解淀粉芽孢桿菌固態發酵黃芪中有效成分的變化

侯美如 ， 劉 宇 ， 王 巖 ， 尹珺伊 ， 陳楠楠 ， 周慶民 ， 秦平偉 ， 史同瑞 ， 楊淑萍

(黑龍江省獸醫科學研究所 ， 黑龍江齊齊哈爾161006)

解淀粉芽孢桿菌固態發酵黃芪中有效成分的變化

侯美如 ， 劉 宇 ， 王 巖 ， 尹珺伊 ， 陳楠楠 ， 周慶民 ， 秦平偉 ， 史同瑞 ， 楊淑萍

(黑龍江省獸醫科學研究所 ， 黑龍江齊齊哈爾161006)

運用解淀粉芽孢桿菌發酵黃芪， 研究發酵對黃芪有效成分含量的影響。 將黃芪中添加解淀粉芽孢桿菌在37 ℃條件下發酵72 h培養， 對照組為同等條件下黃芪固體培養基單獨培養， 利用紫外分光光度法測定兩組黃芪多糖、總黃酮和總皂苷含量。 結果表明， 發酵組較不添加解淀粉芽孢桿菌對照組多糖、 總黃酮和總皂苷含量分別提高了39.59%、 41.59%、 22.63%。因此， 利用解淀粉芽孢桿菌在一定條件下發酵黃芪， 可促進其有效成分釋放。

黃芪 ； 解淀粉芽孢桿菌 ； 固體發酵 ； 黃芪多糖 ； 總黃酮 ； 總皂苷

黃芪是我國傳統中藥材，始載于漢代《神農本草經》，為豆科多年生草本植物，為豆科植物蒙古黃芪或膜莢黃芪的干燥根[1]，具有補氣固表、利尿托毒、排膿、斂瘡生肌之功效，主要成分有黃芪多糖、黃酮類和皂苷類[2]。隨著黃芪用量和用途的逐年增加，黃芪的傳統使用方式已不能滿足社會的需求。許多新技術的出現，為黃芪的使用提供了更多的可能。其中，微生物發酵技術不僅可以提高中藥活性成分含量、提高藥效、降低毒副作用，同時中藥中的成分可促進或抑制其次生代謝產物的產生，生產出包含多種活性成分的制劑或新藥[3]。本試驗利用益生菌—解淀粉芽孢桿菌對中藥黃芪進行固體發酵，探究發酵對黃芪中有效成分含量的影響，為黃芪固體發酵技術的進一步研究提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器 黃芪購自河北凱達藥業有限公司；黃芪甲苷對照品(批號：20151213)；D(+)-無水葡萄糖對照品(批號：20160302)；蘆丁對照品(批號：20150702)，均購自上海金穗生物科技有限公司；其他試劑均為分析純。黃芪固態發酵培養基：黃芪粉(過40目篩)30 g、黃豆粉10 g、CaCO30.2 g、水59.8 mL。解淀粉芽孢桿菌SSYB菌株，由本研究室分離鑒定并保存。

UV-1900PC雙束紫外可見分光光度計為上海佑科儀器儀表有限公司出產。

1.2 黃芪發酵 取解淀粉芽孢桿菌SSYB菌株普通肉湯培養種子液，按2%接種量接種黃芪固態發酵培養基，共9份，為發酵組(SSYB組)，另外取無菌肉湯，按2%接種量接種黃芪固態發酵培養基，共9份，為對照組(C組)，置于37 ℃恒溫培養箱中培養72 h。

1.3 固體發酵黃芪中有效成分的提取

1.3.1 固體發酵黃芪中多糖的提取 取發酵組及對照組樣品各3份，參照參考文獻[4]分別加入100 mL超純水稀釋，振蕩搖勻1 h，離心，取上清，加乙醇至終濃度為75%，室溫靜置過夜，離心，收集沉淀，加水定容至500 mL。

1.3.2 固體發酵黃芪中總皂苷的提取 取發酵組及對照組樣品各3份，分別加入500 mL超純水，混勻容至100 mL，離心，取上清液，定容至500 mL。取上清提取液50 mL，參照文獻方法[5]，置于分液漏斗中，加入50 mL正丁醇，進行萃取。棄液再次用正丁醇萃取，合并萃取液，加入1% NaOH溶液100 mL，洗滌3次，除色素后用超純水洗至中性，收集正丁醇溶液， 70 ℃水浴揮干溶劑，加甲醇溶解，定容至25 mL。

1.3.3 固體發酵黃芪中總黃酮的提取 取發酵組及對照組樣品各3份，參照文獻方法[6-7]分別加入80%乙醇150 mL，混勻，浸泡過夜，70 ℃水浴超聲破碎40 min，冷卻，以5 000 r/min離心10 min，取上清液，定容至250 mL。

