牛奶中β-內酰胺酶抑制劑
——舒巴坦直接競爭ELISA的分析研究

沙芳芳,劉衛華,王 敬,于文龍,王向紅

(河北農業大學食品科技學院,河北保定 071001)

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牛奶中β-內酰胺酶抑制劑
——舒巴坦直接競爭ELISA的分析研究

沙芳芳,劉衛華,王 敬,于文龍,王向紅*

(河北農業大學食品科技學院,河北保定 071001)

建立代表性的β-內酰胺酶抑制劑-舒巴坦直接競爭酶聯免疫吸附分析法(dcELISA)。通過對封閉液濃度、離子濃度、pH、包被條件等分析條件優化后建立dcELISA,并進行應用。結果表明方法的IC50為5.25 ng/mL,IC15為1.07×10-3ng/mL,板內和板間平均變異系數分別為6.69%、9.02%,對他唑巴坦和克拉維酸的交叉反應率分別是7.12%、0.93%。牛奶樣品的添加回收率在85.66%～89.23%之間。該方法靈敏度較高,穩定性較好,特異性較強,可以應用于乳制品中舒巴坦殘留的快速檢測。

舒巴坦,直接競爭酶聯免疫法,檢測方法

舒巴坦(sulbactam,SBT),又稱青霉烷砜酸,是一種競爭性不可逆的β-內酰胺酶抑制劑,對革蘭氏陽性和陰性菌產生的大多數β-內酰胺酶有較強的抑制作用[1]。已有研究證明,舒巴坦可引起乳酸脫氫酶、堿性磷酸酶和轉氨酶的升高,還可能引起過敏反應,并能透過胎盤到達胎兒體內,危害健康[2-3]。

我國非常重視食品安全,農業部235號公告[4]對乳品中抗生素殘留作出了嚴格規定。一些不法分子為了逃避抗生素檢測,在乳品中加入β-內酰胺酶分解殘留的抗生素。因此,國家在“打擊非法添加非食用物質和濫用食品添加劑”專項整治行動中,將β-內酰胺酶列為非食用物質且禁止在食品中添加。某些商家又為了逃避β-內酰胺酶的檢測,將舒巴坦添加到乳品中,使β-內酰胺酶失去活性,不能被檢出[5-6],給乳品埋下安全隱患,嚴重威脅消費者的身體健康。

國內外常用的舒巴坦檢測方法主要有分光光度法[7-8]、高效液相色譜(HPLC)[9-12]、高效液相色譜-質譜(HPLC-MS)[13-15]。姜紅[16]等人采用分光光度法測定注射用頭孢哌酮鈉和舒巴坦鈉的含量。該方法靈敏度較低,且多用于藥物中舒巴坦的測定。林欽[17]利用高效液相色譜同時測定乳制品中的克拉維酸、他唑巴坦和舒巴坦。張立[18]等人利用超高壓液相色譜-串聯質譜法同時測定牛奶中的β-內酰胺類抗生素(頭孢噻肟、頭孢哌酮)和其酶抑制劑(舒巴坦、他唑巴坦)。這些儀器分析方法樣品前處理復雜,所需儀器昂貴,對操作人員要求較高,不適用于現場大批量樣品的快速檢測[19]?，F階段,關于牛奶中舒巴坦檢測的酶聯免疫吸附法(ELISA)還未見報道。基于抗原抗體特異性反應建立的酶聯免疫分析法,靈敏度高、特異性強、操作簡便、不需要復雜儀器設備[20],適用于現場大通量樣品的檢測,在我國有非常廣泛的應用前景。而與間接競爭ELISA相比,直接競爭ELISA簡化了檢測步驟,縮短了檢測時間,在實際應用中具有顯著優勢。

本研究旨在建立一種直接競爭ELISA法,用于牛奶中舒巴坦的快速檢測,以期為乳品安全提供更有效的保障,切實保障消費者的身體健康。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

