基于BSTFA衍生化法白酒不揮發(fā)有機酸研究

楊會，范文來，徐巖

(江南大學 生物工程學院，釀造微生物與應(yīng)用酶學研究室，教育部工業(yè)生物技術(shù)重點實驗室，江蘇 無錫，214122)

基于BSTFA衍生化法白酒不揮發(fā)有機酸研究

楊會，范文來*，徐巖

(江南大學 生物工程學院，釀造微生物與應(yīng)用酶學研究室，教育部工業(yè)生物技術(shù)重點實驗室，江蘇 無錫，214122)

白酒中不揮發(fā)性有機酸可能是白酒呈酸味的重要化合物，為明晰白酒原酒中不揮發(fā)性有機酸的組成與含量，采用N,O-雙(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺(N,O-bis(trimethylsilyl)trifluoroacetamide，BSTFA)衍生化結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)研究白酒中不揮發(fā)有機酸，共檢測到27種有機酸。通過定量這些有機酸在7種香型白酒原酒中的分布，發(fā)現(xiàn)羥基酸的種類最多，且總濃度最高。在檢測的所有有機酸中乳酸含量最高，在幾百mg/L至幾個g/L之間，遠遠高于其他不揮發(fā)有機酸。大多數(shù)不揮發(fā)有機酸在醬香型、芝麻香型白酒中的含量較高，在清香和鳳香白酒中的含量較低。

白酒；不揮發(fā)有機酸；衍生化；N,O-雙(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺(N,O-bis(trimethylsilyl)trifluoroacetamide，BSTFA)；氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)

白酒有機酸對白酒的香氣、味覺和口感有重要影響。有機酸不僅呈酸的氣味，同時呈現(xiàn)酸味，是白酒中重要香氣成分酯類的前體物質(zhì)。白酒中有機酸通常分為揮發(fā)性有機酸和不揮發(fā)性有機酸。更多的研究關(guān)注白酒揮發(fā)性有機酸[1]以及對白酒香氣的影響，而不揮發(fā)性有機酸研究較少，且主要集中在乳酸[2]、長鏈脂肪酸(如棕櫚酸、油酸和亞油酸等)[2]的研究，以及芳香族有機酸(如苯甲酸、苯乙酸和苯丙酸等)[3]香氣的研究上，對不揮發(fā)性有機酸對口味和味覺的影響更鮮有報道。

不揮發(fā)性有機酸的檢測方法主要有離子色譜法[4-5]、高效液相色譜法[6-7]、衍生化-氣相色譜法[8-10]等。唐坤甜等[11]使用離子色譜法在白酒中檢測到16種有機酸，包括6種不揮發(fā)有機酸即乳酸、山梨酸、檸檬酸、庚二酸、辛二酸和壬二酸。胡國棟等[12]將酒樣旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后直接用于氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)分析，共檢測到23種游離有機酸，但只有十二、十三酸、十四酸、十五酸、十六酸、十八酸、油酸、亞油酸、棕櫚油酸、苯甲酸、2-苯乙酸和3-苯丙酸12種不揮發(fā)性有機酸；而使用N,O-雙(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺(N,O-bis(trimethylsilyl)trifluoroacetamide(BSTFA))衍生化結(jié)合GC-MS能檢測到白酒中23種有機酸[13]。但遺憾的是該研究只定性定量了乳酸、琥珀酸、酒石酸、十二酸、十四酸、十八酸和油酸7種有機酸。石亞林等[14]使用衍生化結(jié)合GC-MS研究了白酒大曲及其原料中的游離有機酸，共檢測到21種氨基酸和9種不揮發(fā)有機酸。衍生化方法可以提高有機酸的揮發(fā)特性，使其具有更好的色譜特性[8]，利于檢測到更多微量的有機酸。

目前國內(nèi)對白酒味覺與口感物質(zhì)包括有機酸的研究較少，已經(jīng)鑒定出的有機酸并不能重組出白酒的酸味與酸感。鑒于此，本研究使用BSTFA作為衍生化試劑衍生化白酒中的有機酸，結(jié)合GC-MS檢測分析7種香型白酒中的不揮發(fā)有機酸，更全面地了解白酒中的有機酸構(gòu)成與量比，為進一步改善和提高白酒的味覺與口感奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

樣品：所有試驗的樣品皆為原酒，四川某著名濃香型原酒(70%vol)，北京某著名清香型原酒(63.6%vol)，貴州某著名醬香型原酒(54%vol)，江西某企業(yè)特香型原酒(59%vol)，陜西某著名風香型原酒(66%vol)，山東某著名芝麻香型原酒(62%vol)，河北某著名老白干香型原酒(66%vol)。

