小麥-濱麥2D/ 2Ns異代換系DM2411的分子細(xì)胞遺傳學(xué)鑒定

劉 洋，趙繼新，談宏斌，王秀娟，李家創(chuàng)，梁邦平，刁慧珊，白宇皓，武 軍，陳新宏

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院，陜西楊陵 712100； 2.陜西省種業(yè)集團(tuán)有限責(zé)任公司，陜西楊凌 712100)

小麥-濱麥2D/ 2Ns異代換系DM2411的分子細(xì)胞遺傳學(xué)鑒定

劉 洋1，趙繼新1，談宏斌2，王秀娟1，李家創(chuàng)1，梁邦平1，刁慧珊1，白宇皓1，武 軍1，陳新宏1

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院，陜西楊陵 712100； 2.陜西省種業(yè)集團(tuán)有限責(zé)任公司，陜西楊凌 712100)

為進(jìn)一步挖掘利用濱麥優(yōu)異基因，并豐富小麥遺傳種質(zhì)資源，利用形態(tài)學(xué)、細(xì)胞遺傳學(xué)、基因組原位雜交(Genomicinsituhybridization，GISH)、EST-STS分子標(biāo)記、SSR分子標(biāo)記等技術(shù)，對(duì)從八倍體小濱麥M842-16和硬粒小麥D4286雜交F7代材料中篩選出的1個(gè)遺傳穩(wěn)定的小濱麥異代換系DM2411進(jìn)行了鑒定。細(xì)胞遺傳學(xué)觀察表明，DM2411的染色體主要構(gòu)型為2n=42=21Ⅱ，遺傳穩(wěn)定。根尖體細(xì)胞和花粉母細(xì)胞的原位雜交研究表明，DM2411含有1對(duì)濱麥Ns基因組。SSR分析表明，DM2411可能缺失了小麥2D染色體。EST分析表明，DM2411可能含有濱麥2Ns染色體。形態(tài)學(xué)調(diào)查表明，DM2411的株高極顯著降低。

小麥；濱麥；代換系；GISH；EST-STS；SSR

小麥野生親緣物種具有許多優(yōu)良性狀，通過(guò)遠(yuǎn)緣雜交可以將小麥親緣物種的有益基因?qū)氲狡胀ㄐ←溨校瑥亩鴶U(kuò)大小麥遺傳變異，達(dá)到改良栽培小麥的目的。濱麥(Leymusmollis(Trin.)Hara，2n=28，NsNsXmXm)，是禾本科(Poaceae)小麥族(Triticeae)大麥亞族(Hordinae)賴草屬(LeymusHochst.)的一個(gè)多年生異花授粉植物[1],具有根系發(fā)達(dá)、莖稈粗壯、大穗多花、抗旱耐鹽堿、抗多種細(xì)菌和真菌病害等優(yōu)良特性[2-3]。濱麥基因組為NsNsXmXm，其中Ns基因組來(lái)自于新麥草屬(PsathyrostachysKeng)[4-5]，而Xm基因組的來(lái)源目前尚未確定。早在20世紀(jì)50-70年代，蘇聯(lián)科學(xué)家通過(guò)胚拯救技術(shù)獲得了四倍體、六倍體小麥與大賴草、濱麥和沙生賴草的雜種，以及雜種的雙二倍體和不完全雙二倍體[6]；Wang等[7]對(duì)6種類型的八倍體小濱麥的染色體組構(gòu)成進(jìn)行分子細(xì)胞遺傳學(xué)分析，確定八倍體小濱麥M842-4、M842-8、M842-12和M842-16的染色體組構(gòu)成為AABBDDNsNs，而M842-10的染色體組構(gòu)成為AABBDDNsNs+2Ta-2Lm(Ns)，M842-13 的染色體組構(gòu)成確定為AABBDDJJ；Li等[8-9]分析了八倍體小濱麥小孢子的發(fā)生、配子體的形成及濱麥染色體的遺傳行為，并利用八倍體小黑麥與八倍體小濱麥雜交，獲得了一個(gè)包含6條黑麥染色體和6條濱麥染色體的小麥-黑麥-濱麥三屬雜種。Wang等[10]根據(jù)細(xì)胞學(xué)和種子貯藏蛋白試驗(yàn)結(jié)果，確定八倍體小濱麥M842-1的染色體組成為AABBDDNsNs，抗病鑒定結(jié)果顯示其對(duì)條銹病免疫，高抗白粉病。