1.4 發酵黃芪主要成分含量的測定

1.4.1 發酵黃芪多糖含量測定

1.4.1.1 標準曲線的制備 選用苯酚-硫酸法，精密稱取105 ℃干燥至恒重的無水葡萄糖對照品0.10 g，加水定容至100 mL，即得對照品溶液。精密稱取對照品溶液0.25、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL，加水定容至50 mL，搖勻，精密吸取2 mL，加入5%苯酚溶液1 mL，混勻，迅速加入濃硫酸5 mL，振蕩5 min，置沸水浴加熱15 min，取出，迅速置于冰浴中，冷卻30 min，取出，以蒸餾水為空白，在400～700 nm處的全波長掃描，最大吸收峰位置位于491 nm處，故選擇491 nm為黃芪多糖的檢測波長，以吸光度值(A)對質量濃度(C)進行回歸分析，繪制標準曲線。

1.4.1.2 樣品溶液及其顯色后溶液穩定性試驗 取發酵黃芪多糖提取液，置室溫分別放置0、1、2、3、4 h，取提取液2.0 mL，按苯酚-硫酸顯色法進行操作，測定吸光度值；另取多糖提取液溶液2.0 mL，依法顯色后，于室溫分別放置0、1、2、3、4 h，測定吸光度值，計算樣品中每克黃芪的多糖含量。

1.4.1.3 重復性試驗 取同批發酵法黃芪多糖提取液樣品6份，分別進行苯酚-硫酸顯色試驗，測定吸光度值，計算樣品中每克黃芪的多糖含量。

1.4.1.4 回收率試驗 精密稱取已知含量的黃芪發酵固體培養基6份，精密添加不同量的無水葡萄糖對照品，依黃芪多糖提取方法制備樣品溶液，分別進行苯酚-硫酸顯色試驗，測定吸光度值，計算樣品中的多糖質量，并對回收率進行計算。

1.4.1.5 多糖提取量的測定 取7支具塞試管，以蒸餾水為空白對照，其余6管各取樣品多糖提取液2.0 mL，分別進行苯酚-硫酸顯色試驗，測定其吸光度值，計算樣品中每克黃芪的多糖含量。

1.4.2 黃芪總皂苷含量

1.4.2.1 標準曲線的制備 按香草醛-高氯酸法顯色試驗，精密稱取黃芪甲苷對照品15.0 mg，加入甲醇定容至25 mL。準確吸取0、0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06 mL于試管中， 70 ℃水浴揮干溶劑，加入新鮮配制的5%香草醛冰醋酸溶液0.2 mL，高氯酸0.8 mL， 70 ℃水浴中作用15 min后，冰水浴冷卻，加入冰醋酸5 mL，搖勻后以試劑作空白對照，于雙束紫外可見分光光度計上，在400～700 nm波長范圍內掃描，篩選測定波長為543 nm，繪制標準曲線。

1.4.2.2 樣品溶液及其顯色后溶液穩定性試驗 取發酵組黃芪皂苷提取液，置室溫分別放置0、1、2、3、4 h，取提取液25 μL，按香草醛-高氯酸法顯色試驗進行顯色后測定吸光度值。另取黃芪皂苷提取液25 μL，依法進行顯色，在室溫分別放置0、1、2、3、4 h，測定吸光度值，計算樣品中每克黃芪的總皂苷含量。

1.4.2.3 重復性試驗 取同批發酵法黃芪皂苷提取液樣品6份，按香草醛-高氯酸法顯色試驗，測定吸光度值，計算樣品中每克黃芪的總皂苷含量。

1.4.2.4 回收率試驗 精密稱取已知含量的黃芪固體發酵培養基6份，加入一定量的甲苷對照品溶液，依黃芪皂苷制備方法制備樣品溶液，運用香草醛-高氯酸法測定樣品總皂苷質量，并對回收率進行計算。

1.4.2.5 總皂苷提取量的測定 吸取樣品提取液25 μL，分別放入干燥試管中，水浴揮干溶劑，按香草醛-高氯酸法進行顯色，在543 nm波長處測定吸光度值，代入標準曲線及計算公式，得黃芪總皂苷提取量。

1.4.3 黃芪總黃酮含量 黃芪總黃酮含量測定方法的標準曲線制備、穩定性試驗、重復性試驗及回收率試驗等數據的文章已在投。

總黃酮質量分數的測定：取黃芪黃酮提取物0.75 mL，加入10 mL容量瓶內，加入1.25 mL的30%乙醇溶液；再加入5%亞硝酸鈉溶液0.5 mL，室溫作用6 min；加入10%硝酸鋁溶液0.5 mL，室溫作用6 min；加入4%氫氧化鈉溶液4.0 mL，以蒸餾水定容至刻度，室溫作用15 min；隨行試劑為空白，于波長510 nm測定吸光度值，計算黃芪黃酮含量。

標準曲線：A=13.413C-0.0055 R2=0.9998

1.5 統計學方法 使用SPSS中的獨立樣本t檢驗對數據進行差異性分析。

2 結果

2.1 發酵黃芪總多糖含量變化

2.1.1 無水葡萄糖標準曲線 以491 nm為檢測波長，測定濃度為1.25、2.5、5、10、15、20、25 μg/mL溶液的吸光度值，結果分別為0.089、0.157、0.285、0.545、0.820、1.083、1.386。回歸方程為：A=0.0541C+0.0149 R2=0.9995。試驗結果表明，在1.25～25 μg/mL 濃度范圍內，吸收度與濃度呈良好的線性關系，見圖1。

