犬鏈球菌和犬源巴氏鏈球菌的分離鑒定

楊宗統(tǒng)， 李 超， 姜世浩， 于 鵬， 孫 強(qiáng)， 孫軍昌，王冬冬， 羅 寧， 王 森， 黃 凱， 王守春， 尹燕博，

(1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院 ， 山東青島266109 ； 2.青島博隆實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司 ， 山東青島266225 ；3.青島海華生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司 ， 山東青島266555 ； 4.青島畜牧科技示范園管委會(huì) ， 山東青島266200 ； 5.青島即墨市畜牧獸醫(yī)局 ， 山東青島266200 ； 6.青島澳蘭百特生物工程有限公司 ， 山東青島266101)

犬鏈球菌和犬源巴氏鏈球菌的分離鑒定

楊宗統(tǒng)1， 李 超2,3， 姜世浩1， 于 鵬4， 孫 強(qiáng)5， 孫軍昌5，王冬冬1， 羅 寧1， 王 森2， 黃 凱2， 王守春6， 尹燕博1，2

(1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院 ， 山東青島266109 ； 2.青島博隆實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司 ， 山東青島266225 ；3.青島海華生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司 ， 山東青島266555 ； 4.青島畜牧科技示范園管委會(huì) ， 山東青島266200 ； 5.青島即墨市畜牧獸醫(yī)局 ， 山東青島266200 ； 6.青島澳蘭百特生物工程有限公司 ， 山東青島266101)

為確診4例送檢的表現(xiàn)為咳嗽吐血、猝死犬的病因，采集嚴(yán)重病變的肺臟通過(guò)PCR檢測(cè)犬細(xì)小病毒、犬瘟熱、犬副流感病毒以及犬腺病毒4種常見(jiàn)病毒；并進(jìn)行細(xì)菌分離，對(duì)分離菌進(jìn)行形態(tài)特征觀察、染色鏡檢、生化試驗(yàn)、藥敏試驗(yàn)以及16S rRNA基因序列分析。結(jié)果顯示：病毒檢測(cè)結(jié)果均為陰性，分離到2株犬鏈球菌及2株巴氏鏈球菌，2種細(xì)菌通過(guò)小鼠分別進(jìn)行人工發(fā)病試驗(yàn)，復(fù)制出與病死犬相似的病理變化，且從小鼠體內(nèi)再次分離到這2種細(xì)菌，由此確定犬鏈球菌和巴氏鏈球菌分離物均為致病菌。養(yǎng)殖場(chǎng)結(jié)合藥敏試驗(yàn)成功對(duì)該病進(jìn)行了控制。

比格犬 ； 犬鏈球菌 ； 巴氏鏈球菌 ； 分離 ； 鑒定

Correspondlng author:YIN Yan-bo

犬鏈球菌(Streptococcuscanis，S.canis)屬于LancefieldG群鏈球菌，可感染犬、貓、牛等多種動(dòng)物，偶爾見(jiàn)有感染人的報(bào)道[1-2]。1986年Devries等[3]在犬和奶牛乳房炎病料中分離到β溶血性鏈球菌，被命名為S.canis，并劃為β溶血G群鏈球菌1個(gè)新的菌屬，模式菌株為DSM20715。S.canis常引起犬呼吸道及泌尿生殖道感染，表現(xiàn)為流產(chǎn)、陰道炎、乳房炎、子宮炎甚至皮膚感染[4]。S.canis感染人可導(dǎo)致敗血癥、腦膜炎、肺炎、心內(nèi)膜炎、胸腹膜炎等[5]。Vieira等[6]從犬、貓、貉、狐、貂、小鼠等多種不同動(dòng)物體內(nèi)分離到S.canis，并被認(rèn)為是寄生于動(dòng)物體內(nèi)的條件致病菌。當(dāng)外界條件改變或者機(jī)體抵抗力下降，促使S.canis大量增殖并引起發(fā)病。

