一例遺傳性凝血因子Ⅺ缺陷癥患者表型診斷及基因分析

葉佳佳，楊麗紅，郝秀萍，陳必成

（溫州醫科大學附屬第一醫院，浙江 溫州 325015，1.檢驗科；2.外科實驗室）

一例遺傳性凝血因子Ⅺ缺陷癥患者表型診斷及基因分析

葉佳佳1，楊麗紅1，郝秀萍1，陳必成2

（溫州醫科大學附屬第一醫院，浙江 溫州 325015，1.檢驗科；2.外科實驗室）

目的：對1例遺傳性凝血因子XI（FXI）缺陷癥患者及其家系成員進行表型診斷和基因分析，探討其發病的分子機制。方法：檢測先證者及其家系成員（共3代8人）的血漿凝血酶原時間（PT）、活化部分凝血活酶時間（APTT）、纖維蛋白原含量（FIB）、凝血因子Ⅺ促凝活性（FXI∶C）及凝血因子Ⅺ抗原含量（FXI∶Ag）等指標以明確診斷；聚合酶鏈式反應（PCR）擴增FXI基因的所有外顯子和側翼序列，擴增產物純化后直接測序，發現突變位點則反向測序予以證實；用PyMOL Viewer1.5.x軟件構建野生型和突變型FXI蛋白模型，比對分析尋找突變前后空間構象及分子間作用力的變化。結果：先證者和其弟弟APTT、FXI∶C、FXI∶Ag均明顯異常，分別為78.4 s、2.0%、6.8%和62.1 s、4.5%、10.0%；其家系成員的FXI∶C和FXI∶Ag均發現有不同程度下降?；蚍治霭l現先證者和其弟弟FXI基因第6號外顯子的g.15410G＞A雜合無義突變導致Trp228stop及第12號外顯子的g.25471C＞G雜合錯義突變導致Cys482Trp；其父親、姐姐、女兒、外甥女均為Trp228stop的雜合子，而母親、侄子則為Cys482Trp的雜合子。模型分析顯示Cys482Trp突變并未破壞氨基酸間的天然氫鍵聯系，但使該位點氨基酸與267位氨基酸的空間位阻變大，從而使蛋白的結構發生變化。結論：該遺傳性FXI缺陷癥患者FXI基因的Trp228stop無義突變和Cys482Trp錯義突變與血漿FXI∶C及抗原水平降低有關。

遺傳性凝血因子XI缺陷癥；聚合酶鏈式反應；基因突變；模型分析

凝血因子XI（FXI），又稱為血漿凝血活酶前質，主要由肝臟和巨核細胞產生。在傳統凝血機制中，FXI在凝血因子X II與高分子量激肽原的作用下轉變為活化的FXI（FXIa），它激活凝血因子IX，從而活化凝血級聯反應。研究發現，FXI的主要作用是在血凝塊形成后促進凝血酶的持續生成[1]，而且FXIa還有間接抑制纖溶的作用，從而可以穩定已經形成的凝血塊。遺傳性FXI缺陷癥是一種由于基因突變導致的遺傳性疾病，呈常染色體隱性遺傳，男女均可患病，在人群中的發病率為1/1 000 000到1/100 000，但在猶太人和法國巴斯克地區發病率較高[2]。患者出血表現輕微，甚至無出血癥狀，多數在纖溶活躍部位（口腔或泌尿生殖系）手術時因出現明顯的凝血障礙而被診斷[3]。本研究通過對1例遺傳性FXI缺陷癥家系成員的表型檢測及基因分析，初步探討其分子致病機制，報告如下。

1 對象和方法

1.1 對象 先證者，女，32歲，因妊娠G2P1孕11周+3 d，陰道出血，臨床診斷“先兆流產”，住院保守治療。妊娠監督檢查凝血常規發現活化部分凝血活酶時間（activated partial thromboplastin time，APTT）輕度延長（78.4 s），進一步檢查發現凝血因子XI促凝活性（FXI∶C）和凝血因子XI抗原含量（FXI∶Ag）明顯降低，分別為2.0%和6.8%，其他凝血指標均無明顯異常，肝、腎功能正常。先證者自訴平時無自發出血或血栓等癥狀，但分娩時出血量較多，輸入血漿后可糾正。征得先證者及其家系成員知情同意后進行后續實驗，該家系遺傳圖譜見圖1。150例正常健康體檢者作為凝血指標對照，其中男78例，女72例，平均年齡35歲（17～56歲）。均無肝、腎功能疾病，無血栓或出血史。本研究經本院倫理委員會批準，所有受檢者經知情同意后，抽取血樣。

