β-環糊精提高乳酸菌發酵大麥粉提取物的抗氧化及結構穩定性研究

李明松,董 英,張家艷,趙延勝

(江蘇大學食品與生物工程學院,江蘇鎮江 212013)

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β-環糊精提高乳酸菌發酵大麥粉提取物的抗氧化及結構穩定性研究

李明松,董 英*,張家艷,趙延勝

(江蘇大學食品與生物工程學院,江蘇鎮江 212013)

本文研究β-環糊精(β-cyclodextrin,BC)對植物乳桿菌發酵大麥粉提取物(fermented barley extract ofLactobacillusplantarum,LFBE)的抗氧化及結構穩定性的增強作用,以期制備具有預期生物活性的較穩定LFBE。采用冷凍干燥法制備BC與LFBE包埋物(fermented barley extract ofLactobacillusplantarumembedding with BC,BLFBE)凍干粉,借助掃描電鏡和X-射線衍射技術研究其微觀結構。抗氧化活性實驗結果表明,LFBE在常溫貯藏12 h后,其多酚化合物含量由(0.30±0.11) mg/mL迅速降至(0.019±0.0023) mg/mL,其DPPH自由基清除率由67.95%±2.16%降至9.16%±0.65%,·OH自由基清除率由72.97%±3.01%下降至11.14%±3.16%;采用1.6%的BC對LFBE進行包埋處理后,BLFBE內多酚化合物含量由(0.25±0.015) mg/mL僅降至(0.21±0.01) mg/mL,其DPPH自由基清除率由52%±2.01%則僅降至45%±2.43%,·OH自由基清除率由67.16%±1.31%僅降至54.74%±2.53%。LFBE色度檢測結果表明,BC包埋作用能顯著抑制LFBE的L*值在常溫24 h內的快速下降,使其在冷凍干燥前保持穩定色澤。掃描電鏡圖顯示,LFBE凍干粉為不規則片狀結構,而經BC包埋后變為易分散的類球狀結構;X-射線衍射結果發現LFBE凍干粉為非晶型、不定型結構,經BC包埋的BLFBE凍干粉出現晶體結構。因此,采用BC直接包埋LFBE,可有效抑制LFBE抗氧化活性下降與褐變,并增加BLFBE凍干粉的結構穩定性。

β-環糊精,植物乳桿菌,大麥粉,多酚化合物,抗氧化活性,結構,穩定性

大麥屬于喬本科,一年生草本植物,是世界最古老的谷物類作物之一,種植面積僅次于小麥、玉米和水稻,主要用于啤酒工業原料、飼料、醫藥和食品行業。研究表明,大麥含有豐富蛋白質、膳食纖維、維生素以及多酚,還含有大麥黃酮、大麥芽酚、大麥芽堿、大麥角類尿囊素等微量活性成分,因此大麥也被稱為谷物中的全價食品[1]。植物乳桿菌是一種益生菌,其生長溫度在30～37 ℃,厭氧或兼性厭氧,常見于奶油、谷物以及蔬菜發酵制品中,是優秀的營養改良者[2-4]。

ZHANG J等[5]已有研究發現大麥粉經植物乳桿菌發酵后,LFBE內游離多酚含量增加近10倍。后續深入研究發現,植物乳桿菌發酵大麥粉提取物內(fermented barley extract ofLactobacillusplantarum,LFBE)多酚化合物能有效抑制3T3-L1的脂肪合成,并顯著下調與肥胖相關基因表達水平。因此,初步判斷LFBE中多酚化合物是抑制脂肪在脂肪細胞中合成的主要活性成分之一[6]。但是,LFBE內多酚化合物易氧化且使其呈不易分散的絮狀結構,從而影響LFBE作為食品原料或輔料的應用。因此,如何保持LFBE抗氧化活力并改善LFBE結構形態的問題值得研究。