巴氏鏈球菌(Streptococcuspasteurianus)是腸道正常菌群的一部分，以前被稱為2型牛鏈球菌，屬于D群鏈球菌，已多次從人類感染的病例中分離到，且基因型不同于牛鏈球菌，故新命名為巴氏鏈球菌。有報(bào)道稱該菌可導(dǎo)致血友病、乙肝、丙肝和HIV陽(yáng)性患者出現(xiàn)敗血癥[7]。到目前為止，在國(guó)內(nèi)尚未見(jiàn)從犬中分離得到巴氏鏈球菌的報(bào)道。

犬科動(dòng)物是人畜鏈球菌病的病原攜帶者[8]，近年來(lái)人們對(duì)于伴侶動(dòng)物的情感與日俱增，對(duì)于犬細(xì)菌病的研究與防控越來(lái)越重要。

1 材料與方法

1.1 病料來(lái)源 2016年3-8月門診共收到4例送檢的臨床表現(xiàn)為咳嗽、吐血、猝死的病死犬，剖檢可見(jiàn)胸腔大量積液，肺臟出血、實(shí)變、壞死(見(jiàn)封三圖1)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 體重20 g左右健康BALB/c小鼠25只，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。

1.3 主要試劑 血瓊脂基礎(chǔ)培養(yǎng)基、胰蛋白胨大豆肉湯(TSB)、麥康凱瓊脂平板，購(gòu)自青島高科園海博生物技術(shù)有限公司；細(xì)菌藥敏試紙片、鏈球菌細(xì)菌生化編碼鑒定管，購(gòu)自杭州天和微生物試劑有限公司；T1克隆載體、Trans-T1感受態(tài)細(xì)胞，購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；膠回收純化試劑盒、TaqDNA聚合酶、DNA Marker 2 000，購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司；瓊脂糖，購(gòu)自美國(guó)Promega公司；BALB/c小鼠，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司；其他試劑材料均由青島澳蘭百特生物工程有限公司診斷中心提供。

1.4 病毒PCR檢測(cè) 犬細(xì)小病病毒、犬瘟熱病毒、犬副流感病毒以及犬傳染性肝炎病毒PCR診斷檢測(cè)方法為本實(shí)驗(yàn)室建立[9]，從病死犬病料分別提取并擴(kuò)增犬細(xì)小病病毒、犬瘟熱病毒、犬副流感病毒以及犬腺病病毒的核酸，電泳檢測(cè)有無(wú)目標(biāo)核酸片段。

1.5 細(xì)菌分離 取犬病變肺臟組織及胸腔積液，劃線接種于鮮血瓊脂培養(yǎng)基、胰蛋白胨大豆瓊脂(加血清)、麥康凱瓊脂平板培養(yǎng)基上分離細(xì)菌，于37 ℃恒溫培養(yǎng)12～24 h。

1.6 細(xì)菌形態(tài)特征與培養(yǎng)特性 無(wú)菌挑取上述培養(yǎng)基中單個(gè)優(yōu)勢(shì)菌落，在鮮血瓊脂培養(yǎng)基中37 ℃過(guò)夜純化培養(yǎng)，連續(xù)傳代3次，觀察其生長(zhǎng)情況并革蘭染色鏡檢，待生長(zhǎng)穩(wěn)定后移接于胰蛋白胨大豆肉湯(TSB)進(jìn)行純培養(yǎng)，供鑒定用。

1.7 16S rRNA基因測(cè)序分析 使用TRIZol-氯仿-異丙醇法提取分離純化病原菌的基因組DNA，參考細(xì)菌16S rRNA通用引物F27：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′,R1492：5′-TACGGTACCTTGTTACGACTT-3′[10]進(jìn)行16S rRNA PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物電泳回收后，與T1克隆載體連接，轉(zhuǎn)化到Trans-T1感受態(tài)細(xì)胞中，經(jīng)克隆鑒定后送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果參照盧受昇[11]序列比對(duì)的方式，從GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中選取不同種的鏈球菌參考株17株，大腸桿菌、銅綠假單胞菌、腸沙門菌、多殺性巴氏桿菌各1株，將其16S rRNA基因序列用DNAStar軟件進(jìn)行同源性比較并利用MEGA6軟件使用最大似然法(Maximum Likelihood)建立系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.8 細(xì)菌生化特性鑒定 按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，分別用鏈球菌細(xì)菌生化編碼鑒定管GYZ-12St對(duì)分離菌進(jìn)行PYR試劑、糖發(fā)酵以及生化試驗(yàn)。