標準品與試劑：乳酸(lactic acid)、羥基乙酸(glycolic acid)、2-糠酸(2-furoic acid)、3-羥基丙酸(3-hydroxypropinic acid)、3-羥基丁酸(3-hydroxybutyric acid)、2-羥基-3-甲基丁酸(2-hydroxy-3-methylbutyric acid)、2-羥基-4-甲基戊酸(2-hydroxy-4-methylpentanoic acid)、2-羥基丁酸(2-hydroxybutyricacid)、苯甲酸(benzoic acid)、馬來酸(maleic acid)、丁二酸(succinic acid)、2,3-二羥基丙酸(2,3-dihydroxypropanoic acid)、富馬酸(fumaric acid)、3-苯丙酸(3-phenylpropionic acid)、蘋果酸(malic acid)、DL-3-苯基乳酸(DL-3-phenyllactic acid)、十二酸(dodecanoic acid)、L-(+)-酒石酸(L-(+)-tartaric acid)、壬二酸(azelaic acid)、檸檬酸(citric acid)、十四酸(myristic acid)、棕櫚油酸(palmitoleic acid)、棕櫚酸(palmitic acid)、亞油酸(linoleic acid)、油酸(oleic acid)、吡啶(pyridine)、水楊苷(D-(-)-salicin)、磷酸二氫鈉均為色譜級，購自Sigma公司；BSTFA(含0.1%TMCS)，購自Sigma公司；2-苯乙酸(2-phenylacetic acid)、磷酸為分析純，購自國藥集團化學試劑有限公司；無水乙醇、甲醇，色譜級，購自北京百靈威科技有限公司；超純水(Milli-Q，實驗用水均為煮沸并冷卻至室溫的超純水)。

1.2 儀器與設(shè)備

儀器：GC Trace1310-MS TSQ8000三重四級桿氣質(zhì)聯(lián)用儀(Thermo Scientific)；氮吹儀(Organomation公司)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(Buchi公司)；超高效液相色譜儀(Waters UPLC H-Class)。

1.3 方法

1.3.1 樣品預(yù)處理

按照文獻[9]改進后預(yù)處理方法，取20 mL酒樣，40 ℃真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至1 mL，取濃縮20倍的樣品100 μL于2 mL小瓶中，加入100 μL內(nèi)標水楊苷(10 mg/L，溶于甲醇中)，室溫下溫和氮氣吹干，待衍生化。

2-羥基-4-甲基戊酸、羥基乙酸、苯甲酸因其濃度較高，不需要真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，直接取100 μL酒樣于2 mL小瓶中，加100 μL內(nèi)標水楊苷(5 mg/L，溶于甲醇中)，室溫下溫和的氮氣吹干，待衍生化。

1.3.2 BSTFA衍生化

參照文獻[9]改進后方法，氮氣吹干后的樣品，依次加入50 μL吡啶和100 μL BSTFA(含0.1% TMCS)，搖勻，70 ℃反應(yīng)3 h，24 h之內(nèi)完成檢測。

1.3.3 GC-MS色譜條件

TG-5(30 m×0.25 mm×0.25 μm)色譜柱(Thermo Scientific)；電子電離源；離子源溫度：300 ℃；傳輸線溫度280 ℃；電子能量：70 eV；發(fā)射電流：25 μA；掃描范圍：50～750 amu；進樣口溫度280 ℃；載氣：氦氣(1 mL/min)；進樣量：1 μL；升溫程序：65 ℃維持2 min，6 ℃/min上升至280 ℃，維持5 min；分流比5∶1。

未知化合物的質(zhì)譜與NIST08.L進行比對，已有標準品的成分通過與標準品的質(zhì)譜和保留指數(shù)比對來定性。無標準品的物質(zhì)，通過質(zhì)譜進行臨時性鑒定。

1.3.4 GC-MS定量方法

用46%vol酒精水溶液配制成初始濃度200 mg/L的各種有機酸標準儲備液，并根據(jù)白酒中各物質(zhì)濃度配制成合適濃度的有機酸標準品混合溶液，梯度稀釋，各梯度標準液前處理方法和衍生化方法與樣品一致。以有機酸與內(nèi)標物的峰面積比為橫坐標，質(zhì)量濃度為縱坐標，建立標準曲線。檢測限(LOD)為3倍信噪比時物質(zhì)的質(zhì)量濃度；定量限(LOQ)為10倍信噪比時物質(zhì)的質(zhì)量濃度。