舒巴坦(SBT)、辣根過氧化酶(HRP) 上海源葉科技有限公司;牛血清白蛋白(BSA)、四甲基聯苯胺(TMB) Sigma公司;抗SBT多克隆抗體 本實驗室自制;96孔酶標板 美國Costar;NaNO2、Na2CO3、NaHCO3、NaH2PO4、Na2HPO4、NaCl(分析純) 天津市科密歐試劑有限公司;免疫動物 雄性新西蘭大耳白(10周齡),1.5～2.0 kg。

酶標儀、洗板機 美國Thermo公司;八道微量可調移液槍 德國eppendorf公司;電子感量分析天平 北京賽多利斯儀器有限公司;MS3 digital渦旋混勻器 德國IKA公司;pH計 梅特勒-托利多儀器有限公司;TDL-5冷凍離心機 上海Anke;電熱恒溫培養箱 天津泰斯特儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 緩沖溶液的配制

1.2.1.1 包被緩沖液(CBS,pH=9.6) 準確稱取1.6 g Na2CO3與2.9 g Na3HCO3,加雙蒸水至1000 mL,調節pH至9.6。

1.2.1.2 磷酸鹽緩沖液(5×PBS) 準確稱取NaCl 45 g,Na2HPO4·12H2O 68.8 g,NaH2PO4·2H2O 8.97 g,加雙蒸水至1000 mL,并調節pH至7.4。

1.2.1.3 洗滌液(PBST) 取200 mL 5×PBS緩沖溶液,雙蒸水800 mL,10% Tween-20 5 mL,充分混勻后待用。

1.2.1.4 封閉液 5%(w/v)的BSA/PBS溶液。

1.2.1.5 底物液 為3,3′,5,5′-四甲基聯苯胺(TMB)-過氧化氫脲溶液,配制方法如下:

底物A:取β-糊精0.25 g,無水醋酸鈉0.82 g,過氧化氫脲 42.86 mg,加雙蒸水至100 mL,檸檬酸調節pH至5.0,4 ℃保存,使用時需恢復室溫;

底物B:取3,3′,5,5′-四甲基聯苯胺100 mg溶于10 mL二甲基亞砜;

使用前15 min,將底物A與底物B進行混合。

1.2.1.6 終止液 1.25 mol/L硫酸。

1.2.2 動物免疫程序 選取10周齡左右,體重為2 kg左右的新西蘭大耳白兔,在標準實驗動物房中飼養。觀察一周之后,確定身體狀況正常后進行免疫。分別采取多點皮下和大腿肌肉注射法進行免疫。初次免疫人工抗原的量均是1 mg/只,分別于初次免疫后2、4、6、8周進行加強免疫。第二、三、四、五次加強免疫完后10 d,兔子耳緣靜脈取血后進行抗血清效價與特異性的測定。第五次加強免疫后10 d進行心臟取全血,4 ℃離心15 min,收集全部血清。

1.2.3 抗體的純化 采用Protein A-Sephaorse 4B親和層析法對抗體進行純化。以1×PBS為空白,在280 nm處測吸光度值,計算抗體濃度。

1.2.4 ELISA操作步驟 包被:用CBS稀釋抗血清,4 ℃包被過夜;封閉:PBST洗板3次,加入封閉液,37 ℃封閉1 h;加樣:PBST洗板3次,用1×PBS將SBT標準品稀釋成10000、1000、10、1、0.01、0.0001 ng/mL,50 μL/well,再加入50 μL稀釋到最佳倍數的酶標抗原,并設空白和陰性對照,37 ℃孵育1 h;顯色:PBST洗板5次,加入TMB顯色劑,37 ℃顯色30 min;終止:加入終止液,用酶標儀在450 nm下測定OD值。

