甘草酸微生物轉化菌的篩選鑒定及發酵條件優化

蘇龍++梁廣波++陳光麗++韋玉華++潘雪梅++王雪儒

摘要：首先，采用單因素方法對碳源、氮源、發酵接種量、初始pH、發酵時間、發酵溫度等因素進行考查，在此基礎上進行4因素3水平的正交試驗優化。得到的優化發酵條件是甘草浸出液10%，發酵溫度40 ℃，pH 5.0，接種量10%，裝液量75 mL/250 mL，發酵時間為6.5 d，180 r/min。在最優條件下，甘草次酸的量達到7.67 mg/mL。

關鍵詞：米曲霉；微生物轉化；甘草；甘草酸；甘草次酸；優化

中圖分類號：TQ925 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2017）10-1918-06

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.10.030

Screening and Identify of the Glycyrrhizic Acid Microbial Transformation and Optimization of Fermentation Conditions for Glycyrrhetic Acid by Microorganism

SU Long，LIANG Gang-bo，CHEN Guang-li，WEI Yu-hua，PAN Xue-mei，WANG Xue-ru

（College of Biology & Pharmacy of Yulin Normal University，Yulin 537000，China）

Abstract：Firstly，using single-factor test，the effects of these 5 parameters，i.e.，carbon source，nitrogen source，the inoculation amount，initial pH of medium， fermentation time，fermentation temperature on the glycyrrhetic Acid yield were studied. Then the key parameters of fermentation conditions were statistically optimized through the orthogonal array experiments with 4 factors in 3 levels. The optimal conditions were licorice digester liquid 10%，initial pH 5.0，rotation speed 180 r/min，10% inoculum size in 75 mL working volume（in 250 mL flasks） at 40 ℃ for 6.5 d. Using these conditions，the the glycyrrhetic acid yield was 7.67 mg/mL.

Key words： aspergillusoryzae；microbialtransformation； licorice； glycyrrhizic acid； glycyrrhetic acid； optimized

甘草屬于豆科植物。中國西部、俄羅斯及歐洲分布較多。自古以來，甘草在很多國家廣為藥用，尤其在中國醫藥學中許多配方都有甘草和甘草浸膏。中醫理論認為甘草性平味甘，具有和中緩急、潤肺、解毒、祛痰、止咳、通經脈、利氣血、調和諸藥等功效，為臨床廣泛應用[1]。近年來，隨著藥理活性試驗方法的發展和完善，發現甘草還具有明顯的抗炎，抗潰瘍作用和抗變態反應作用[2]。日本學者熊谷朗[3]進一步證明甘草還具有抗病毒性肝炎，慢性肝炎作用。彭子模等[4]也報道了甘草具有抗愛滋病毒的作用。大量研究證明，上述作用主要歸因于甘草的主要成分甘草甜素和甘草次酸及其衍生物。因此，甘草次酸及其衍生物的研究開發，是近幾十年來各國科學家研究的熱點之一。

甘草的腸道代謝及藥代動力學研究[5，6]表明甘草酸在腸道內緩慢地轉化為甘草次酸。甘草酸經人口服后，血漿中主要測出甘草次酸，而未測到甘草酸。普通和無菌大鼠均給予甘草酸口服，普通大鼠血漿中可以測出甘草次酸，但沒有原形物3甘草酸，而在無菌大鼠血漿中未測到甘草次酸。分別口服甘草酸和甘草次酸，血漿中甘草次酸的MRT值出現顯著差異，說明腸道內甘草酸緩慢地轉化為甘草次酸[7-10]。然而，在甘草中甘草次酸的含量較低，只有0.1%左右，其前體甘草酸的含量則比較高，在3.7%～8.3%。因此，利用微生物與中草藥甘草共同發酵生產甘草次酸具有非常重要的意義。

