產L-肉堿的大腸桿菌基因工程改造及生物轉化

楊月英，黃嬌芳，史吉平，王紅英

(1.中國科學院上海高等研究院,上海 201210; 2.大連工業大學,遼寧大連 116034;3.上海科技大學,上海 201210)

?

產L-肉堿的大腸桿菌基因工程改造及生物轉化

楊月英1,2，黃嬌芳1,3,*，史吉平1，王紅英2

(1.中國科學院上海高等研究院,上海 201210; 2.大連工業大學,遼寧大連 116034;3.上海科技大學,上海 201210)

L-肉堿在脂肪代謝中起重要的作用,本文構建了T7啟動子控制下的過表達質粒pET28a-caiBCD和pACYCD-caiF-caiT,并將其轉入大腸桿菌BL21(DE3)(簡寫DE3)中,得到基因工程菌BL21(DE3)/caiBCD+caiF+caiT(簡寫DE3/BCD+F+T)。將此菌株接種到生長培養基中,并用終濃度為1 mmol/L的 IPTG(異丙基硫代半乳糖苷)誘導培養,然后收集菌體細胞加入到含有巴豆甜菜堿鹽酸鹽的轉化液中進行轉化。結果顯示,IPTG誘導 4 h比誘導10 h后轉化得到的L-肉堿量要高,轉入了過表達質粒的工程菌DE3/BCD+F+T(7.244 g/L)比野生型DE3(0.5 g/L)提高了15倍。該巴豆甜菜堿鹽酸鹽轉化生成L-肉堿的反應在2 h后基本達到穩定。

L-肉堿,巴豆甜菜堿,大腸桿菌,生物轉化,基因工程

肉堿,即3-羥基-4-三甲基銨丁酸(L-β-Hydroxy-γ-Butyrobetaine),具有L和D兩種異構體,其中只有L-肉堿具有參與脂肪氧化的生理功能,特別是在脂肪的β-氧化過程中作為載體將長鏈脂肪酸轉入線粒體膜內參與脂肪酸的氧化。此外,L-肉堿還具有多種生理功能,具有抗疲勞功能[1];保護神經作用[2],L-肉堿是一種有效的抗氧化劑(自由基清除劑)[3-4];研究報道L-肉堿具有清除超氧游離子、過氧化氫和螯合過渡金屬離子的能力和對內源性抗氧化防御系統起保護的作用[5-6];治療先天性神經代謝疾病[7]和提高男性精子質量[8-9],對延遲患阿爾茨海默癥的病癥也具有重要作用[10],根據以上多種功能,目前L-肉堿已廣泛應用于減肥食品、嬰兒食品、運動員飲料、動物飼料以及藥物方面。

目前L-肉堿的生產方法主要有化學合成法、直接提取法、微生物發酵法和全細胞粗酶轉化法[11]。大多數微生物細胞都有能將巴豆甜菜堿、γ-丁基甜菜堿等作為前體物質轉化為L-肉堿的能力[12]。目前,Arense P和Kmlmlla H等人報道了大腸桿菌和農桿菌分別能將巴豆甜菜堿和γ-丁基甜菜堿轉化生成L-肉堿[13-14]。微生物在轉化巴豆甜菜堿合成L-肉堿的途徑中起關鍵作用的酶有:底物輔酶A轉移酶、底物輔酶A連接酶、輔酶A水合酶,此外還有轉運蛋白,這些酶和蛋白分別由基因caiBCD、caiT以及操縱子caiF表達[13],本文構建了重組質粒pET-caiBCD和pACYCD-caiF-caiT,轉化到大腸桿菌DE3中,利用T7啟動子對基因caiBCD、caiF和caiT進行過表達后,發現其產量遠遠高于野生型。