近些年來,環糊精已經被廣泛用于包埋藥物,以提高藥物溶解性與穩定性[7]。基于環糊精優異的包埋作用,有研究已經嘗試使用環糊精包埋多酚化合物,以增加其穩定性、生物活性以及生物可利用度[8]。環糊精中β-環糊精(β-cyclodextrin,BC)常被用于包埋多酚化合物,眾多研究表明這種方法可顯著提高咖啡酸、兒茶酚、綠原酸、香豆酸、阿魏酸等酚酸類物質在水溶液中的穩定性、抗氧化性和溶解性[9-12]。而利用BC保護大麥發酵提取物,以提高其多酚化合物穩定性的研究尚少見報道。本文采用BC直接包埋LFBE,研究其對LFBE抗氧化活性及其色澤的保護作用,并通過冷凍干燥制備微膠囊,借助掃描電鏡和X-射線衍射分析BC與LFBE包埋物(fermented barley extract ofLactobacillusplantarumembedding with BC,BLFBE)的特性,為植物乳桿菌發酵大麥提取物的制備及其應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大麥:揚飼麥3號 鹽城市雙增農業科技有限公司;菌種:植物乳桿菌(Lactobacillusplantatumdy-1,L.Pdy-1) 由江蘇大學應用生物技術實驗室分離,保藏于中國菌種保藏中心(CGMCC NO.6016);BC、福利酚試劑、酵母浸膏、牛肉浸膏、胰蛋白胨、FeSO4、H2O2、水楊酸 均購自國藥集團化學試劑有限公司;考馬斯亮藍G250 購自北京鼎國昌生物技術有限公司;DPPH 購自成都麥卡希化工有限公司。

Sartorius萬分之一電子天平 北京賽多斯依稀系統有限公司;7200型分光光度計、PHS-3TC型酸度計 上海天達儀器有限公司;Card分光測色儀 美國HunterLab公司;多晶X射線衍射儀 德國Bruker公司;S-3400N掃描電子顯微鏡 日本Hittachi公司;高速萬能粉碎機 浙江屹立工貿有限公司;8411型電子振篩機 上虞市道墟越州土工儀器廠;3110-P1000型移液槍 德國Eppendorf;YX400Z高壓滅菌鍋 上海三申醫療器械有限公司;BR-4冷凍離心機 法國JOUAN公司;超凈工作臺 蘇州凈化設備有限公司;生化培養箱 寧波國華儀器廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 麥粉的制備 利用高速萬能粉碎機將大麥粒粉碎,過80目篩后,保存于20 ℃。

1.2.2 直投菌液的制備 取保存于20 ℃內的菌種,用MRS培養基于31 ℃連續活化兩次,每次活化12 h,使菌體密度達到4 cfu/mL后,5000 r/min離心15 min,棄去上清,用等體積無菌去離子水重新懸浮菌體。

1.2.3 LFBE和BLFBE的制備 將大麥粉和水以1∶7的比例加進錐形瓶,直接投入8×107cfu/g的菌體,漩渦振蕩使其充分混合后,將錐形瓶置于生化培養箱內,34 ℃發酵28 h。發酵結束后以8000 r/min離心15 min,其上清為LFBE。為研究BC添加量對LFBE抗氧化活性的保護作用及褐變的抑制效果,并考慮BC的添加會稀釋LFBE固形物含量,因此在LFBE內分別加入4、10與16 mg/mL BC。通過單因素優化BC包埋條件,較優工藝為40 ℃、200 r/min攪拌水浴10 min使BC充分溶解,作為BLFBE。最后,采用冷凍干燥法,制備LFBE與BLFBE各自的凍干粉。

1.2.4 多酚化合物含量測定 LFBE與BLFBE在常溫下貯藏12 h,每隔3 h取樣并測定樣品內多酚含量。采用福林酚法測試樣品內多酚化合物含量[13],標曲為:y=0.0107x+0.0178,R2=0.9963。

1.2.5 DPPH自由基清除率測定 LFBE與BLFBE在常溫下貯藏12 h,每隔3 h取樣并測定樣品的DPPH自由基清除率。采用Danyue Zhao等測定茶多酚DPPH自由基清除率的測試方法[14],即將0.2 mL樣品液加入3.8 mL 0.039 g/L DPPH后放置于暗處30 min,然后在515 nm處測定樣品吸光值,且用0.2 mL甲醇替換樣品作為對照組。DPPH自由基清除率計算公式為:

DPPH自由基清除率(%)=(A0-As)/A0×100

式中:A0：未加樣品的吸光值;As：加樣品的吸光值。

1.2.6 ·OH自由基清除率測定 LFBE與BLFBE在常溫下貯藏12 h,每隔3 h取樣并測定樣品的羥自由基清除率。采用Shen等對黑大麥多酚的·OH清除率測定方法[15],即將1.0 mL樣品加入含有1.0 mL 9 mmol/L水楊酸、1.0 mL 9 mmol/L FeSO4和1 mL 8.8 mmol/L H202的反應液,混合均勻,用鋁箔包裹并于37 ℃保持60 min,隨后在510 nm處測吸光值。·OH自由基清除率計算公式為:

·OH自由基清除率(%)=100[1-(As-A1)/A0]×100

式中:A0：用水代替樣品的對照組吸光值;A1：用水代替H2O2的吸光值;As：樣品吸光值。

1.2.7 色度測定 LFBE與BLFBE在常溫下貯藏24 h,并每隔一段時間對樣品進行色度測定。L*值表示亮度,其范圍在0(黑)～100(白),其值越小,褐變越嚴重;a*值表示綠色值/紅色值,其值越大表示綠色損失越嚴重;b*值表示藍色/黃色值,其值越大顏色越黃。

1.2.8 包埋物特性研究 由BC不同添加量對LFBE內多酚化合物含量、DPPH自由基清除率及其色度的保護效果,并結合國標與實際情況,選取合適的BC添加量,再經冷凍干燥制備LFBE與BLFBE各自的凍干粉。采用掃描電鏡和X-射線衍射分析兩者微觀結構特性。

1.2.8.1 掃描電鏡分析 將BC、LFBE凍干粉、BC與BLFBE凍干粉的物理混合粉(Physical mixing powder of BC and LFBE,BMLFBE)以及BLFBE凍干粉研磨均勻,分別固定在樣品臺上,真空抽干、鍍金后,在掃描電鏡中觀察。

1.2.8.2 X-射線衍射分析 將BC、LFBE凍干粉、BMLFBE以及BLFBE凍干粉進行X-射線粉末衍射分析,分析條件為:Cu/Kα輻射波長0.1540 nm,電壓45 kV,電流40 mA,2θ掃描范圍5～40°,步長0.02°/min,掃描速度4°/min。

1.2.9 數據處理 每個實驗重復三次,取平均值作為最終結果。采用SPSS軟件,ANOVA法評估數據的差異顯著性,差異性水平設定p<0.05。

2 結果與討論

2.1 BC保護LFBE抗氧化活性

由圖1可以看出,LFBE在0 h的多酚化合物含量最高,而BLFBE在0 h的多酚化合物含量低于LFBE。同時,隨著BC添加量增加,BLFBE在0 h的多酚化合物含量逐漸降低,可能因為其部分分子在范德華力、氫鍵作用、疏水作用的驅動下進入BC疏水空腔內[16],使得其內能檢出多酚化合物含量低于LFBE。

隨著貯藏時間增加,LFBE內多酚化合物含量一直下降,其多酚化合物含量在12 h內由(0.30±0.11) mg/mL減少至(0.019±0.0023) mg/mL,超過93%的多酚化合物損失。添加BC則能明顯抑制BLFBE在12 h內多酚化合物的損失,4、10、16 mg/mL的BC分別對應80%、32%、12%的多酚化合物損失率,說明BC的添加量與多酚的保護效果呈正相關。Ratnasooriya等研究發現BC的包埋作用能有效提取出葡萄內多酚化合物[17],同時有研究使用BC抑制果汁褐變[18],其研究結論與BC抑制LFBE內多酚化合物氧化的結果一致。

圖1 多酚含量隨貯藏時間的變化Fig.1 The change of polyphenol content along with storage time注:不同字母代表顯著性差異(p<0.05);圖2、圖3同。

由圖2可以看出,LFBE在0 h的DPPH自由基清除率最高,由于BC的包合作用,使得BLFBE在0 h的DPPH自由基清除率低于LFBE。同時,隨著BC添加量增加,BLFBE在0 h的DPPH自由基清除率逐漸降低,說明LFBE內部分抗氧化成分被BC包埋。隨著貯藏時間增加,LFBE的DPPH自由基清除率一直下降,并在12 h內由67.95%±2.16%下降至9.16%±1.65%,其DPPH自由基的清除能力損失約86%。BC的包埋作用則能明顯抑制BLFBE在12 h內對DPPH自由基清除率的迅速降低,添加4、10、16 mg/mL的BC,12 h后BLFBE分別保留了約40%、74%、87%的DPPH自由基清除能力,說明BC的添加量與其對DPPH自由基清除率的保護效果呈正相關。