1.2.5 直接ELISA反應體系條件的優化

1.2.5.1 抗SBT抗體與酶標抗原最佳工作濃度的確定 采用矩陣法確定直接競爭ELISA法的抗SBT抗體與酶標抗原最佳工作濃度。用1×PBS將初始濃度為653.55 μg/mL的抗體依次稀釋為16、14、12、10、8、6、4、0 μg/mL,加入96孔酶標板,4 ℃包被過夜;PBST洗板3次,加入封閉液,37 ℃封閉1 h;PBST洗板3次,加入用PBS梯度稀釋的酶標抗原,37 ℃孵育1 h;PBST洗板5次,加入TMB顯色劑,37 ℃顯色30 min;加入終止液,用酶標儀在450 nm下測定OD值,以OD值為1.0左右確定抗SBT抗體與酶標抗原最佳工作濃度。

1.2.5.2 封閉液濃度的優化 將抗SBT抗體稀釋至最佳工作濃度,包被過夜;采用不同濃度(0%、2.5%、5%、10%)的牛血清白蛋白(BSA)磷酸鹽緩沖液進行封閉,再依次進行加樣、顯色和終止步驟。選擇OD為1.0左右,靈敏度高的封閉液濃度作為最佳條件。

1.2.5.3 離子濃度的優化 將抗SBT抗體稀釋至最佳工作濃度,包被過夜;用最適濃度的牛血清白蛋白(BSA)磷酸鹽緩沖液進行封閉;采用不同的離子強度(雙蒸水、1×PBS、2×PBS、3×PBS、4×PBS、5×PBS)稀釋SBT標準品后,進行加樣,顯色和終止步驟。選擇OD為1.0左右,靈敏度高的離子濃度作為最佳條件。

1.2.5.4 pH的優化 將抗SBT抗體稀釋至最佳工作濃度,包被過夜;用最適濃度的牛血清白蛋白(BSA)磷酸鹽緩沖液進行封閉;采用不同pH的磷酸鹽緩沖液(4.5、5.5、6.5、7.5、8.5、9.5)稀釋SBT標準品后,進行加樣,顯色和終止步驟。選擇OD為1.0左右,靈敏度高的pH作為最佳條件。

表1 SBT抗體與酶標抗原稀釋度的確定Table 1 The optimum concentration of SBT antibody and enzyme labeled antigens

1.2.5.5 包被條件的確定 將抗SBT抗體稀釋至最佳工作濃度,采用不同的條件(4 ℃過夜、37 ℃孵育1 h、37 ℃孵育2 h)進行包被;用最適濃度的牛血清白蛋白(BSA)磷酸鹽緩沖液進行封閉;采用最適pH的磷酸鹽緩沖液稀釋SBT標準品后,進行加樣,顯色和終止步驟。選擇OD為1.0左右,靈敏度高的包被條件作為最佳條件。

1.2.6 標準曲線繪制 在最優工作條件下,將SBT標準品稀釋為10000、1000、10、1、0.01、0.0001 ng/mL,采用直接競爭ELISA法,以SBT濃度的對數為橫坐標X,抑制率為縱坐標Y,繪制標準曲線,并確定其靈敏度(IC50)、最低檢測限(IC15)以及線性檢測范圍。抑制率計算公式如下:

式(1)

1.2.7 抗體特異性與精密度

1.2.7.1 特異性 他唑巴坦、克拉維酸與SBT都屬于β-內酰胺酶的抑制劑,三者結構相近。將他唑巴坦、克拉維酸配成不同質量濃度的溶液作為待測樣品,采用直接競爭ELISA法檢測,按式(2)計算交叉反應率。

式(2)

1.2.7.2 精密度 對建立的ELISA方法進行板內與板間變異系數的分析測定。板內和板間變異系數分別是同一包被批次與不同包被批次的SBT標準曲線的變異系數。

1.2.8 樣品的檢測

1.2.8.1 樣品的前處理 準確稱取牛奶樣品15 g,加入5 mL三氯醋酸(TCA,300 g/L),高速渦旋5 min后,于5000 r/min離心15 min,取上清液,加入NaOH調節pH到7.0。將牛奶樣品處理后所得的上清液,用1×PBS分別進行0倍、10倍、20倍、40倍、80倍稀釋后,繪制基質曲線,再與標準曲線進行對比,以考察樣品基質的影響。