1.2 方法

圖1 遺傳性FXI缺陷癥先證者家系圖

1.2.1 儀器和試劑：基因組DNA提取試劑盒及PCR擴增試劑盒，購自北京天根生化科技有限公司。凝血指標檢測試劑盒由法國Stago公司提供配套試劑。純化的sheep anti-human FXI IgG由加拿大Cedarlane Laboratories Ltd.公司提供。STA-R全自動血凝儀（法國Stago公司）、PCR擴增儀（ABI Thermalcycler2720）、凝膠電泳儀（美國BIO-rad公司）、凝膠成像系統（上海天能公司）、核酸蛋白分析儀DU800（美國Beckman-Coulter公司）。

1.2.2 引物：根據FXI基因序列（Genbank Number∶NG_008051.1）用Primer Premier 5.0軟件設計13對引物（交由上海桑尼生物科技有限公司合成），以覆蓋FXI基因所有外顯子及其側翼序列和啟動子序列。

1.2.3 樣本采集及處理：采集該家系3代8名成員的外周靜脈血，以0.109 mol/L枸櫞酸鈉1∶9抗凝，3 000 r/min離心10 min，上層乏血小板血漿用于檢測凝血指標，并于2 h內完成；下層血細胞用于提取基因組DNA。

1.2.4 血漿凝血指標檢測：血漿凝血酶原時間（theprothrombin time，PT）、APTT、纖維蛋白原（fibrinogen，FIB）、FXI∶C、凝血因子V III促凝活性（FV III∶C）、凝血因子IX促凝活性（FIX∶C）、凝血因子X II促凝活性（FX II∶C）等凝血指標用一期凝固法在Stago STA-R全自動血凝儀上測定；FXI∶Ag采用酶聯免疫吸附測定法檢測，所有操作步驟均嚴格按照試劑說明書進行。

1.2.5 外周血基因組DNA提?。簯梅?氯仿法抽提先證者及家系成員外周血基因組DNA，應用核酸蛋白分析儀DU800檢測所提取基因組DNA的濃度和純度。

1.2.6 PCR擴增及電泳：PCR擴增FXI基因所有外顯子及側翼序列和啟動子序列。PCR體系如下：10× PCR buffer 5.0 μL，模板3.0 μL，dNTPs 2.0 μL，引物2.0 μL，Taq DNA聚合酶0.5 μL，ddH2O補足至50 μL。反應條件如下：95 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共30個循環；72 ℃再延伸10 min。

1.2.7 DNA測序分析：PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳進行鑒定，并經純化后，送上海桑尼生物科技有限公司測序（所用測序儀為ABI PRISM 3730）。通過Chromas軟件將測序結果與Genbank數據庫中FXI基因序列（NG_008051.1）比對，發現突變位點后，反向測序予以證實。其他家系成員在明確先證者基因突變位點后，PCR擴增相應區域并測序分析。

1.2.8 建立模型分析：基于已知的FXI結構模型，運用Swiss軟件對所發現的突變進行分析。

2 結果

2.1 表型檢測結果 先證者和其弟弟APTT、FXI∶C、FXI∶Ag均明顯異常，分別為78.4 s、2.0%、6.8%和62.1 s、4.5%、10.0%；其家系成員的FXI∶C和 FXI∶Ag均發現有不同程度下降；先證者及家系成員FV III∶C、FIX∶C、FX II∶C等其他凝血指標均無明顯異常，見表1。

2.2 FXI基因突變分析 先證者和其弟弟FXI基因第6號外顯子的g.15410G＞A雜合無義突變導致Trp228stop及第12號外顯子的g.25471C＞G雜合錯義突變導致Cys482Trp；其父親、姐姐、女兒、外甥女均為Trp228stop的雜合子，而母親、侄子則為Cys482Trp的雜合子。見表1和圖2。

表1 先證者及家系成員實驗室檢測及基因型結果

2.3 模型建立分析 在野生型蛋白中，Cys482的主干只與Leu571的主干形成一個氫鍵（如圖3綠色虛線所示）；當Cys482突變為非極性的Trp時，其主干依然和Leu571的主干形成氫鍵，但其與His267之間的空間位阻變大（如圖3粉色虛線所示）。

3 討論

遺傳性FXI缺陷癥是由合成FXI蛋白的基因發生突變引起。該基因位于人類4號染色體上，基因全長23 kb，共含有15個外顯子和14個內含子。其中，l號外顯子編碼5’端非翻譯區，2號外顯子編碼由18個氨基酸組成的信號肽，其余外顯子編碼成熟肽[4]。合成的FXI蛋白分別由一條輕鏈和一條重鏈構成，其中輕鏈含有238個氨基酸，具有酶催化活性；重鏈則由4個具有顯著特征的蘋果狀結構域（apple domain，AP）組成。自1989年ASAKAI等[5]首次在猶太人中報道了3種導致遺傳性FXI缺陷的基因突變開始，截至2015年，人類基因組數據庫（HGMD，http∶//www. hgmd.cf.ac.uk/ac/all.php）共收錄了約236種FXI基因突變類型，其中大多數為錯義突變或無義突變，而且突變位點覆蓋FXI基因所有編碼區和調控區。