1.3.5 UPLC定量乳酸方法

使用超純水將樣品酒精度稀釋至15%vol左右，取1 mL過0.22 μm濾膜，備用。

用15%vol酒精水溶液配制成初始濃度10 g/L乳酸標準儲備液，并進行梯度稀釋(5 000，2 500，1 250，625.0，312.5，156.3，78.12，36.06 mg/L)，各梯度標準溶液前處理方法與樣品一致。以乳酸峰面積為橫坐標，質(zhì)量濃度為縱坐標建立標準曲線。

UPLC色譜條件：T3色譜柱(100 mm×2.1 mm，1.8 μm，Waters)；流動相：NaH2PO4水溶液(用磷酸調(diào)節(jié)pH至2.7)；流速：0.25 mL/min；波長：210 nm；進樣量1 μL；柱溫：40 ℃。

2 結(jié)果與討論

本研究共檢測到27種有機酸，其中2-羥基-4-甲基戊酸、苯甲酸和羥基乙酸由于色譜峰過載或相鄰高濃度物質(zhì)峰的影響，采用樣品直接衍生化定量；乳酸因濃度過高使用UPLC直接定量；4-羥基丁酸為臨時性鑒定和半定量。

2.1 標準曲線與回收率

有機酸的標準曲線相關(guān)參數(shù)如表1所示。所有物質(zhì)的線性相關(guān)系數(shù)在0.981 8～0.999 9之間，檢測限在5.038～1 904 ng/L，相對標準偏差在1.3%～12%，回收率在80%～112%，線性關(guān)系良好，具有良好的準確度和精密度。

2.2 白酒中不揮發(fā)有機酸

乳酸在檢測到的7種香型原酒中含量均是最高的(366～1 581 mg/L)，遠遠高于其他有機酸。從含量上講，它是白酒中最重要的有機酸。從香型區(qū)分上講，醬香型、芝麻香型、老白干香型和特香型原酒含有最高的乳酸，其含量均超過1 000 mg/L(見表2)，而含量最低的是清香型和鳳香型原酒。

表1 不揮發(fā)有機酸的標準曲線、定量離子、回收率、檢測限和精密度

注：a：非衍生化測定，UPLC直接測定，單位mg/L。

含量在1～30 mg/L之間(沒有檢測到30～366 mg/L之間的有機酸)的不揮發(fā)性有機酸主要有2-糠酸、2-羥基-4-甲基戊酸、2-苯乙酸、3-苯丙酸、十二酸、十四酸、十六酸、亞油酸和油酸。這些酸中，含量最高的是十六酸(29.4 mg/L)，其次是2-羥基-4-甲基戊酸(9.16 mg/L)和亞油酸(8.53 mg/L)。十六酸主要存在于醬香型、老白干香型和濃香型白酒中，與以前檢測結(jié)果3.10～23.5 mg/L類似[12]。2-羥基-4-甲基戊酸是早先關(guān)注較少的一個酸，呈酸味，在芝麻香型原酒中含量最高，達10 mg/L左右，在其他香型白酒中含量1.28～2.82 mg/L。該化合物已經(jīng)在葡萄酒中檢測到(約幾百個μg/L級)，但在白蘭地和威士忌酒中未檢測到[17]。亞油酸主要存在于芝麻香型白酒中，再次是老白干香型、濃香型和醬香型白酒中，而在特香型、清香型和鳳香型原酒中含量較低，僅幾十個μg/L。2-糠酸也是早先關(guān)注較少的一種酸，沒有香氣，但呈皺褶澀味[15-16]，水溶液中的澀味閾值是160 μmol/L[15]。2-糠酸主要存在于濃香型和芝麻香型原酒中，其含量大于1 mg/L(表2)，而在清香型、鳳香型原酒中未檢測到(小于檢測限)，在醬香型、老白干香型和特香型原酒中含量為μg/L級。芳香族的2-苯乙酸和3-苯丙酸曾經(jīng)在香氣研究[18]中檢測到。2-苯乙酸在濃香型和醬香型原酒中含量最高(超過1 mg/L)，3-苯丙酸在特香型原酒中含量最高，在清香型、老白干香型白酒中未檢測到。直鏈脂肪酸十二酸、十四酸和十六酸是常見的可檢測的不揮發(fā)有機酸[12, 19]，油酸和亞油酸則是引起白酒降度混濁的重要化合物[20]。