1 材料和方法

1. 1 材料與儀器

菌株E.coliBL21(DE3)(F-ompT gal dcm lon hsdSB(r-B m-B)λ(DE3[lacI lacUV5-T7 gene 1 ind1 sam7 nin5])和E.coliDH5α(F-endA1 glnV44 thi-1 recA1 relA1 gyrA96 deoR nupG φ80dlacZΔM15Δ(lacZYA-argF)U169,hsdR17(r-k m+k),λ-) 本實驗室保存;質粒:pACYCDuet-1(Clmr,4008 bp)和pET28a(vector carries an N-terminal His Tag,Kanr,5,369 bp) 購自Novagen?公司;pMD18-T simple(Ampr,TA cloning vector,2,692 bp) 購自Takara公司;質粒pET-caiBCD(pET28a carries caiBCD,over expression under T7 promoter,Kanr,8.8 kbp)和pACYCD-caiF-caiT(caiF and caiT overexpression under T7 promoter,Clmr,6 kbp) 均有實驗室構建;引物caiBCD-F:CAGGCCCAT ATGGATCATCTACCCA TGCC;caiBCD-R:CAGCTCGAGTTAACGTCCTTTCC ACACCG;caiF-F:CACGCCCATATGTGTGAAGGAT ATGTTGAAAAAC caiF-R:CAGCTCGAGTTAACGAC GCATACTCTTTGACAA;caiT-FGGGGAATTCATGAA GAATGAAAAGAGAAAAACGG;caiT-R:GCCAAGCTT TTAATCTTTCCAGTTCTGTTTCGCG 均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成;各種限制性內切酶、T4 DNA連接酶、DNA凝膠回收試劑盒 均購自大連寶生物工程有限公司;酵母粉、蛋白胨 購自Oxoid(英國)公司;其它試劑 均為國產分析純;L-肉堿、乙酰 CoA、肉堿乙酰轉移酶(CAT) 購自Sigma公司;LB培養基 蛋白胨10 g/L,酵母粉5 g/L,氯化鈉10 g/L,添加1.5%瓊脂為LB固體培養基;生長培養基 蛋白胨12 g/L,酵母粉24 g/L,甘油4 mL/L,KH2PO42.312 g/L,K2HPO4·3H2O 16.37 g/L,富馬酸一鈉12.5 mmol/L,巴豆甜菜堿鹽酸鹽5 mmol/L,pH7.0。

S1000TmThermal Cycler PCR儀 購自USA(Thermo);Gel.Doc.TmXR+電泳成像儀 USA(Bio-RAD);DUR730紫外分光光度計 Germany;NaNoDrop 2000C超微量樣本分光光度計 US/Thermal;PB-10 pH計 德國賽多利斯。

1.2 實驗方法

1.2.1 轉化液的準備 轉化液由20 g/L巴豆甜菜堿鹽酸鹽溶液和50 mmol/L 的磷酸鉀緩沖液組成,其中巴豆甜菜堿鹽酸鹽溶液用CaCO3調至pH5.0±0.3,再加入到終濃度為50 mmol/L(pH7.6)的磷酸鉀緩沖液,此時轉化液的pH7.0[15]。

1.2.2 L-肉堿檢測方法 DNTB法檢測,其反應原理[16]:

配制左旋肉堿標準母液(0.05 g/mL),然后稀釋五個標準濃度0.002、0.005、0.008、0.01和0.015 g/mL。取1 mL配制好的上述標本,加入0.1 mol/L HEPES(pH8.0)緩沖液200 μL,加入50 mmol/L EDTA 100 μL,再加入25 μL 10 mmol/L DNTB溶液,最后加入20 μL 12 mmol/L乙酰輔酶A,混勻反應3～5 min后,再加入10 μg肉堿乙酰轉移酶(CAT),用水定容至2 mL,反應10 min后在OD412下測定吸光值。根據以上實驗得出L-肉堿的標準曲線為:y=52.143x+0.0223,R2=0.9997,式中x:L-肉堿濃度,g/L,y:412 nm處吸光值。用同樣方法測定實驗中L-肉堿的量。

1.2.3 構建基因工程菌DE3/BCD+F+T

1.2.3.1 pET28a-caiBCD質粒的構建 大腸桿菌自身體內存在caiBCD操縱子,在大腸桿菌W3110基因組上通過PCR擴增得到基因片段caiBCD,然后將其克隆到pMD18-T中,測序驗證后將pMD18-caiBCD經Nde I/XhoI雙酶切后,與同樣經Nde I/XhoI雙酶切的載體pET28a DNA片段連接,構建過表達質粒pET28a-caiBCD。

1.2.3.2 pACYCD-caiF-caiT質粒的構建 從大腸桿菌W3110基因組擴增出基因片段caiF和caiT。然后片段caiF與載體pACYCD DNA經Xho I單酶切后在KOD酶的作用下進行融合PCR,構建得到pACYCD-caiF過表達質粒,再將此質粒用HindⅢ/EcoR I雙酶切后與同樣經HindⅢ/EcoR I雙酶切后的片段caiT連接,構建過表達質粒pACYCD-caiF-caiT。