圖2 DPPH自由基清除率隨貯藏時間的變化Fig.2 The change of DPPH clearance along with storage time

圖3 ·OH自由基清除率隨時間變化圖Fig.3 The change of ·OH clearance along with storage time

由圖3可以看出,LFBE與添加不同量BC的BLFBE在0 h對·OH自由基清除能力沒有明顯差異。隨著貯藏時間的增加,LFBE的·OH自由基清除率一直下降,在12 h內由72.97%±3.01%下降至11.14%±3.16%,其·OH自由基清除率能力損失約84%。BC的包埋作用亦能顯著保護BLFBE在12 h內對·OH自由基清除能力,添加4、10、16 mg/mL的BC后,12 h后BLFBE分別保留了約45%、64%、81%的DPPH自由基清除能力,說明BC的添加量與其對·OH自由基清除率的保護效果呈正相關。此結果與Thammarat Aree等研究BC抑制綠茶抗氧化能力下降的結果相符[19]。因此,采用BC包埋LFBE的方式作為抑制LFBE多酚化合物氧化,保持其抗氧化活性的方法是可行的。

2.2 BC抑制LFBE褐變

植物乳桿菌發酵大麥粉過程中,其產生的胞外酯酶水解結合態多酚與多糖間的酯鍵,使結合態多酚變成游離態多酚。同時,發酵過程中產生的低pH環境也會使結合態多酚從大分子多糖上脫落,因此LFBE內多酚化合物含量顯著增加。當LFBE內未添加保護劑時,其多酚化合物易被氧化而失去其原有活性,還會引起LFBE褐變[20-21]。采用色度儀分析LFBE與BLFBE在24 h內的色度變化,研究BC包埋作用抑制LFBE褐變的效果。實驗結果如圖4所示,LFBE在0 h的L*值相對BLFBE的較小,且隨著貯藏時間增加,其L*值逐漸降低,說明其褐變程度逐漸加深。隨著BC添加量增加,BLFBE在0 h的L*值沒有明顯差異,但在24 h內的L*值越穩定,說明BC能有效抑制LFBE褐變,且BC添加量與褐變抑制效果呈正相關。同時,從圖5、圖6可以看出,隨著BC添加量的增加,BLFBE的a*與b*值也愈加穩定。從L*、a*、b*值隨時間的變化趨勢,說明BC能顯著抑制LFBE褐變,且使LFBE色度在一段時間內保持穩定性。此結果與Aguilera Yolanda等采用BC包埋花青素以保持飲料色度穩定的結果一致[22]。

圖4 L*值隨貯藏時間的變化。Fig.4 The change of L* along with storage time注：不同字母代表顯著性差異(p<0.05)，圖5、圖6同。

圖5 a*值隨貯藏時間的變化Fig.5 The change of a* along with storage time

圖6 b*值隨貯藏時間的變化Fig.6 The change of b* along with storage time

2.3 BC改變LFBE的微觀結構

利用掃描電子顯微鏡對樣品進行微觀結構觀察,BC、LFBE凍干粉、BMLFBE及BLFBE凍干粉的掃描電鏡圖如圖7所示。從掃描電鏡圖可以看出,BC為不規則片狀晶體;LFBE凍干粉為不規則、凹凸不平的片狀結構;BMLFBE為不規則片狀結構與片狀晶體的混合體;BLFBE凍干粉中出現類球型結構,此結構與于遲研究的環糊精包埋物相似[23],說明BC成功包埋了LFBE中小分子化合物。同時,LFBE凍干粉的不易分散絮狀結構在BC的包埋作用下轉變為易分散的粉狀結構,說明BC的包埋作用也增加了LFBE凍干粉的分散性。

圖7 掃描電鏡圖(800×)Fig.7 The picture of scanning electron microscope(800×)