甘草酸與甘草次酸的微生物轉化所需的菌株可從土壤中獲得，也可以來自植物組織，然而如何從這些眾多的菌株當中篩選出能夠轉化產生有價值的目標產物、且專一性強的菌株，是微生物轉化甘草酸和甘草次酸的關鍵環節，方便、快捷的微生物轉化菌株篩選模型的建立是研究的主要內容，也是菌株篩選的有效途徑。周艷艷等[11，12]利用篩選到的酵母菌株YGL-B-0發酵培養72 h甘草次酸的含量為11.70 mg/mL。宋新波等[13]利用海棗曲霉分泌的酶轉化甘草為甘草次酸，也獲得較好的轉化效果。徐靜等[14]以甘草酸單銨鹽為原料，通過酶法轉化的方法制備甘草次酸，經過酶解條件的優化后，甘草次酸的得率達到40.87%。陳永強等[15]利用自行篩選的黃曲霉菌株HG-12轉化甘草，也很好地提高了甘草次酸的含量。何晨[16]利用純度為90%的甘草酸為碳源的篩選模型，從新疆野生甘草土壤中分離篩選得到具有水解甘草酸產生甘草次酸的菌株，并采用發酵法轉化甘草生產甘草次酸，最終濃度為2.22 g/L，達到產業化水平。王云[17]利用從土壤中分離得到的一種綠色木霉進行生物轉化甘草酸，產物為單葡萄糖醛酸基甘草次酸，轉化率約為90%。宋素琴等[18]從脹果甘草不同組織中分離得到的149株內生細菌進行篩選，得到一株能產甘草酸類似物的肉生枯草芽胞桿菌。大量的研究證明，用微生物轉化甘草酸、甘草次酸具有非常大的應用情景，效益高，獲得的目標組分多，但是要獲得專一性強的微生物轉化菌株和適宜的轉化條件還較為困難。加強菌株篩選及其簡便、快捷的轉化條件研究，對利用微生物轉化甘草酸、甘草次酸等甘草成分的工業化生產有重要的意義。本試驗詳細研究了米曲霉對甘草次酸微生物轉化的條件， 優化了轉化條件， 為進一步研究甘草次酸的代謝及新藥開發提供理論指導。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

甘草片（玉林市至真藥業連鎖店），含量90.0%的甘草酸（西安市匯林生物公司），甘草次酸（西安市匯林生物公司），其他試劑均為分析純（國藥集團化學制劑有限公司）。

初篩培養基：甘草酸粉2 g，瓊脂2 g，用蒸餾水定容至100 mL，分裝，121 ℃高壓滅菌20 min。復篩培養基：甘草酸粉2 g，MgSO4 0.05 g、NaNO3 0.5 g、FeSO4 0.001 g、KH2PO4 0.1 g，用蒸餾水定容至100 mL，pH 5.0，121 ℃高壓滅菌20 min。發酵基礎培養基：甘草浸出液10%，pH自然，分裝121 ℃滅菌20 min。

1.2 儀器與設備

Tu21800紫外可見分光光度計（北京普析通用儀器有限責任公司）；HH-s數顯恒溫水浴鍋（江蘇省金壇市醫療儀器廠）；FE20 Five Easy實驗室pH計（梅特勒-托利多儀器上海有限公司）；AL204電子天平（梅特勒-托利多儀器上海有限公司）。

1.3 試驗條件

1.3.1 菌株初篩 配制好初篩培養基平板，從實驗室中草藥轉化菌種庫中篩選能轉化甘草酸為甘草次酸的菌株；能在以甘草酸為惟一碳源的初篩培養基上生長的菌株，即為能轉化甘草酸為甘草次酸的疑似菌株，用復篩培養基液體培養，通過TLC薄層層析和分光光度法檢測甘草次酸，確認轉化菌株。

1.3.2 菌株復篩 ①發酵液的TLC薄層層析檢測。將初篩菌種菌懸液0.2 mL接入30 mL液體培養基中，30 ℃，180 r/min的搖床中發酵培養120 h，以發酵前作為對照。對發酵液作產物TLC檢測，在薄層層析板上有甘草次酸斑點出現的菌株就有可能是能將甘草酸轉化為甘草次酸的菌株即目標菌株。薄層層析板的制備：取30 g硅膠G和100 mL 0.3%的CMC-Na水溶液調成糊狀，在普通玻璃板上涂勻，室溫下過夜晾干，于110 ℃烘干活化30 min，即制成活化的硅膠薄層層析板。甘草次酸標準品的配制：精密稱取甘草次酸5 mg，置100 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，備用。發酵液的處理：各取發酵前及發酵后發酵液2.5 mL，加入5 mL乙酸乙酯，振蕩、靜置分層后將乙酸乙酯于80 ℃水浴中揮干，向揮干物中加入1 mL甲醇，取此甲醇溶液及甘草次酸標準品點樣于前述硅膠板上進行TLC展開分析。TLC條件[16，19，20]展開劑：石油醚-乙酸乙酯-醋酸（2∶1∶0.1），各取甘草次酸標準液、發酵前后試液點樣于同一硅膠板上。碘顯色1 min，至斑點清晰，取出。②發酵液分光光度分析。將初篩的菌種接入復篩培養基中，以10%、50 mL甘草浸煮液作為培養液，30 ℃、180 r/min搖床中發酵4 d。取米曲霉發酵后的甘草液體2.5 mL，加入5 mL的乙酸乙酯放在35 ℃、180 r/min的搖床中萃取，過夜。量取乙酸乙酯層1 mL，依次加入3 mL乙醇、0.2 mL 1%香草醛乙醇溶液和2 mL 80%硫酸，50 ℃水浴10 min，取出放冷，在545 nm處測定OD值[21]。