1.9 藥敏試驗(yàn) 采用CLSI推薦的紙片擴(kuò)散法對(duì)4株分離菌株進(jìn)行藥物敏感性試驗(yàn)，根據(jù)CLSI動(dòng)物種特異的獸醫(yī)病原菌抑菌圈直徑解釋標(biāo)準(zhǔn)[12]進(jìn)行判定。

1.10 小鼠致病性試驗(yàn) 參照Willianms等[13]的方法，將4株分離物分四組分別腹腔注射5只小鼠，每只0.2 mL(菌液濃度約為109CFU/mL)，另取5只小鼠注射TSB作陰性對(duì)照。觀察每組發(fā)病及死亡情況，從發(fā)病死亡小鼠肺臟中重新分離、鑒定細(xì)菌。

2 結(jié)果

2.1 病毒的PCR檢測(cè) 犬細(xì)小病病毒、犬瘟熱病毒、犬副流感病毒以及犬腺病病毒4種常見(jiàn)傳染病病毒檢測(cè)結(jié)果均為陰性。

2.2 細(xì)菌分離結(jié)果 從4例送檢的犬病變肺臟中各分離到1株細(xì)菌，沒(méi)發(fā)現(xiàn)多株菌混感現(xiàn)象。

2.3 細(xì)菌培養(yǎng)及染色特性 在鮮血瓊脂培養(yǎng)基中生長(zhǎng)出淡灰色、透明、圓形、邊緣整齊、表面光滑、露珠樣小菌落，其中兩株呈β型溶血，兩株呈α型溶血；在胰蛋白胨培養(yǎng)基上生長(zhǎng)較貧瘠，麥康凱瓊脂上均不生長(zhǎng)。取單菌落分別進(jìn)行革蘭染色，涂片染色鏡檢可見(jiàn)4株菌形態(tài)基本一致，均呈紫紅色革蘭陽(yáng)性球菌，可見(jiàn)單個(gè)、成對(duì)排列，多為3個(gè)、4個(gè)在一起的短鏈狀或成堆排列。

2.4 PCR鑒定及序列比對(duì)結(jié)果 通過(guò)16S rRNA基因擴(kuò)增，擴(kuò)增出1500 bp左右的片段(見(jiàn)圖2)。將所測(cè)分離株16S rRNA基因序列與參考株基因序列比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)，其中2株分離菌與登錄號(hào)為KP851852的Streptococcuscanis16S rRNA序列同源性為99%，確認(rèn)這2株分離菌為犬鏈球菌，分別命名為S.canis-JM201604、S.canis-JM201608，另外2株分離菌與登錄號(hào)為KU353617的Streptococcuspasteurianus16S rRNA序列同源性為100%，確認(rèn)這2株分離菌為巴氏鏈球菌，分別命名為S.pasteurianus-JM201603、S.pasteurianus-JM201607；4株分離菌16S rRNA基因序列在進(jìn)化樹(shù)上與17株鏈球菌參考株同屬一支，但序列間存在一定差異；S.canis-JM201604、S.canis-JM201608和S.pasteurianus-JM201603、S.pasteurianus-JM201607之間同源性為94.5%，但S.canis-JM201604與S.canis-JM201608同源性為100%，S.pasteurianus-JM201603與S.pasteurianus-JM201607同源性為100%不存在差異；4株分離菌株與大腸桿菌、沙門菌、銅綠假單胞菌、巴氏桿菌的同源性差異則較大(見(jiàn)圖3)。