2.4 BLFBE出現晶體結構

圖8 X-射線衍射分析結果Fig.8 The result of X-ray diffraction analysis

X-射線衍射技術是研究晶體中分子三維結構幾何性質的一種技術,其衍射線在空間的分布規律是由晶胞大小、形狀和位相決定的,而其衍射束的強度則取決于原子種類和原子在晶胞內的位置。分析結果如圖8所示。BC的X-射線衍射圖是典型的晶體物質譜圖,其在角分別為6.2°、8.9°、10.5°、12.4°、12.6°、14.8°、15.3°、16°、17.1°、17.9°、18.9°、19.3°、20.9°、22.9°、24.3°、25.6°、27°處有特征衍射峰;而LFBE凍干粉的X-射線衍射圖譜為一個較鈍的角,表明LFBE凍干粉是非結晶性、無定型結構;BMLFBE在角分別為12.6°、14.9°、17.1°、17.8°、18.9°、19.5°處有特征衍射峰,但這些特征衍射峰與BC的部分特征衍射峰是相同的,說明此特征衍射峰是摻雜在LFBE凍干粉內BC晶體的特征峰;BLFBE凍干粉在角分別為11.6°、12.6°、14.8°、17.1°、19.3°、20.9°、22.9°處有特征衍射峰,其11.6°、17.1°處特征衍射峰與BC、BMLFEB的特征衍射峰都不同,說明BC包埋LFBE不是簡單的混合,而是有晶體形成。因此,相比LFBE凍干粉的無定型結構,BC的包埋作用使BLFBE凍干粉出現晶體結構,而顯著提高BLFBE凍干粉結構穩定性。

3 結論

BC的包埋作用能有效保護LFBE的抗氧化活性,提高其對DPPH和·OH自由基清除能力的穩定性,并防止LFBE發生褐變。其作用原理是BC的包埋作用將LFBE中的易氧化類化合物包埋入BC微囊中,將LFBE凍干粉原有不易分散的絮狀結構轉變為易分散的類球狀顆粒結構,同時生成部分晶體結構,從而提高了BLFB的結構穩定性。因此,采用BC直接包埋LFBE不僅可保護LFBE的抗氧化活性,提高其結構穩定性,也有助于擴大LFBE的應用范圍。

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The improvement of antioxidant and structural stability of fermented barley extract withLactobacillusplantarumwithβ-cyclodextrin

LI Ming-song,DONG Ying*,ZHANG Jia-yan,ZHAO Yan-sheng

(School of Food and Biological Engineering,Jiangsu University,Zhenjiang 212013,China)

β-cyclodextrin(BC)was used to improve the antioxidantand microstructure stability of fermented barley extract withLactobacillusplantarum(LFBE)in order to keep bioactivity of LFBE. LFBE was embedded with BC(BLFBE)and dried with freed-dried method.X-ray diffraction and scanning electron microscope technologies were used to analyze microstructure of BLFBE. The results of antioxidant experiments showed that polyphenol content in LFBE decreased from(0.30±0.11) mg/mL to(0.019±0.0023) mg/mL,its DPPH clearance reduced from 67.95%±2.16% to 9.16%±0.65%,and its ·OH clearance decreased from 72.97%±3.01% to 11.14%±3.16% after storing 12 h at normal temperature. After LFBE embedded with 1.6 mg/mL BC,polyphenol content of BLFBE merely decreased from(0.25±0.015) mg/mL to(0.21±0.01) mg/mL,its DPPH clearance only reduced from 52%±2.01% to 45%±2.43%,and its ·OH clearance only decreased from 67.16%±1.31% to 54.74%±2.53%. The results of chroma experiments indicated that BC inhibited the browning of LFBE. The results of scanning electron microscope showed that LFBE was irregular sheet structure,but appeared near-spherical structure after embedded with BC. X-ray diffraction experiment indicated that LFBE powder was armorphous and shapeless structure,but BLFBE appeared crystal structure after embedded with BC. Therefore,BC significantly inhibited the descent on antioxidant activity of LFBE,and embedding function of BC also improved structural stability of BLFBE.

β-cyclodextrin;Lactobacillusplantarum;barley;polyphenol;antioxidant activity;microstructure;stability

2016-11-04

李明松(1990-)，男，碩士，研究方向：食品營養,E-mail:a1057194600@163.com。

*通訊作者:董英(1954-)，女，大學本科，教授，研究方向：食品營養與安全，E-mail:ydong@ujs.edu.cn。

江蘇高校優勢學科建設工程項目。

TS210.1

A

1002-0306(2017)10-0146-06

10.13386/j.issn1002-0306.2017.10.020