本課題組自20世紀(jì)80年代開始進(jìn)行普通小麥7182與濱麥的雜交研究，陳潄陽(yáng)等[11]、傅 杰等[12-13]通過(guò)胚拯救和秋水仙素加倍技術(shù)獲得普通小麥和濱麥的雜交種，并最終獲得了具有3種穗型的八倍體小濱麥M842(AABBDDJJ或AABBDDNsNs)；利用M842與普通小麥和缺體小麥雜交，培育出了3個(gè)異附加系和2個(gè)異代換系。在此基礎(chǔ)上，趙繼新等[14-15]利用八倍體小濱麥與硬粒小麥品種Trs-372和D4286進(jìn)行雜交，對(duì)雜種F1進(jìn)行了細(xì)胞遺傳學(xué)分析；利用八倍體小濱麥M842-12與硬粒小麥品種Trs-372雜交，選育出1個(gè)含有6條濱麥染色體的小濱麥多重異代換系05DM6；利用小濱麥多重異代換系05DM6和普通小麥7182雜交得到了在千粒重和麥谷蛋白方面優(yōu)于其親本普通小麥7182的二體代換系DM45。

本研究在D4286×M842-16的后代中，篩選出了1個(gè)染色體數(shù)目為2n=42、含有2條濱麥染色體的株系DM2411。本研究擬采用形態(tài)學(xué)、細(xì)胞遺傳學(xué)、基因組原位雜交、EST-STS分子標(biāo)記和SSR分子標(biāo)記等技術(shù)對(duì)該株系進(jìn)行研究，以期了解株系DM2411的形態(tài)特征、遺傳行為、染色體構(gòu)成，及所含濱麥染色體的同源群歸屬等，為進(jìn)一步挖掘利用濱麥優(yōu)異基因、豐富小麥遺傳資源及最終的小麥品種改良提供新的種質(zhì)資源。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試材料包括濱麥(Leymusmollis(Trin.) Hara,2n=28,NsNsXmXm)、華山新麥草(Psathyrostachyshuashanica,2n=14,NsNs)、普通小麥7182(TriticumaestivumL.，2n=42，AABBDD)、硬粒小麥D4286 (Triticumdurum,2n=28,AABB)、八倍體小濱麥M842-16 (基因組AABBDDNsNs,2n=56)及M842-16與硬粒小麥D4286的F7代材料DM2411，均保存于西北農(nóng)林科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院陜西省植物遺傳工程育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。其中，八倍體小濱麥M842-16是由普通小麥(TriticumaestivumL.)品種7182和濱麥經(jīng)胚拯救、秋水仙素染色體加倍而獲得的不完全二倍體。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞遺傳學(xué)分析

根尖體細(xì)胞染色體數(shù)目鑒定：于室內(nèi)將數(shù)粒DM2411種子浸泡，待種子露白后移到墊有雙層濾紙的培養(yǎng)皿內(nèi)發(fā)芽(25 ℃)；當(dāng)根長(zhǎng)至1～2 cm時(shí)用鑷子夾取根尖放入冰水中處理24 h，然后用卡諾氏固定液I (乙醇∶乙酸=3∶1) 固定，于-20 ℃冰箱保存。待一周后，可將根尖轉(zhuǎn)入70%酒精中，45%醋酸洋紅染色制片，Olympus BX60顯微鏡觀察并照相。

花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂中期I (PMC MI)染色體構(gòu)型觀察：田間選取適齡幼穗，用卡諾氏固定液Ⅱ(乙醇∶氯仿∶冰乙酸=6∶3∶1)固定24 h即刻轉(zhuǎn)入70%酒精，45%醋酸洋紅染色制片，Olympus BX60顯微鏡觀察并照相。