本研究中，先證者因正常妊娠入住我院，生產過程中出血量較多，并通過輸注血漿止血。凝血常規檢查顯示先證者APTT明顯延長，進一步的凝血因子檢測發現先證者FXI∶C及FXI∶Ag同步降低，從而診斷為FXI缺陷癥?；蚍治鎏崾鞠茸C者FXI基因6號外顯子和12號外顯子分別存在無義突變Trp228stop及錯義突變Cys482Trp，前者遺傳自父親，后者遺傳自母親。武文漫等[6]首次對無義突變Trp228stop進行了報道，患者也在術前檢測時發現FXI缺陷。FXI空間結構顯示Trp228殘基位于AP3結構域，無義突變產生的截斷蛋白缺失AP4及催化活性區，從而蛋白結構完整性受到影響。雖然她的父親、姐姐、侄女及女兒均攜帶該無義突變位點，但女兒的FXI∶C及FXI∶Ag相對于其他三者要低更多，考慮到先證者的女兒為新生兒，一般健康新生兒在早期肝功能并不完善，其FXI∶Ag可在6個月后達到正常人水平，因此其抗原及活性水平的降低可能與肝臟合成減少有關[7]。殘基Cys482位于蛋白羧基端的絲氨酸蛋白酶區域，其可與殘基Cys362形成二硫鍵連接蛋白的輕鏈與重鏈。進一步的模型分析提示，雖然該突變不會影響原本存在的氫鍵連接，但是當Trp取代Cys后，其會與His267殘基之間形成空間位阻。除此之外，錯義突變還會影響Cys482殘基與Cys362之間二硫鍵的連接。這些重要結構域的缺失及作用力的改變導致蛋白結構改變，從而形成不穩定蛋白，這可能是導致FXI∶C及FXI∶Ag下降的致病機制，但是具體原因還有待進一步分析。

圖2 FXI基因測序結果

圖3 Cys482Trp突變模型

遺傳性FXI缺陷癥一般無自發性出血表現，多數患者只在嚴重創傷及術后檢查時因明顯延長的APTT而被發現。而且患者出血嚴重程度與APTT延長及FXI缺少程度之間無明顯相關性[8]，這可能與血小板表面存在的FXI樣活性物質，部分代償了血漿中缺乏的FXI功能有關。目前該病臨床治療上主要以輸注血漿糾正凝血功能為主，尚無根治方法。近來研究還提示，FXI是抗血栓治療的新靶標[9]，因此對于遺傳性FXI缺陷癥的檢測、治療、利用還有待于我們進一步的研究。

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（本文編輯：趙翠翠）

Phenotypic diagnosis and genetic analysis in a proband with hereditary coagulation factor XI de fi ciency

YE Jiajia1, YANG Lihong1, HAOXiuping1, CHEN Bicheng2.
1.Department of Laboratory, the First Af fi liated Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325015; 2.Surgical Laboratory, the First Af fi liated Hospital of Wenzhou Medicatl University, Wenzhou, 325015

Objective: To identify potential mutations and explore the molecular mechanism of a proband underlying hereditary coagulation factor XI (FXI) de fi ciency. Methods: Clinical diagnosis was validated by measuring the prothrombin time (PT), activated partial thromboplastin time (APTT), fi brinogen, FXI activity (FXI:C) and FXI antigen (FXI:Ag). Potential mutations of FXI gene were analyzed by PCR and direct DNA sequencing. Suspected mutations were con fi rmed by sequencing the opposite strand. With the aid of bioinformatics software PyMOL Viewer1.5.x, the wild-type and mutant FXI protein model was also comparatively analyzed. Results: The results of APTT, FXI:C, FXI:Ag in the proband and her brother were obviously abnormal, 78.4 s, 2.0%, 6.8% and 62.1 s, 4.5%, 10.0% respectively. The FXI:C and FXI:Ag of her other family member also presented with different degrees of reduction. A heterozygous g.15410G＞A in exon 6 and g.25471C＞G in exon 12 were identi fi ed, resulting in the nonsense mutation Trp228stop and missense mutation Cys482Trp. Her father, sister, niece were heterozygous for Trp228stop, while her mother and nephew were for the Cys482Trp mutation. Modeling showed that the missense mutation did not destroy the natural hydrogen bonds, however, it lead to the formation of the space steric hindrance with amino acids 267 which will change the protein structure. Conclusion: A heterozygous Trp228stop mutation and a heterozygous Cys482Trp mutation have been identi fi ed in the FXI gene, which can explain the low levels of the FXI:C and FXI:Ag in the proband.

hereditary coagulation factor XI deficiency; polymerase chain reaction; gene mutation; model analysis

R3554.9

A

10.3969/j.issn.2095-9400.2017.05.009

2016-06-14

溫州市科技計劃項目（Y20150098）。

葉佳佳（1985-），女，浙江臺州人，主管技師，在職碩士生。

陳必成，主任技師，博士生導師，Email：chenbicheng@hotmail.com。