1.2.8.2 添加回收率測定 向空白牛奶中分別添加25、50、100 μg/kg的標準品,按照1.2.7.1方法進行樣品處理,dcELISA測定樣品中SBT濃度,每個樣品設3個重復,計算回收率。

2 結果與分析

2.1 直接ELISA反應體系條件的優化

2.1.1 SBT抗體與酶標抗原最適工作濃度 通過方陣法選擇OD值為1.0左右的SBT抗體包被質量濃度與酶標抗原的稀釋度為最佳工作濃度,實驗結果見表1:

由表1可知,包被抗體的最適質量濃度為10.0 μg/mL,酶標抗原最佳稀釋倍數為400。

2.1.2 封閉液濃度的優化 由圖1可以看出隨著封閉液濃度的增加,OD值降低,后期逐漸平穩。這主要是因為,隨著封閉液濃度的增加,游離的結合位點逐漸減少,則結合的酶標抗原也相應減少;當封閉液能夠完全封閉酶標板上的結合位點后,則酶標抗原也不會與板上的位點結合,此時再增加封閉液的濃度,OD值也不減少。當封閉液濃度達到5%時,OD值基本穩定在1.0左右,且IC50與封閉液濃度為10%時相差不大,所以選擇5%的BSA作為封閉液。

圖1 封閉液濃度的優化Fig.1 The selection experiment of blocking solution concentration

2.1.3 離子濃度的優化 在選定的條件下,比較了雙蒸水、1×PBS、2×PBS、3×PBS、4×PBS、5×PBS對ELISA反應體系的影響。由圖2可以看出OD值隨著離子濃度的增加逐漸減小。當離子濃度是1×PBS時,OD值在1.0左右,且IC50最低,故選擇1×PBS作為最適工作濃度。

圖2 離子濃度的優化Fig.2 The optimization of ion concentration

2.1.4 pH的優化 在選定的條件下,比較了不同pH緩沖液對ELISA反應體系的影響,為后續樣品的測定條件提供借鑒。由圖3看出,隨著pH的升高OD逐漸降低;而IC50先降低,于過堿的條件下又升高。當緩沖液pH為7.5時,OD為1.0左右,且IC50最低,所以選擇7.5為最佳反應條件。

圖3 pH的優化Fig.3 The optimization of pH value

2.1.5 包被條件的優化 在所確定的條件下,比較了4 ℃過夜、37 ℃孵育1 h和37 ℃孵育2 h三種包被條件的OD值和IC50。由圖4可以看出,當包被條件為4 ℃過夜時,OD值較大,并且IC50最低,因此選其作為最佳包被條件。

圖4 包被條件的優化Fig.4 The optimization of different conditions of coating

2.2 標準曲線的繪制

將SBT標準品稀釋為10000、1000、10、1、0.01、0.0001 ng/mL,在確定的最優條件下繪制標準曲線,并進行方程的擬合(見圖5),擬合方程為Y=4.121X+43.17(R2=0.9941),IC50是5.25 ng/mL,IC15可以達到1.07×10-3ng/mL,靈敏度較高。

圖5 舒巴坦標準曲線的擬合Fig.5 Equation fitting of standard curve for detecting sulbactam

2.3 抗體的特異性

用上述所建立的直接競爭ELISA法對舒巴坦的結構類似物他唑巴坦和克拉維酸進行直接競爭實驗。實驗結果(表2)表明,抗體對他唑巴坦和克拉維酸的交叉反應率分別為7.12%、0.93%,說明實驗獲得的抗體具有很高的特異性。

表2 SBT抗體對他唑巴坦、克拉維酸的交叉反應率Table 2 The Cross-reactivity of tazobactam,clavulanic acid