1.2.2 基因組原位雜交(GISH)

DNA提取及探針標(biāo)記：采用CTAB法[16 ]提取供試材料全基因組DNA。依照Dig-Nick-Translation Mix試劑盒(Roche,Germany)使用說(shuō)明書對(duì)華山新麥草的全基因組DNA進(jìn)行標(biāo)記。

染色體制片：將DM2411的根尖體細(xì)胞和花粉母細(xì)胞用45%醋酸壓片，液氮冷凍揭片，氣干備用。

GISH參照Han等[17]的方法進(jìn)行。每張制片加20 μL雜交液，包含20×SSC 2 μL、ssDNA(鮭魚精DNA,5 μg·μL-1) 0.5 μL、10% SDS(十二烷基磺酸鈉) 0.5 μL、50%(W/V)DS(硫酸葡聚糖) 4 μL、去離子甲酰胺10 μL、探針DNA 100 ng。80 ℃變性8～10 min，然后轉(zhuǎn)至恒溫箱37 ℃雜交過(guò)夜(16～24 h)。探針雜交信號(hào)用熒光素(FITC)檢測(cè)，洗脫后用PI復(fù)染，加抗褪色劑H-1300后蓋上蓋玻片，用Olympus BX60熒光顯微鏡檢測(cè)，在藍(lán)光下，外源染色體呈現(xiàn)黃綠色，小麥染色體呈現(xiàn)紅棕色，最后用Olympus BX60熒光顯微鏡觀察，Pixera Penguin 150CL顯微數(shù)碼相機(jī)照相。

1.2.3 SSR和EST-STS標(biāo)記分析

SSR標(biāo)記來(lái)源于R?der等[18]和Pestsoval等[19]。EST-STS標(biāo)記來(lái)源于http://wheat.pw.usda.gov/SNP/new/pcr-primers.shtm.網(wǎng)站。PCR反應(yīng)體系為20 μL，包含1×buffer (100 mmol·L-1Tris-HCl，pH 8.3；1.5 mmol·L-1MgCl2)、0.2 mol·L-1dNTPs、50 ng引物、1 UTaqDNA聚合酶、50～100 ng模板DNA。PCR反應(yīng)在PTC-200 (Bio-Rad，USA)上進(jìn)行，擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性1 min，50/55/60 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，32～35個(gè)循環(huán);72 ℃延伸10 min，4 ℃或者15 ℃結(jié)束。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)8%非變性聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳。點(diǎn)樣量為4 μL，150～200 V恒壓條件下電泳2～3 h。硝酸銀染色10 min，顯影液顯色后立即用數(shù)碼相機(jī)照相，保存結(jié)果。

1.2.4 農(nóng)藝性狀調(diào)查

隨機(jī)選取八倍體小濱麥M842-16、硬粒小麥品種D4286、DM2411以及普通小麥品種7182的10個(gè)單株，調(diào)查統(tǒng)計(jì)每個(gè)單株的株高、穗長(zhǎng)、小穗數(shù)、穗粒數(shù)、結(jié)實(shí)率等農(nóng)藝性狀，并利用SPASS Statistic 20對(duì)各性狀進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 DM2411的選育及其細(xì)胞遺傳學(xué)分析

在八倍體小濱麥M842-16與硬粒小麥品種D4286雜交F7代材料中，通過(guò)根尖體細(xì)胞鏡檢，篩選到1株2n=42的植株DM2411。以華山新麥草全基因組DNA為探針進(jìn)行GISH鑒定，結(jié)果顯示，DM2411含有2條完整的黃綠色染色體信號(hào)，推斷其應(yīng)含有2條來(lái)源于濱麥的Ns染色體。隨機(jī)選取DM2411的14粒種子在室內(nèi)發(fā)芽，將根尖固定后播種于大田，經(jīng)鏡檢發(fā)現(xiàn)14粒種子的根尖體細(xì)胞的染色體數(shù)目都為2n=42，GISH鑒定表明所有種子都含有2條Ns染色體(圖1)。