1.2.4 大腸桿菌培養方法與IPTG的誘導條件確定 普通大腸桿菌的培養條件為37 ℃,150～200 r/min的生長環境,測定生長OD600值(OD600值表示微生物在600 nm波長下的吸光值,其間接反應了微生物細胞的生長在溶液中達到的濃度值)。IPTG誘導條件:用終濃度為1 mmol/L的IPTG在菌體培養液中進行4 h(培養基中糖分物質基本消耗完)或10 h(培養基中糖分物質已經消耗完)誘導培養[17],然后在低溫下收集菌體細胞,用中性的磷酸緩沖液洗滌2次,得到干凈菌體細胞,將干凈菌體細胞加入到轉化液中,在30～37 ℃(根據菌體細胞生長溫度推測30～37 ℃應是其最佳酶活(胞內酶)反應溫度)振蕩反應2～4 h,測定轉化液中L-肉堿的生成量[17]。

1.2.5 重組質粒在大腸桿菌DE3中的表達對L-肉堿產量的影響 將質粒pET-caiBCD和pACYCD-caiF-caiT分別或同時轉化至大腸桿菌DE3中得到基因工程菌DE3/BCD+F+T,在1 mL液體LB培養基中活化1 h后,涂布卡那霉素和氯霉素雙抗平板。挑單克隆接到3 mL LB中過夜活化,再按1%轉接至含有50 mg/L 卡那霉素(Kan)和30 mg/L 氯霉素(Clm)的液體生長培養基中,通過收集菌體細胞加入到轉化液中測定其生成的L-肉堿量。

1.2.6 基因工程菌轉化底物生成L-肉堿的穩定性測定 將大腸桿菌工程菌DE3/BCD+F+T和野生型 DE3在生長培養基中接種培養至OD600達到10后,再用終濃度為1 mmol/L的IPTG誘導培養4 h并收集菌體細胞,加到含有20 g/L的巴豆甜菜堿的液中進行轉化,不同時間段進行取樣測定生成的L-肉堿量。

2 結果與分析

2.1 L-肉堿標準曲線的繪制

根據以上方法得出L-肉堿標準曲線,見圖1,得到標準曲線方程:y=53.123x+0.012,R2=0.9992,其中,x:L-肉堿濃度,g/L;y:OD412吸光值。

圖1 DTNB法繪制L-肉堿的標準曲線Fig.1 The standard curve of L-carnitine in DTNB method

2.2 工程菌DE3/BCD+F+T的構建

2.2.1 重組表達質粒pET28a-caiBCD的構建 經相應的酶切酶連法構建質粒pET28a-caiBCD,構建過程如圖2所示。由圖3可知,雙酶切后的凝膠電泳結果顯示載體大小(5369 bp)和目的片段大小(3759 bp)與預期值相符,表明重組的質粒pET28a-caiBCD構建正確。

圖2 重組質粒pET28a-caiBCD的構建Fig.2 Construction of the plasmid pET28a-caiBCD

圖3 重組質粒pET28a-caiBCD經NdeI/XhoI雙酶切的瓊脂糖凝膠電泳Fig.3 Agarose gel electrophoresis of PET28a-caiBCD digested by NdeI/XhoI注:M為 DNA Mark DL10000;泳帶1和2為酶切過后的質粒pET28a-caiBCD。

2.2.2 重組表達質粒pACYCD-caiF-caiT的構建 構建過程如圖4所示,圖5表示酶切質粒pACYCD-caiF的凝膠驗證圖,結果與預期值(4404 bp)相符,表明重組質粒構建正確。再用相應的酶雙切和連接后構建過表達質粒pACYCD-caiF-caiT,過程如圖4所示,圖6表示用HindⅢ酶切重組質粒與對照質粒的凝膠電泳圖,重組質粒大小為5894 bp與所預期得值相符,表明重組質粒pACYCD-caiF-caiT也構建正確。