除以上的有機酸以及含量最低的檸檬酸(羥基三羧酸，僅特香型原酒中含有2.66 μg/L)外，其余有機酸的含量均在0.1～1 mg/L(表2)，這些酸主要是羥基羧酸和二羧酸。羥基單羧酸主要包括羥基乙酸、3-羥基丙酸、2-羥基丁酸、3-羥基丁酸、4-羥基丁酸(臨時鑒定的)、2-羥基-3-甲基丁酸、2,3-二羥基丙酸、DL-3-苯基乳酸；羥基二羧酸有蘋果酸和酒石酸。與威士忌和白蘭地等蒸餾酒相比，白酒中含有更多種類的羥基酸[17]。二羧酸包括馬來酸、富馬酸、琥珀酸和壬二酸。這些化合物中除了琥珀酸、壬二酸之外，其余的化合物均是首次確認其存在。

表2 不同白酒樣品中不揮發(fā)有機酸的含量a

注：a：單位：μg/L，3次測定平均值；b：單位：mg/L，乳酸用UPLC定量，其余有機酸用GC-MS定量；c：低于檢測限；d：半定量。

在檢測到的羥基酸中，蘋果酸(1.05 mg/L)和3-苯基乳酸(1.03 mg/L)含量最高(4-羥基丁酸是半定量的)。2,3-二羥基丙酸、2-羥基丁酸和酒石酸在白酒中的含量較低，均低于150 μg/L。研究發(fā)現(xiàn)某些細菌可將亮氨酸轉(zhuǎn)化為2-羥基-4-甲基戊酸，將纈氨酸轉(zhuǎn)化為2-羥基-3-甲基丁酸[17]。

二羧酸中馬來酸在原酒中含量最高(1.37 mg/L)，其次是琥珀酸(659 μg/L)，再次是富馬酸(302 μg/L)。馬來酸又稱順-丁烯二酸，而富馬酸是反-丁烯二酸，在原酒中順式含量是反式含量的2.31～21.7倍。琥珀酸呈酸味，在水中的酸味閾值900 μmol/L[15]，該化合物在芝麻香原酒中的含量最高。原先認為只有豉香型白酒中才含有庚二酸、辛二酸和壬二酸[11]，但本研究在濃香型、老白干香型、醬香型和芝麻香型原酒中均檢測到壬二酸，未檢測到庚二酸和辛二酸。

從不揮發(fā)有機酸總量看，如果不考慮乳酸的含量，則芝麻香型原酒含量最高，高達61.7 mg/L，其次依次為老白干香型、濃香型和醬香型；特香型、鳳香型和清香型原酒不揮發(fā)有機酸總量低于10 mg/L。如果將乳酸含量計算在內(nèi)，則芝麻香型原酒含量最高，其次是老白干香型原酒，再次是醬香型和特香型原酒。

3 結(jié)論

采用BSTFA衍生化技術(shù)能夠一次性地檢測白酒中27種不揮發(fā)有機酸。在這些有機酸中羥基酸的種類最多，濃度最高。乳酸是所有不揮發(fā)性有機酸中含量最高的(幾百到近千mg/L)，濃度遠遠高于其他酸；居第二位的是十六酸(幾十mg/L級)，其次是2-羥基-4-甲基戊酸(僅十幾個mg/L級)，其他的酸濃度均在μg/L至幾個mg/L級。大多有機酸在醬香型、芝麻香型原酒中的含量相對較高，在清香型和鳳香型原酒中含量較低。

[1] 范文來,徐巖.中國白酒風味物質(zhì)研究的現(xiàn)狀與展望[J].釀酒,2007(4):31-37.

[2] 楊會,范文來,徐巖.白酒中不揮發(fā)物質(zhì)的研究進展[C].2015國際酒文化學術(shù)研討會.北京:中國輕工業(yè)出版社,2015:54-66.

[3] 王勇,徐巖,范文來,等.應(yīng)用GC-O技術(shù)分析牛欄山二鍋頭白酒中的香氣化合物[J].釀酒科技,2011(2): 74-79.

[4] MONGAY C,PASTOR A,OLMOS C.Determination of carboxylic acids and inorganic anions in wines by ion-exchange chromatography[J].Journal of Chromatography A,1996,736(1-2):351-357.

[5] PAPADAKIS E N,POLYCHRONIADOU A.Application of a microwave-assisted extraction method for the extraction of organic acids from Greek cheeses and sheep milk yoghurt and subsequent analysis by ion-exclusion liquid chromatography[J].International Dairy Journal,2005,15(2):165-172.

[6] ROMERO E G,MUNOZ G S,ALVAREZ P J M,et al.Determination of organic acids in grape musts, wines and vinegars by high-performance liquid chromatography[J].Journal of Chromatography A,1993,655(1):111-117.