圖1 DM2411根尖體細(xì)胞有絲分裂中期染色體(A)及其原位雜交鑒定結(jié)果(B)

田間選取DM2411的適齡幼穗，對(duì)56個(gè)花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂中期Ⅰ染色體配對(duì)情況進(jìn)行觀察。結(jié)果(圖2A、表1)顯示，DM2411有48個(gè)花粉母細(xì)胞可以正常分裂，并形成2n=21Ⅱ的染色體構(gòu)型，6個(gè)花粉母細(xì)胞具有20個(gè)二價(jià)體和2個(gè)單價(jià)體，2個(gè)花粉母細(xì)胞具有19個(gè)二價(jià)體和4個(gè)單價(jià)體。以華山新麥草全基因組DNA作為探針，對(duì)其花粉母細(xì)胞進(jìn)行GISH鑒定，結(jié)果顯示，DM2411花粉母細(xì)胞在減數(shù)分裂中期Ⅰ都有1個(gè)完整的二價(jià)體，呈現(xiàn)黃綠色信號(hào)，表明DM2411中的2條Ns染色體可以正常配對(duì)形成1個(gè)二價(jià)體(圖2B)。由此說(shuō)明，DM2411是一個(gè)遺傳穩(wěn)定的、包含40條小麥染色體和1對(duì)濱麥Ns染色體的小麥-濱麥二體異代換系。

圖2 DM2411花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂中期I染色體(A)及其原位雜交鑒定結(jié)果(B)

觀察的細(xì)胞數(shù)Observedcells染色體數(shù)Chromosomenumber染色體構(gòu)型Chromosomeconfiguration21Ⅱ20Ⅱ+2Ⅰ19Ⅱ+4Ⅰ染色體配對(duì)ChromosomeparingⅠⅡ環(huán)狀Ring棒狀Rod總數(shù)Total564248620.36(0～4)17.76(16～21)3.06(0～5)20.82(19～21)

2.2 DM2411的SSR分析

利用R?der等[18]和Pestsova等[19]開發(fā)的分布于小麥1D～7D染色體上的SSR標(biāo)記對(duì)DM2411進(jìn)行了分析，結(jié)果(圖3)顯示，小麥1D、3D、4D、5D、6D和7D染色體上的SSR引物在DM2411和普通小麥品種7182中都擴(kuò)增出了預(yù)期的目標(biāo)條帶，而2D染色體上的SSR引物，雖然在小麥品種7182中擴(kuò)增出了預(yù)期的目標(biāo)條帶，但卻不能在DM2411中擴(kuò)增出預(yù)期的目標(biāo)條帶，說(shuō)明DM2411應(yīng)該含有小麥1D、3D、4D、5D、6D和7D染色體，而缺失了小麥2D染色體。

M：DNA ladder；1：普通小麥7182；2：硬粒小麥D4286；3：異代換系DM2411；箭頭指示目標(biāo)條帶。

M:DNA ladder; 1:Triticumaestivumcv. 7182; 2:Triticumdurumcv. D4286; 3:Alien substitution line DM2411;The arrows show the target bands.

圖3 DM2411的SSR分子標(biāo)記分析結(jié)果

Fig.3 The results of SSR analysis on alien substitution line DM2411

2.3 DM2411的EST-STS分析

利用源于http://wheat.pw.usda.gov/SNP/new/pcr-primers.shtm.網(wǎng)站的分布于小麥1D～7D染色體上的EST-STS標(biāo)記對(duì)小濱麥二體異代換系DM2411所含外源染色體的同源群歸屬進(jìn)行了分析，結(jié)果(圖4)顯示，第1、3、4、5、6、7同源群的特異EST-STS引物在普通小麥7182、硬粒小麥D4286和異代換系DM2411中均擴(kuò)增出了預(yù)期的目標(biāo)條帶，但卻不能在濱麥和華山新麥草中擴(kuò)增出特異條帶；第2同源群上的3對(duì)EST-STS引物BE404332、BQ159450和BQ159532在異代換系DM2411中既擴(kuò)增出了小麥基因組的預(yù)期目標(biāo)條帶，同時(shí)也擴(kuò)增出了濱麥和華山新麥草Ns基因組的特異條帶。由此推斷該二體異代換系DM2411應(yīng)該含有濱麥的2Ns染色體，說(shuō)明DM2411為小麥-濱麥2Ns(2D)異代換系。