圖4 重組質粒pACYCD-caiF-caiT的構建Fig.4 Construction of the plasmid of pACYCD-caiF-caiT

圖5 通過融合PCR得到重組質粒pACYCD-caiF用XhoI酶切后的瓊脂糖凝膠電泳Fig.5 Agarose gel electrophoresis of pACYCD-caiF digested by XhoI注:M為DNA Mark DL10000;泳帶1表示用XhoI 酶切后的質粒pACYCD-caiF的條帶;泳帶2表示用XhoI 酶切后的質粒pACYCD-1。

圖6 重組質粒pACYCD-caiF-caiT經HindⅢ/EcoRI雙酶切的瓊脂糖凝膠電泳Fig.6 Agarose gel electrophoresis of pACYCD-caiF-caiT digested by HimdⅢ/EcoRI注:M表示DNA Mark DL10000;泳帶1表示HindⅢ酶切后的質粒pACYCD-caiF條帶;泳帶2表示HindⅢ酶切后的質粒pACYCD-caiF-caiT。

2.3 大腸桿菌培養方法與IPTG的誘導條件確定

2.3.1 不同IPTG誘導時間對產L-肉堿量的影響 如圖7所示,基因工程菌DE3/BCD+F+T加IPTG誘導4 h的L-肉堿的產量高于誘導10 h的表達量。

圖7 大腸桿菌分別加IPTG誘導4 h和10 h后產L-肉堿的量Fig.7 L-carnitine production in wt and recombinant strain after 4 h and 10 h induction with IPTG

2.3.2 重組質粒在大腸桿菌DE3中的表達對L-肉堿產量的影響 大腸桿菌DE3/BCD+F+T、DE3/BCD和野生型DE3三種菌分別培養、收集后進行轉化。結果如圖8所示,在大腸桿菌DE3中過表達了基因caiBCD后的工程菌產L-肉堿的量大于野生型,同時過表達了caiBCD和caiFcaiT的工程菌產量大于只過表達了基因caiBCD的菌株。

圖8 不同菌株產L-肉堿的量Fig.8 L-carnitine production by different strains

2.3.3 基因工程菌轉化底物生成L-肉堿的穩定性測定 如圖9所示,當轉化相同的底物時,工程菌DE3/BCD+F+T產L-肉堿量在7 g/L以上,遠大于野生型DE3(0.5 g/L)。此外,工程菌在1 h后達到穩定后的產量為7.244 g/L,且穩定不變。摩爾轉化率(L-肉堿摩爾數與底物巴豆甜菜堿摩爾數之比)為41%。

圖9 大腸桿菌野生型和工程菌產L-肉堿量Fig.9 L-carnitine production by wild-type strain and recombinant strain

3 結論

L-肉堿在脂肪氧化過程中起重要的載體作用,對神經類疾病具有良好的預防作用,并且有一定的抗氧化作用。目前L-肉堿的巨大市場需求對其生產方法和技術提出了更高的要求,許多研究者都在探索除化學合成法之外更先進、安全、高效的方法。本實驗通過對大腸桿菌DE3體內相關L-肉堿合成的基因進行改造后得到大腸桿菌工程菌DE3/BCD+F+T,當菌體生長到一定密度時加IPTG誘導,能調控菌株產生與L-肉堿相關的酶然后進行全細胞催化底物生產L-肉堿。相比野生菌(L-肉堿的產量不到0.5 g/L)構建的工程菌DE3/BCD+F+T產量提高了(15倍)。然而由于巴豆甜菜堿轉化成L-肉堿是一個可逆反應的過程,其在轉化2 h后就基本達到穩定不反應的狀態。因此,下一步實驗要務則是移除產物使反應繼續向生成L-肉堿生成方向移動,以進一步提高產量。

[1]周筱燕,陳靜,劉常秀,等. 左旋肉堿抗疲勞實驗研究[J]. 熱帶醫學雜志,2011,11(7):740-742.

[2]MALAGUARNERA M,VACANTE M,MOTTA M,et al. Acetyl-L-carnitine improves cognitive functions in severe hepatic encephalopathy:a randomized and controlled clinical trial[J]. Metab Brain Dis,2011,26(4):281-289.

[3]TRAINA G. The neurobiology of acetyl-L-carnitine[J]. Front Biosci(Landmark Ed),2016,21:1314-1329.

[4]CURRAN MW,OLSON J,MORHART M. Acetyl-L-carnitine(ALCAR)to enhance nerve regeneration in carpal tunnel syndrome:study protocol for a randomized,placebo-controlled trial[J]. Trials,2016,17(1):1-6

[5]GRAZIELA S RIBAS,CARMEN R VARGAS,MOACIRWAJNER,et al. L-carnitine supplementation as a potential antioxidant therapy for inherited neurometabolic disorders[J]. Gene,2014,533(2):469-476.