1.3.3 菌株鑒定 將篩選及純化好的菌種委托上海美吉生物醫藥科技有限公司進行鑒定。

1.3.4 甘草次酸標準曲線測定[16] 精密稱取120 ℃干燥到恒重的甘草次酸標準品10 mg，置于10 mL容量瓶中，加無水乙醇溶解并稀釋至刻度，搖勻。得各組成濃度分別為0.00、0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 mg/mL的系列標準溶液。以0號空白分別于545 nm處測定吸光度，得回歸方程，樣品測定利用回歸方程計算即得。

1.3.5 單因素試驗 以甘草次酸含量為依據，分別考察不同碳源（蔗糖、葡萄糖、麩皮、麥芽糖、玉米粉、淀粉）、不同氮源（蛋白胨、牛肉膏、酵母粉、黃豆粉、硫酸銨、尿素）、不同pH（3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5）、不同接種量（2%、4%、6%、8%、10%、12%）、不同裝液量（25、50、75、100、125、150 mL/250 mL）、不同發酵溫度（20、25、30、35、40、45 ℃）、不同發酵時間（4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5 d）對甘草次酸產量的影響。

1.3.6 正交試驗設計優化 在單因素試驗的基礎上以發酵溫度、發酵液pH、接種量、發酵時間為影響因素，進行4因素3水平正交試驗。

2 結果與分析

2.1 菌株篩選及鑒定

經過初篩、復篩和發酵檢測的篩選，得到一株能把甘草酸轉化為甘草次酸的的菌株，結果見圖1、圖2。將測定的菌株的ITS序列用Blastn軟件與GeneBank中已報道的ITS序列進行同源性比較發現，菌種的ITS序列與在GeneBank登記的Aspergillus oryzae（米曲霉）的ITS序列的同源性達到99%；通過對菌株的菌落形態及結合ITS序列同源性比較，可以確定菌種為Aspergillus oryzae（米曲霉）。

2.2 甘草次酸標準曲線測定

根據所獲得的不同甘草次酸標準品濃度的吸光度，做出甘草次酸標準曲線（圖1）。甘草次酸標準曲線的線性回歸方程為y=0.072 3x+0.001 7，R2=0.998。

2.3 碳源和氮源對甘草次酸量的影響

碳源作為微生物生長所需要的營養因子，對微生物的生長代謝起著重要的作用，并且細胞的干物質中碳約占50%，微生物對碳的需求最大；微生物生長和產物合成也需要氮源，主要用于菌體細胞物質（氨基酸、蛋白質、核酸等）和含氮代謝物的合成。

從圖4、圖5可以看出，碳源和氮源種類對甘草酸的轉化影響不大，麩皮和淀粉的加入可以增加甘草次酸的含量，但幅度不大；其他碳源的加入相反起到抑制作用。無論是添加有機氮源還是無機氮源，對甘草酸量的影響都差不多。可能是由于甘草藥材來源于植物根部，含有多糖類和蛋白質等，經微生物分解后即產生大量碳源和氮源，可滿足微生物的生長營養要求。從總體來看，添加碳源和氮源對甘草次酸量的影響不大，另外從成本方面考慮，本系統發酵過程中只以甘草浸出液為碳源和氮源的來源，不另外加入。

2.4 發酵時間對甘草次酸量的影響

由圖6可知，隨著發酵時間的延長，甘草次酸量逐漸增加，在接種發酵第6.5天時甘草次酸量達到最大；繼續延長發酵時間，甘草次酸量有下降的趨勢。發酵時間不僅影響微生物的生長速率和生長量，且影響微生物的代謝強度和代謝物的多寡，β-葡萄糖醛酸酶屬于米曲霉的次級代謝產物，一般微生物生長到中后期才開始分泌。發酵時間的延長使得菌體的代謝產物β-葡萄糖醛酸酶的含量增大，從而提高甘草酸的轉化率。故發酵時間選擇6.5 d為宜。