2.4 DM2411及其親本的形態(tài)學(xué)特征

對(duì)DM2411及其親本普通小麥品種7182、硬粒小麥品種D4286和八倍體小濱麥M842-16的形態(tài)學(xué)特征進(jìn)行了調(diào)查，結(jié)果(表2、圖5)表明，DM2411的株高較親本明顯變矮，差異達(dá)極顯著水平；穗長(zhǎng)顯著長(zhǎng)于親本7182和D4286；分蘗數(shù)顯著低于親本；穗粒數(shù)和結(jié)實(shí)率顯著低于親本7182和D4286；小穗數(shù)顯著大于親本7182和D4286；穗形與親本7182較為接近，均為方形穗。

M：DNA ladder；1：普通小麥7182；2：硬粒小麥D4286；3：異代換系DM2411；4：濱麥；5：華山新麥草；箭頭指示特異目標(biāo)條帶。

M:DNA ladder; 1:Triticumaestivumcv.7182; 2:Triticumdurumcv. D4286; 3:Alien substitution line DM2411; 4:Leymusmollis; 5:Psathyrostachyshuashanica; The arrows show the target bands.

圖4 DM2411的EST-STS分子標(biāo)記分析結(jié)果

數(shù)據(jù)后的大、小寫字母不同表示不同材料間的差異在0.01和0.05水平上顯著。

Different capital and small letters indicate significant differences at 0.01 and 0.05 levels between the substitution line DM2411 and its parents,respectively.

1：普通小麥7182；2：異代換系DM2411。

1:Triticumaestivumcv. 7182; 2:Alien substitution line DM2411.

圖5 異代換系DM2411及其親本普通小麥7182的植株和穗子

Fig.5 Plant and spike of alien substitution line DM2411 and its parentTriticumaestivumcv.7182

3 討 論

本研究利用八倍體小濱麥M842-16與硬粒小麥品種D4286雜交，經(jīng)過(guò)7代自交，在其后代中篩選出1個(gè)染色體數(shù)目為2n=42，且包含2條濱麥Ns基因組的小麥-濱麥異代換系DM2411。細(xì)胞學(xué)觀察表明，DM2411的染色體主要構(gòu)型為2n=21Ⅱ，遺傳穩(wěn)定。根尖體細(xì)胞和花粉母細(xì)胞的原位雜交研究表明，DM2411含有1對(duì)濱麥Ns染色體。本研究中八倍體小濱麥的A和B基因組與來(lái)自硬粒小麥的A和B基因組，理論上可以正常配對(duì)且能完整遺傳，而來(lái)自八倍體小濱麥的D和Ns基因組，在雜交后代自交過(guò)程中會(huì)出現(xiàn)不配對(duì)而隨機(jī)分離的遺傳現(xiàn)象。SSR是鑒定小麥遺傳背景中外源染色體的有力工具。為了確定DM2411所缺失的小麥染色體，本研究采用了R?der等[18]和Pestsova等[19]開發(fā)的來(lái)自于粗山羊草D基因組的SSR標(biāo)記對(duì)小濱麥異代換系DM2411進(jìn)行了分析，結(jié)果顯示，小濱麥異代換系DM2411可能缺失了小麥2D染色體。EST和STS數(shù)據(jù)庫(kù)中大量定位于不同染色體區(qū)段的EST-STS位點(diǎn)為小麥不同基因組間部分同源關(guān)系的分析提供了簡(jiǎn)單高效的方法。本研究采用了在小麥A、B、D染色體組同源群之間有共顯性的EST-STS標(biāo)記，結(jié)果顯示，異代換系DM2411應(yīng)含有與濱麥第2同源群染色體相同的遺傳物質(zhì)，即含有濱麥的2Ns染色體。