表3 板內與板間變異實驗Table 3 Plate variation with inter-assay and intra-assay

2.4 方法的精密度

通過對板內與板間系數的分析,確定板內變異系數與板間平均變異系數分別是6.69%、9.02%。因此,該方法的準確性比較高,可以滿足食品中SBT檢測的要求。

2.5 樣品的添加回收率

2.5.1 樣品的基質消除 如圖6所示,未經稀釋的、稀釋10倍的與稀釋20倍的牛奶樣品上清液的基質曲線與標準曲線均不能重合,說明基質影響沒有消除。而樣品上清液經過40倍稀釋后繪制的基質曲線與標準曲線均基本吻合,說明基質影響基本消除。因此,樣品提取液稀釋40倍后可以直接用于dcELISA檢測。

圖6 牛奶曲線與標準曲線的比較Fig.6 Comparison between curves of SBT in milk and standard curve of SBT

2.5.2 添加回收率 在陰性牛奶樣品中分別添加不同量的SBT標準品,每一濃度重復5次,求出平均ELISA結果,計算添加回收率(見表4)。結果顯示回收率在85.66%～89.23%之間,變異系數為1.19%～6.59%。

表4 牛奶的添加回收實驗(n=5)Table 4 Test of recovery in milk(n=5)

3 結論

通過對直接競爭ELISA反應體系中封閉液濃度、離子濃度、包被條件和pH進行優化,建立了舒巴坦直接競爭ELISA分析方法。該方法的IC50值為5.25 ng/mL,IC15值為1.07×10-3ng/mL,檢測的線性范圍為0.0001～1000 ng/mL。抗體與同屬于β-內酰胺酶抑制劑的他唑巴坦和克拉維酸的交叉反應率較低,分別為7.12%、0.93%。該方法對牛奶平均回收率在85.66%～89.23%之間,變異系數為1.19%～6.59%,靈敏度較高,穩定性好,可以應用于乳制品中舒巴坦殘留的快速和大批量檢測。本實驗室以此實驗為基礎,正在進行電化學免疫傳感器的研究,以期可以建立更加靈敏、快速的舒巴坦檢測方法。

[1]劉珊珊,單藝,滿朝新,等. 高效液相色譜-二極管陣列檢測法測定原料乳中的舒巴坦[J]. 食品工業科技,2012,33(16):64-66.

[2]馬曉斐,張敬軒,李揮,等. 超高效液相色譜-串聯質譜法同時測定液態奶中克拉維酸和舒巴坦[J]. 食品科學,2013,34(16):257-260.

[3]薛霞,王駿,劉桂亮,等. 親水作用色譜-串聯四極桿質譜測定液態奶中舒巴坦[J]. 分析測試學報,2012,31(6):700-704.

[4]農業部.中華人民共和國農業部第235號公告. 動物性食品中獸藥最高殘留限量[Z].2002.

[5]郭啟雷,王浩,楊紅梅,等. 液相色譜-串聯質譜法測定牛奶中舒巴坦和他唑巴坦[C].質譜學報,2009,30(增刊):162-164.

[6]丁紅梅,李進軍,李靜. 原料乳中舒巴坦的測定——高效液相色譜儀-二極管陣列檢測法[J]. 食品安全導刊,2015(33):97-98.

[7]全紅,白小紅,杜江. 分光光度法測定注射用頭孢哌酮鈉/舒巴坦鈉藥物含量[J]. 山西醫科大學學報,2003,34(6):573-574.

[8]Vu Dang Hoang,Nguyen Thi Loan,Vu Thi Tho,et al. UV spectrophotometric simultaneous determination of cefoperazone and sulbactam in pharmaceutical formulations by derivative,Fourier and wavelet transforms[J]. Spectrochimica Acta Part A:Molecular and Biomolecular Spectroscopy,2014,121:701-714.

[9]Dinc E,Baleanu D,Kucukbagriacik E. Ultra Performance Liquid Chromatography for the Quantitative Analysis of Ampicillin Sodium and Sulbactam Sodium in a Pharmaceutical Preparation[J]. Revista de Chimie-Bucharest-Original Edition,2012,63(5):451-454.

[10]Qi Pei,Guo-Ping Yang,Zuo-Jun Li,et al. Simultaneous analysis of amoxicillin and sulbactam in human plasma by HPLC-DAD for assessment of bioequivalence[J]. Journal of Chromatography B,2011,879(21):2000-2004.