2.5 發酵溫度對甘草次酸量的影響

溫度是影響微生物生長和存活的主要環境因素之一，對發酵的影響很大。溫度的高低影響酶的反應，氧的溶解和傳遞速率，菌體生長和產物合成等。由圖7可知，35 ℃發酵時甘草次酸量最高。20 ℃發酵時甘草次酸量最少，說明20 ℃時米曲霉生長緩慢，還沒有酶的分泌或者分泌的酶量較少，甘草次酸量較少。溫度過高，雖然菌種生產速度加快，但也有可能營養成分消耗過快，酶的分泌量也減少，導致甘草次酸量下降；也可能溫度過高不適合酶的轉化反應。

2.6 培養基的初始pH對轉化甘草酸的影響

相對于最適pH而言，過高或者過低的pH環境都會影響到米曲霉的生長，也會影響酶的分泌，更影響到酶催化反應。由圖8可知，當pH為5.0時，發酵液中的甘草次酸量最高，而pH低于或高于5.0，甘草次酸量相應減少，故最適pH選擇5.0。

2.7 菌種接入量對甘草次酸量的影響

由圖9可知，隨著接種量的增加，發酵液中甘草次酸量逐漸增加，接種量為8%時，甘草次酸量最高；超過8%時甘草酸轉化率開始下降。接種量的大小決定于生產菌種在培養中生長繁殖的速度，采用較大的接種量可以縮短菌絲繁殖達到高峰的時間，使產物的形成提前到來，并可減少雜菌的生長機會。但接種量過大或者過小，均會影響發酵。過大會引起溶氧不足，影響產物合成；而且會過多移入代謝廢物，也不經濟；過小會延長培養時間，降低生產效率。本試驗選擇8%為最佳接種量。

2.8 裝液量對甘草次酸量的影響

氧氣是好氧微生物能正常生長繁殖的重要參數之一。溶氧的多少直接影響微生物生長，并影響β-葡萄糖醛酸酶的產量，進而影響發酵轉化率。利用裝液量來研究溶氧的影響，裝液量小的培養基與氧氣的接觸面積大，增加液體的溶氧量。反之，裝液量大的溶氧量較少。由圖10可知，當裝液量為75 mL（250 mL三角瓶）時，甘草次酸量最高；裝液量過多或過少，甘草次酸產量均減少。裝液量與轉化環境的溶氧量有直接的關系，增大溶氧量有利于細胞生長、產酶，促進甘草次酸的產生；裝液量太少，導致細胞生長過快，營養物質消耗過快，反而會影響酶的分泌，進而影響轉化的進行。因此，在轉化甘草酸時，培養基的裝液量為75 mL/250 mL。

2.9 金屬離子對甘草次酸量的影響

由圖11可知，Ca2+、Mg2+對甘草酸的轉化有一定的效果，可能是這兩種離子是β-葡萄糖醛酸酶的激活劑，但甘草次酸增加的幅度不明顯；Mn2+具有抑制作用。從金屬離子的作用來看，對于米曲霉發酵轉化甘草的轉化率提高不明顯，也有可能因為甘草在種植過程或在后期處理的時候已經攜帶有金屬離子，故發酵過程中也不添加金屬離子。

2.10 發酵條件正交試驗

正交試驗方案及結果分析見表1，表2。通過對正交試驗的結果進行分析，可知對甘草酸轉化影響因素的排序為B>C>D>A，即pH、接種量對甘草酸轉化影響較大，發酵溫度、發酵時間對甘草苷轉化影響較小。最佳的組合為A3B2C3D2，即發酵溫度40 ℃，pH為5.0，接種量10%，發酵時間為6.5 d。經驗證在最優條件下，甘草次酸含量最高，達7.67 mg/mL。

3 討論

本試驗通過以甘草酸為惟一碳源的平板篩選法結合薄板薄層層析檢測，從實驗室的中草藥轉化菌庫中篩選到一株能高效轉化甘草酸為甘草次酸的菌株，鑒定為米曲霉。通過單因素和正交試驗對米曲霉發酵甘草轉化甘草次酸的條件進行了優化。最優的發酵條件為甘草浸出液10%，發酵溫度40 ℃，pH為5.0，接種量10%，裝液量75 mL/250 mL，發酵時間為6.5 d。在最優條件下，甘草次酸的含量達到7.67 mg/mL。