株高作為小麥的一個(gè)重要農(nóng)藝性狀，我國(guó)早在20世紀(jì)70年代就開始了矮化育種。劉兆曄等[20]認(rèn)為小麥品種適當(dāng)矮化不僅可以防止倒伏，更重要的是削減了部分莖、葉鞘的生長(zhǎng)，有利于籽粒生長(zhǎng)，從而提高經(jīng)濟(jì)產(chǎn)量。Du等[21-22]利用GISH結(jié)合EST-STS和SSR分子標(biāo)記從小麥和華山新麥草的雜交后代中鑒定出一個(gè)2Ns附加系和一個(gè)2Ns(2D)二體異代換系，兩個(gè)材料的株高較親本在0.05水平上都顯著降低，穗長(zhǎng)都顯著增長(zhǎng)，千粒重顯著增加。本研究中DM2411中含有的Ns基因組來(lái)源于濱麥，而濱麥中的Ns基因組來(lái)源于新麥草屬。DM2411的株高顯著降低，平均株高為43.33 cm，極顯著地低于親本，與Du等[21-22]的試驗(yàn)結(jié)果相吻合，可以推斷2Ns染色體具有降稈作用，可能含有矮稈基因，或是與小麥的其他染色體發(fā)生基因的互作而使植株變矮；但該材料結(jié)實(shí)率較親本有所降低，這與之前華山新麥草的2Ns基因組可以降低株高的同時(shí)也增加了千粒重有所不同，產(chǎn)生這種現(xiàn)象的原因可能是濱麥的2Ns基因組與華山新麥草的2Ns基因組在普通小麥背景中的遺傳效應(yīng)有所不同。

濱麥具有多種有益基因，對(duì)抗病性和改善農(nóng)藝性狀都具有潛在的利用價(jià)值。該小濱麥異代換系的育成，可作為一個(gè)蘊(yùn)含矮稈基因的中間材料，為進(jìn)一步創(chuàng)制新的小麥矮稈種質(zhì)、研究濱麥染色體的形態(tài)結(jié)構(gòu)特征及遺傳機(jī)理、挖掘利用濱麥優(yōu)異基因、豐富小麥遺傳種質(zhì)資源具有重要價(jià)值。

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Molecular Cytogenetic and Morphological Identification of a Wheat-Leymusmollis2Ns (2D) Substitution Line DM2411

LIU Yang1,ZHAO Jixin1,TAN Hongbin2,WANG Xiujuan1,LI Jiachuang1,LIANG Bangping1,DIAO Huishan1,BAI Yuhao1,WU Jun1,CHEN Xinhong1

(1.College of Agronomy,Northwest A&F University,Yangling,Shaanxi 712100,China;2.Shaanxi Seed Group Co.,Ltd.,Yangling,Shaanxi 712100,China)

A wheat-L.mollisalien substitution line DM2411 was identified from the F7progenies of octoploidTritileymusM842-16 andT.durumD4286 by using morphology,cytogenetics,genomicinsituhybridization (GISH),expressed sequence tag-sequence tagged site(EST-STS) and simple sequence repeat (SSR). Cytological studies demonstrated that DM2411 had a chromosome karyotype of 2n=42=21Ⅱ.GISH analysis indicated that DM2411 had a pair of Ns chromosomes fromL.mollis. Analysis with SSR and EST-STS markers showed that the wheat 2Ds chromosomes were substituted by a pair of 2Ns chromosomes fromL.mollisin DM2411. Agronomic trait evaluations showed that the plant height of DM2411 was dramatically lowered. Therefore,the substitution line DM2411 was a dwarf material,which could be exploited as an intermediate material in wheat breeding programs and genetic resources.

Wheat;L.mollis; Substitution line; GISH; EST-STS; SSR

時(shí)間：2017-05-12

2017-01-13

2017-04-13

陜西省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(2015JM3095)；西北農(nóng)林科技大學(xué)唐仲英育種基金項(xiàng)目

E-mail：yyangliu@outlook.com

陳新宏(E-mail：cxh2089@126.com)

S512.1；S330

A

1009-1041(2017)05-0571-07

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