[11]A J Shah,M W Adlard,J D Stride. A sensitive assay for clavulanic acid and sulbactam in biological fluids by high-performance liquid chromatography and precolumn derivatization[J]. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis,1990,8(5):437-443.

[12]Jun Haginaka,Yuki Nishimura. Simultaneous determination of ampicillin and sulbactam by liquid chromatography:post-column reaction with sodium hydroxide and sodium hypochlorite using an active hollow-fibre membrane reactor[J]. Journal of Chromatography B:Biomedical Sciences and Applications,1990,532:87-94.

[13]彭力,陳華,徐波,等. 高效液相色譜梯度洗脫法測定注射用美洛西林鈉-舒巴坦鈉中有關物質[J]. 中南藥學,2013(6):462-466.

[14]Zhou Y,Zhang J,Guo B,et al. Liquid chromatography/tandem mass spectrometry assay for the simultaneous determination of cefoperazone and sulbactam in plasma and its application to a pharmacokinetic study[J]. Journal of Chromatography B Analytical Technologies in the Biomedical & Life Sciences,2010,878(30):3119-3124.

[15]鄭小嚴,林欽,游飛明,等. 超高效液相色譜-串聯四極桿質譜法同時檢測乳制品中β-內酰胺酶抑制劑克拉維酸鉀、他唑巴坦和舒巴坦的殘留量[J]. 分析實驗室,2013(7):47-51.

[16]姜紅,范藝騰. 導數分光光度法測定注射用頭孢哌酮鈉和舒巴坦鈉的含量[J]. 華西藥學雜志,1999,14(z1):401-402.

[17]林欽. 高效液相色譜法同時檢測乳制品中3種β-內酰胺酶抑制劑的殘留量[J]. 色譜,2013,31(5):441-446.

[18]張立,李娜思,馮峰,等. 超高壓液相色譜-串聯質譜法測定牛奶中的β-內酰胺類抗生素及其酶抑制劑[J]. 食品安全質量檢測學報,2013(6):1821-1827.

[19]奚茜,張明洲,李沐潔,等. 鏈霉素殘留檢測直接競爭ELISA法的建立[J]. 中國食品學報,2013,13(11):124-131.

[20]陶光燦,李勇,崔廷婷,等. 酶聯免疫吸附法檢測動物源性食品中氨苯砜殘留[J]. 食品與生物技術學報,2013,32(7):778-783.

Research on the direct competition ELISA analysis ofβ-lactamase inhibitor-sulbactam in milk

SHA Fang-fang,LIU Wei-hua,WANG Jing,YU Wen-long,WANG Xiang-hong*

(College of Food Science & Technical,Agricultural University of Hebei,Baoding 071001,China)

The aim of this study was to establish a direct competitive enzyme-linked immunoassay(dc-ELISA)method to detect the representativeβ-lactamase inhibitor-sulbactam in dairy products. After analyzing the condition of blocking solution concentration,ion concentration,coating conditions,pH,and other optimization,this developed method presented an IC50of 5.25 ng/mL,a detection limit IC15of 1.07×10-3ng/mL. Intra-and inter-batch relative standard deviations(RSD)were 6.69%,9.02%,respectively. The cross-reactivity rates for tazobactam and clavulanic acid were 7.12%,0.93%,respectively. The recoveries of milk in spiked samples ranged from 85.66%～89.23%. The developed dcELISA method was satisfied for the the field of mass rapid screen of sulbactam residue in milk samples.

sulbactam;dcELISA;test method

2016-11-08

沙芳芳(1991-)，女，碩士研究生，研究方向：食品安全，E-mail：shp14181514@163.com。

*通訊作者:王向紅(1973-)，博士，教授，研究方向：食品科學，E-mail:wangxianghong@hebau.edu.cn。

國家重點研發計劃 (2016YFD0401101)；河北省科技支撐項目(152776120D)。

TS207.3

A

1002-0306(2017)10-0067-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.10.005