2.5 細(xì)菌生化特性鑒定 細(xì)菌生化鑒定結(jié)果：S.canis-JM201604和S.canis-JM201608分離株P(guān)YR、精氨酸、蔗糖、海藻糖試驗(yàn)陽(yáng)性，V-P、GPP、PMG、七葉苷、MAG、TMZ、蕈糖等試驗(yàn)陰性。S.pasteurianus-JM201603和S.pasteurianus-JM201607分離株P(guān)MG、七葉苷、MAG、TMZ、蕈糖、蔗糖、山梨醇、海藻糖試驗(yàn)陽(yáng)性，PYR、V-P、精氨酸、GPP、馬尿酸鈉、甘露醇等試驗(yàn)陰性。生化結(jié)果見(jiàn)表1。

圖2 分離菌16S rRNA PCR擴(kuò)增結(jié)果

M：DNA Marker DL-2 000； 1：分離菌株1擴(kuò)增產(chǎn)物； 2：分離菌株2擴(kuò)增產(chǎn)物； 3：分離菌株3擴(kuò)增產(chǎn)物； 4：分離菌株4擴(kuò)增產(chǎn)物； 5：陰性對(duì)照

圖3 16S rRNA序列的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

表1 分離株生化鑒定結(jié)果

2.6 藥敏試驗(yàn)結(jié)果 結(jié)果顯示，4株分離菌株均對(duì)青霉素，氨芐西林，頭孢拉定，氧氟沙星，萬(wàn)古霉素等13種藥物敏感；對(duì)新霉素、四環(huán)素、多西環(huán)素、多黏菌素B、呋喃唑酮、克林霉素6種藥敏耐藥；S.canis-JM201604、S.canis-JM201608對(duì)復(fù)方新諾明敏感；但S.pasteurianus-JM201603 及S.pasteurianus-JM201607對(duì)復(fù)方新諾明則耐藥。

2.7 動(dòng)物試驗(yàn)結(jié)果 結(jié)果顯示，4組試驗(yàn)組小鼠在攻毒6 h后開(kāi)始均出現(xiàn)發(fā)病癥狀，表現(xiàn)為精神不振，食欲減退，扎推并且全身哆嗦，呼吸急促；24 h內(nèi)S.canis-JM201604注射組死亡4只，S.canis-JM201608注射組死亡5只，S.pasteurianus-JM201603注射組死亡1只，S.pasteurianus-JM201607注射組死亡2只；對(duì)照組全部健活。剖檢死亡小鼠發(fā)現(xiàn)4組試驗(yàn)組病變相似，肺臟出血，脾臟腫大且出血，腸道臌氣，腸道壁變薄(見(jiàn)封三圖4)。從S.canis-JM201604和S.canis-JM201608攻毒組死亡小鼠肺臟中再次分離到了細(xì)菌，鑒定結(jié)果為犬鏈球菌，從S.pasteurianus-JM201603和S.pasteurianus-JM201607攻毒組死亡小鼠肺臟中再次分離到了細(xì)菌，鑒定結(jié)果為巴氏鏈球菌，與犬體內(nèi)分離到的細(xì)菌一致。

3 討論

鏈球菌是一種人獸共患的革蘭陽(yáng)性球菌，多數(shù)呈α溶血或β溶血，多糖抗原的不同可將鏈球菌分成20個(gè)群，引起人發(fā)病的鏈球菌以A群為主，C、D、F、L群可引起豬、牛、羊發(fā)病。S.canis屬于G群鏈球菌，呈β溶血，可引起犬、貓、貉、狐、貂、小鼠等多種不同動(dòng)物發(fā)病，此外還可以感染人引發(fā)疾病[4,14]。Hassan報(bào)道從許多不同動(dòng)物體內(nèi)分離到S.canis，常寄生于動(dòng)物體內(nèi)的消化道、生殖道等，是一種條件致病菌。S.canis可以通過(guò)不同的傳播途徑給動(dòng)物造成感染，引起動(dòng)物機(jī)體不同的病理變化[15]。S.pasteurianus屬于D群鏈球菌，呈α溶血，在免疫功能低下患者中可以導(dǎo)致出現(xiàn)敗血癥，通常情況下也與胃腸道疾病有關(guān)[7]。細(xì)菌在犬的肺炎、皮膚病、化膿創(chuàng)等病程中起著關(guān)鍵的作用[16]。