雖然本試驗篩選的菌株經過優化后具備了良好的轉化效果，然而，生物反應的技術途徑對中草藥活性成分的轉化非常重要，正確的轉化途徑是成功的開始。目前在中藥活性成分的生物轉化技術中，發展起來的有組織細胞培養、微生物轉化、腸內菌體內轉化、酶促反應及發酵法等。這些技術方法都具有各自的優勢和不足，針對不同類型化合物生物轉化的特點，開展多途徑的轉化研究，為篩選合理的工業化生產工藝創造可能性條件。從文獻報道來看，實現甘草酸、甘草次酸生物轉化的工業化生產還有很長的路要走，在轉化技術方法上還需要不斷地完善。

致謝：本研究得到廣西農產品加工重點實驗室（培育基地）、廣西重點學科生物化工、農產品深加工與安全技術創新團隊資助，謹此致謝！

參考文獻：

[1] 江蘇新醫學院.中藥大辭典[M].上海：上海人民出版社，1997.

[2] 中國科學院上海藥物研究所.生物活性天然產物[M].第一版.北京：科學出版社，1981.

[3] 熊谷朗.國外醫學中醫中藥分冊[M].北京：中醫研究院情報研究室，1983.

[4] 彭子模.甘草次酸及其衍生物的研究現狀和展望[J].中醫藥學報，1998（l）：32-35.

[5] 吳容軍，劉如石.薄層掃描法測定術答口服液中中甘草酸的含量[J].湖南中醫藥學院學報，2000，20（4）：37-38.

[6] 張蓮珠，李海松，呂雪峰.舒痙膠囊中甘草次酸的含量測定研究[J].中國現代應用藥學雜志，2005，22（4）：313-314.

[7] 陳 榮，黃夢嫻，張 玲.HPLC 法測定胃樂膠囊中甘草次酸含量[J].廣西醫學，2005，27（9）：1375-1376.

[8] FRANS G M，RUSSEL，STAN V U，et al.Solid-phase extraction of 18b-glycyrretinic acid from plasma and subsequent analysis by high-performance liquid chromatography[J].Journal of Chromatography B，1998，710：223-226.

[9] 徐子碩.甘草及其制劑中化學成分測定方法進展[J].中草藥，1994， 25（7）：384-386.

[10] 洪永福，林厚文.甘草酸鹽與甘草次酸幾種提取分離方法的比較[J].第二軍醫大學，1991，（2）：176-178.

[11] 周艷艷.轉化甘草酸為甘草次酸菌株的篩選及優等菌株最佳發酵條件的測定[D].河北承德：承德醫學院，2015.

[12] 周艷艷，張 琳，劉 沛，等.菌株YGL-B-0轉化甘草酸過程中甘草次酸含量的測定[J].承德醫學院學報，2015，32（1）：3-5.

[13] 宋新波，黃鴻志，馬百平，等.酶法轉化甘草酸生成甘草次酸的方法[P].中國，201110336688.72011-10-31.

[14] 徐 靜，史高峰，鄧 麗，等.酸解法制取甘草次酸及其純化工藝[J].生物加工過程，2011，9（4）：27-30.

[15] 陳永強，徐 春，徐 凱，等.微生物發酵轉化甘草提高其藥效的研究[J].四川大學學報（自然科學版），2007，44（5）：1147-1150.

[16] 何 晨.甘草的微生物轉化研究[D].成都：四川大學，2006.

[17] 王 云.微生物轉化甘草酸生成單葡萄糖醛酸甘草酸[J].食品工業科技，2005，26（11）：151-152.

[18] 宋素琴，歐提庫爾·瑪合木提，房世杰，等.新疆脹果甘草內生細菌枯草芽胞桿菌產甘草酸類代謝產物的初步研究[J].微生物學通報，2008，35（9）：1439-1442.

[19] 趙劍宇.甘草次酸制備的實驗研究[J].總裝備部醫學學報，1999， 1（1）：24-25.

[20] KIM D H，DONG H K，SEUNG W L，et al.Biotransformation of glycyrrhizin to 18 β-Glycyrrhetintic Acid-3-o-β-D-glucuronide by streptococcus LJ222，a human intestinal bacterium[J]. Biol Pharm Bull，1999，22（3）：320-322.

[21] 劉巖胡，漢芳閻，正魯杰，等.用比色法測定不同產地甘草中甘草酸的含量[J].河北大學學報（自然科學版），1998，18（4）：369.