[7] KORDIS-KRAPEZ M,ABRAM V,KAC M,et al.Determination of organic acids in white wines by RP-HPLC[J].Food Technology and Biotechnology, 2001,39(2): 93-99.

[8] SCHUMMER C,DELHOMME O,APPENZELLER B M R,et al.Comparison of MTBSTFA and BSTFA in derivatization reactions of polar compounds prior to GC/MS analysis[J].Talanta, 2009,77(4):1 473-1 482.

[9] MEDEIROS P M,SIMONEIT B R T.Analysis of sugars in environmental samples by gas chromatography-mass spectrometry[J].Journal of Chromatography A,2007,1 141(2):271-278.

[10] HIJAZ F,KILLINY N.Collection and Chemical Composition of Phloem Sap from Citrus sinensis L.Osbeck (Sweet Orange)[J].Plos One,2014,9(7) : 1-11.

[11] 唐坤甜,趙彩云,韓興林,等.白酒味覺成分有機酸含量分析及其對釀造工藝的影響[J].食品與發(fā)酵工業(yè),2016,42(7):202-208.

[12] 胡國棟,程勁松,朱葉.白酒中游離有機酸的定量測定[J].色譜,1994(4):265-267.

[13] 鄭偉.白酒非揮發(fā)性組分研究[D]. 南京:南京理工大學, 2007.

[14] 石亞林.白酒大曲及其原料中氨基酸、有機酸、游離態(tài)糖對大曲風味影響研究[D].無錫:江南大學, 2016.

[15] HUFNAGEL J C,HOFMANN T.Quantitative reconstruction of the nonvolatile sensometabolome of a red wine[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry,2008,56(19):9 190-9 199.

[16] FRANK S,WOLLMANN N,SCHIEBERLE P,et al.Reconstitution of the flavor signature of Dornfelder red wine on the basis of the natural concentrations of its key aroma and taste compounds[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry,2011,59(16):8 866-8 874.

[17] GRACIA-MORENO E,LOPEZ R,FERREIRAV.Quantitative determination of five hydroxy acids, precursors of relevant wine aroma compounds in wine and other alcoholic beverages[J]. Analytical and Bioanalytical Chemistry,2015,407(26):7 925-7 934.

[18] FAN W, QIAN M C. Characterization of Aroma Compounds of Chinese “Wuliangye”and “Jiannanchun” Liquors by Aroma Extract Dilution Analysis[J]. Agriculture and Food Chemistry, 2006, 54:2 695-2 704.

[19] 胡國棟,程勁松,朱葉.氣相色譜法直接測定白酒中的游離有機酸[J]. 釀酒科技, 1994 (2): 11-15.

[20] 周恒剛.低度白酒除濁[J].釀酒,1993(3):1-8.

Characterization of non-volatile organic acids in Baijius (Chinese liquors) based on BSTFA derivatization coupled with GC-MS

YANG Hui，F(xiàn)AN Wen-lai*，XU Yan

(Lab of Brewing Microbiology and Applied Enzymology, Key Lab of Industrial Biotechnology, Ministry of Education,School of Biotechnology, Jiangnan University, Wuxi 214122, China)

Non-volatile organic acids were important sour-tasting compounds in baijius (Chinese liquors). To get a better understanding for these compounds in raw liquors, an analytical method usingN,O-bis(trimethylsilyl)trifluoroacetamide (BSTFA) as derivatization regent coupled with gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS) was applied. A total of 27 non-volatile organic acids were identified and quantitated in 7 different aroma types of Baijiu. The results showed that much more hydroxy acids were detected, and their total concentration was the highest among 27 non-volatile organic acids in all samples. The concentration of lactic acid was up to several hundreds even thousands of mg/L, which was much higher than those of other non-volatileorganic acids in all liquors. Overall, the contents of most of the non-volatile organic acids in Jiang-flavour (soy sauce aroma type) and Zhima-flavour (roasted-sesame-like aroma type) Chinese spirits were relatively high, while those in mild flavor (light aroma-type) and Feng-flavour (feng aroma-type) Chinese spirits were low.

Baijiu(Chinese liquor)；non-volatile organic acids, derivatization；N,O-bis (trimethylsilyl) trifluoroacetamide(BSTFA)；gas chromatography-mass spectrometer(GC-MS)

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201705031

碩士研究生(范文來研究員為通訊作者,E-mail: Wenlai.Fan@163.com)。

十三五國家重大專項(2016YFD0400500)

2016-10-29，改回日期：2016-12-22