[6]AΜGΜGΜGUSTYNIAK A,SKRZYDLEWSKA E. The influence of L-carnitine supplementation on the antioxidative abilities of serum and the central nervous system of ethanolinduced rats[J]. Metabolic Brain Disease,2010,25(4):381-389.

[7]EVANGELIOU A,VLASSOPOΜLΜLOS D. Carnitine metabolism and deficit--when supplementation is necessary?[J]. Curr Pharm Biotechnol,2003,4(3):211-219.

[8]SOFIMAJIDPOUR H,GHADERI E,GANJI O,et al. Comparison of the Effects of Varicocelectomy and Oral L-carnitine on Sperm Parameters in Infertile Men with Varicocele[J].J Clin Diagn Res,2016,10(4):07-10.

[9]AHMED SD,KARIRA KA,JAGDESH,et al. Role of L-carnitine in male infertility[J]. J Pak Med Assoc,2011,61(8):732-736.

[10]CRISTOFANO A1,SAPERE N1,LA MARCA G. Serum Levels of Acyl-Carnitines along the Continuum from Normal to Alzheimer’s Dementia[J]. PLoS One,2016,11(5):1-16.

[11]BERNAL V,SEVILLA A,CáNOVAS M,et al. Production of L-carnitine by secondary metabolism of bacteria[J]. Microbial Cell Factories,2007,31(6):1-17.

[12]楊月英,黃嬌芳,顧金杰.L-肉堿的生理功能、生理學制備及檢測方法研究進展[J].食品科學,2015,36(5):205-211.

[13]ARENSE P,BERNAL V,CHARLIER D,et al. Metabolic engineering for high yielding L(-)-carnitine production in Escherichia coli[J].Microbial Cell Factories,2013,56(12):1-11.

[14]HOEKS FWJMMOL,KΜLΜLLA H,MEYER H-P. Continuous cell-recycle process for l-carnitine production:performance,engineering and downstream processing aspects compared with discontinuous processes[J]. Journal of Biotechnology,1992,22(1-2):117-127.

[15]張鐘元.產L-肉堿脫水酶菌株發酵及酶催化條件的研究[D].北京:中國農業科學院農產品加工研究所,2009.

[16]MARQUIS NORMAN R,FRITZ IRVING B. Enzymological determination of free carnitine concentrations in rat tissues[J]. Journal of Lipid Research,1964,5:184-187.

[17]林曉栩,林曉堅,邱宏端,等.乳糖誘導對大腸桿菌表達CGTase的影響[J].食品工業科技,2015,17:114-120.

Genetically engineeringEscherichiacolistrain and its optimized bioconversion for L-carnitine production

YANG Yue-ying1,2,HUANG Jiao-fang1,3,*,SHI Ji-ping1,WANG Hong-ying2

(1.Shanghai Advanced Research Institute,Shanghai 201210,China; 2.Dalian Polytechnic University,Dalian 116034,China; 3.Shanghai Tech University,Shanghai 201210,China)

L-carnitine plays an important role in fatty acids metabolism. Here a recombinant L-carnitine production strain had been constructed carrying two expression plasmids,pET28a-caiBCD and pACYCD-caiF-caiT,under the control of T7 promoter. This strain was genetically stable and can programmably produce L-carnitine with IPTG induction. 1 mmol/L IPTG was added to induce enzymes expression,after 4 hours induction,cells were collected for the bioconversion of crotonobetaine to L-carnitine. Compared with wild-type strain,the conversion amount of recombinant strain was increased by 15 times. And it took about two hours for the conversion of crotonobetaine to L-carnitine.

L-carnitine;crotonobetaine;Escherichiacoli;bioconversion;biological engineering

2016-11-04

楊月英(1989-)，女，碩士研究生，研究方向：微生物基因工程，E-mail：qhyyy0323@163.com

*通訊作者:黃嬌芳(1982-)，女，博士，助理研究員，研究方向：微生物基因工程，E-mail：huangjf@shanghaitech.edu.cn。

國家自然科學基金 (31400042)。

TS201.1

A

1002-0306(2017)10-0163-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.10.023