Biochem，1999,75(3):481-491.

[25]Wang E T,Sandberg R,Luo S,et al. Alternative isoform regμLation in human tissue transcriptomes[J]. Nature,2008,456(7221):470-476.

[26]Damon M,Wyszynska-Koko J,Vincent A,et al. Comparison of muscletranscriptome between pigs with divergent meat quality phenotypes identifies genesrelated to muscle metabolism and structure[J]. PLOS One,2012(3):e33763.

[27]Ten Broek RW,Grefte S,Von den Hoff J W. RegμLatory factors and cell popμLations involved in skeletal muscle regeneration[J]. Cell Physiol,2010,224(1):7-16.

[28]Gunning P,O’Neill G,Hardeman E. Tropomyosin-based regμLation of the actin cytoskeleton in time and space[J]. Physiol Rev,2008,88(1):1-35.

[29]Kollias H D,McDermott J C.Transforming growth factor-beta and myostatin signaling in skeletal muscle[J]. Appl Physiol,2008,104(3):579-587.

[30]Droguett R,Cabello-Verrμgio C,Santander C,et al. TGF-beta receptors,in a Smad-independent manner,are required for terminal skeletal muscle differentiation[J]. Exp Cell Res,2010,316(15):2487-2503.

[31]Dong M,How T,Kirkbride K C,et al. The type Ⅲ TGF-βreceptor suppresses breast cancerprogression J Clin[J]. Invest,2007(1):206-217.

[32]Turley R S,Finger E C,Hempel N,et al. The type III transforming growth factor-beta receptor as a novel tumor suppressor gene in prostatecancer[J]. Cancer Res,2007(3):1090-1098.

[33]Gunning P,O’Neill G,Hardeman E. Tropomyosin-based regμLation of the actin cytoskeleton in time and space[J]. Physiol Rev,2008,88(1):1-35.

[34]Carlson ME,Conboy MJ,Hsu M,et al. Relative roles of TGF-beta1 and Wnt in the systemic regμLation and aging of satellite cell responses[J]. Aging Cell,2009,8(6):676-689.

[35]Trendelenburg A U,Meyer A,Rohner D,et al. Myostatin reduces Akt/TORC1/p70S6K signaling,inhibiting myoblastdifferentiation and myotubesize. Am[J]. Cell Physio,2009(6):C1258-1270.

[36]Bonneau M,Mourot J,Noblet J,et al. Tissue development in Meishan pigs:Muscle and fat development and metabolism and growth regulation by somatotropic hormone[C]. Chinese pig symposium. Jouy-en-Josas in France. INRA,1990:203-213.

[37]Bünger L,Navajas E A,Stevenson L,et al. Muscle fiber characteristics of two contrasting sheep breeds:Scottish blackface and texel[J]. Meat Science,2009,81(2):372-381.

The transcriptomic analysis of different skeletal muscles of Cashmere goats

ZHAO Jun1,2,WANG Le1,SU Rui1,ZHANG Yan-jun1,LIU Zhi-hong1,LI Jin-quan1,*

(1.Key Laboratory of Animal Breeding and Reproduction in Inner Mongolia Agricultural University,Hohhot 010018,China;2.Inner Mongolia Vocational College of Chemical Engineering,Hohhot 010010,China)

In order to study on the growth rules of the goat and improve the mutton production,it was explored the main signaling pathways and the expression of key genes of longissimus muscle,triceps muscle and glutaeus in Inner Mongolian Cashmere goat. Three skeletal muscles of three cashmere goats were obtained after being slaughtered and total RNA was extracted to establish cDNA library. The Illumina high-throughput sequencing technique and bioinformatics were used to determine transcript abundances and characteristics. The establishment of mRNA level analysis platform by transcription for three skeletal muscles in Cashmere goat

18.64 Gb of data,92278723 reads of double end. The important genes belong to the myosin light chain and myosin heavy chain family. These results suggested that there were many differences in the muscle transcriptomes between these three skeletal muscles.

Cashmere goat;skeletal muscle;transcriptome;Illumina high-throughput sequencing technique

2016-11-01

趙珺(1980-)，女，在讀博士，副教授，主要從事食品營養與檢測方面的研究，E-mail：zhaojunivy@163.com。

*通訊作者:李金泉(1957-)，男，博士，教授，主要從事絨山羊絨毛機理及育種方面的研究，E-mail：lijinquan_nd@126.com。

國家863計劃項目(2007AA10Z151)；國家自然科學基金項目(31260538)。

TS251.5+3

A

1002-0306(2017)10-0173-06

10.13386/j.issn1002-0306.2017.10.025