本試驗(yàn)從病原學(xué)角度對(duì)這4例肺炎患病比格犬的病因進(jìn)行了探究和分析，經(jīng)PCR檢測(cè)，排除了犬瘟熱病毒、犬細(xì)小病病毒、犬副流感病毒以及犬傳染性肝炎病病毒感染的可能。從患病犬病變肺臟中分別分離出2株犬鏈球菌和兩株巴氏鏈球菌，并進(jìn)行了相關(guān)鑒定。藥敏試驗(yàn)顯示，青霉素，氨芐西林，頭孢拉定，氧氟沙星，萬(wàn)古霉素等13種藥物對(duì)4株分離菌均敏感。

致病性試驗(yàn)表明，S.canis-JM201604、S.canis-JM201608、S.pasteurianus-JM201603、S.pasteurianus-JM2016074株分離菌對(duì)小鼠均有一定的致病性，當(dāng)外界條件改變或者機(jī)體抵抗力下降可能引起發(fā)病，犬鏈球菌和巴氏鏈球菌均為動(dòng)物體內(nèi)的條件致病菌，但是S.canis-JM201604、S.canis-JM201608分離株致病力高于S.pasteurianus-JM201603、S.pasteurianus-JM201607分離株，S.pasteurianus-JM201603和S.pasteurianus-JM201607分離株致死率較低。

養(yǎng)殖場(chǎng)應(yīng)根據(jù)犬鏈球菌和巴氏鏈球菌的流行特點(diǎn)，改善環(huán)境衛(wèi)生條件，提高機(jī)體抵抗力來(lái)抗御病原菌的攻擊，根據(jù)藥敏結(jié)果合理使用青霉素，氨芐西林，頭孢拉定，氧氟沙星，萬(wàn)古霉素等13種敏感藥物進(jìn)行預(yù)防與治療，從而控制相應(yīng)感染的發(fā)生。

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Isolation and Identification ofStreptococcusCanisandStreptococcusPasteurianusin canines

YANG Zong-tong1, LI Chao2,3, JIANG Shi-hao1, YU Peng4, SUN Qiang5, SUN Jun-chang5, WANG Dong-dong1, LUO Ning1, WANG Sen2, HUANG Kai2, WANG Shou-chun6, YIN Yan-bo1,2

(1.College of Animal Science and Veterinary Medicine, Qingdao Agricultural University， Qingdao 266019, China;2.Qingdao Bolong Laboratory Animal Co., LTD., Qingdao 266225, China；3.Qingdao Haihua Biomedicine Technical Co., LTD., Qingdao 266555, China;4.Qingdao Animal Husbandry Park, Qingdao 266200, China；5.Jimo Animal Husbandry and Veterinary Bureau, Qingdao 266200, China；6.Qingdao Oland-Better Bioengineering Co., LTD., Qingdao 266101, China)

To find the cause of the disease of four cases of dogs with cough, vomiting and sudden death, CPV, CDV, CPIV and CAV were detected by PCR and bacteria were isolated from lungs. The morphological characteristics, staining microscopic examination, biochemical test and drug sensitivity test were conducted, and sequence analysis on 16S rRNA gene were compared between the isolates and reference strain. The results showed that the four viruses were negative by PCR, and four strains of pathogenic bacteria (two strains ofStreptococcuscanisand two strains ofStreptococcusPasteurianus) were isolated from the lungs. Through the artificial challenge test in mice, the two strains of bacteria could replicate and cause pathological changes similar to those in beagles, and the two strains of bacteria were isolated from the mice in vivo. It was concluded that theStreptococcuscanisstrain and theStreptococcuspasteurianusstrain were both determined as the pathogens of the four cases. This disease was successfully controlled by using suggested medicine according to result of the drug sensitivity test in this farm.

beagle dog ;Streptococcuscanis;Streptococcuspasteurianus; isolation ; identification

2016-12-29

楊宗統(tǒng)(1992-)，男，碩士生，主要從事基礎(chǔ)獸醫(yī)學(xué)研究,E-mail:18724743813@139.com

尹燕博，E-mail:yanboyin2011@163.com

S855.1+1

A

0529-6005(2017)05-0078-04