圖1 D(+)-無水葡萄糖標準曲線

2.1.2 樣品溶液及其顯色后溶液穩定性 樣品溶液及其顯色后溶液穩定性試驗結果顯示，其RSD分別為0.5070%和1.3631%，結果表明，樣品溶液及其顯色后溶液4 h內穩定，見表1。

表1 穩定性試驗結果

2.1.3 重復性試驗結果 由表2可知，黃芪多糖平均含量為2.136±0.0103 mg/g，RSD為0.4816%，方法重復性良好。

表2 重現性試驗測定結果

2.1.4 回收率試驗結果 由表3可知，其平均回收率為100.22±1.3670%，RSD為1.3636%，結果表明，本法具有良好的回收率。

2.1.5 發酵液中多糖提取結果 由表4，可知經37 ℃恒溫培養72 h，發酵組與對照組黃芪多糖質量分別為2.105±0.005 mg/g和1.508±0.042 mg/g，發酵組黃芪多糖含量高于對照組，較對照組高39.59%。

表3 回收試驗測定結果

表4 發酵黃芪中多糖含量的變化 (n=3)

注：P> 0.05為兩組試驗數據差異不顯著，P<0.05為兩組試驗數據差顯著，下表同

2.2 發酵黃芪中總皂苷含量變化

2.2.1 黃芪總皂苷標準曲線 以543 nm為檢測波長，測定濃度為1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 μg/mL溶液的吸光度值，結果分別為0.043、0.069、0.091、0.116、0.139、0.165?；貧w方程為：A=0.0241C+0.0193，R2=0.9996。試驗結果表明，在1.0～6.0 μg/mL濃度范圍內，吸收度值與濃度呈良好的線性關系，見圖2。

圖2 黃芪甲苷標準曲線

2.2.2 樣品溶液及其顯色后溶液穩定性試驗 樣品溶液及其顯色后穩定性試驗結果顯示，其RSD分別為0.0693%和0.1473%，結果表明，樣品溶液及其顯色后溶液4 h內穩定，見表5。

表5 穩定性試驗測定結果

2.2.3 重復性試驗結果 由表6可知，黃芪總皂苷平均含量為6.561±0.0044 mg/g，RSD為0.0678%，方法重復性良好。

2.2.4 回收率試驗結果 由表7可知，其平均回收率為100.12±0.2558%，RSD為0.2543%，結果表明，本法具有良好的回收率。

表6 重現性試驗測定結果

表7 回收試驗測定結果

2.2.5 發酵液中總皂苷提取結果 由表8，可知經37 ℃恒溫培養72 h，發酵組與不接菌對照組黃芪總皂苷質量分別為6.568±0.0087 mg/g和5.356±0.0057 mg/g，發酵組黃芪總皂苷含量高于對照組，較對照組高22.63%。

2.3 發酵黃芪總黃酮提取結果 由表9，可知經37 ℃培養72 h，發酵組與對照組黃芪總黃酮質量分數分別為3.183±0.0567 mg/g和2.248±0.0046 mg/g，發酵組黃芪總黃酮含量高于對照組，較對照組高41.59%。

表8 發酵黃芪中總皂苷含量的變化 (n=3)

表9 發酵黃芪中總黃酮含量的變化 (n=3)

3 討論

經比色法對黃芪中的主要活性成分—黃芪多糖、總黃酮、總皂苷進行提取量測定，經解淀粉芽孢桿菌37 ℃發酵72 h的黃芪較不添加菌黃芪培養基對照組其三種成分的含量均有提高，分別提高了39.59%、41.59%、22.63%。其原因可能是解淀粉芽孢桿菌其生產過程中能產生抑菌活性物質和多種酶類，其中分泌的纖維素酶可裂解細胞壁纖維，有利于中藥中有效成分釋放，使黃芪多糖、總黃酮和總皂苷質量分數升高。有報道指出纖維素酶可提高黃芪有效成分[5]，同時本課題組對該分離株纖維素酶活性進行了測定，證實該株解淀粉芽孢桿菌具有產纖維素酶的能力，但為證明這種推測仍需進一步的試驗和數據加以支持。

本試驗與一些運用其他菌種進行發酵黃芪的結果稍有差異，馬偉[8]運用保加利亞乳桿菌對黃芪進行發酵處理，經發酵后黃芪總皂苷質量分數增加了22%，總黃酮分數增加13.6%，但總多糖含量分數有所下降，其原因可能是保加利亞乳桿菌在發酵過程中分解了黃芪中的大分子物質，使總黃酮和總皂苷質量分數升高，同時卻消耗了黃芪中的多糖而使多糖質量分數呈現下降的趨勢。而經朱新術[9]篩選得到一株優良乳酸菌菌株FGM1，對黃芪發酵后其粗多糖提取率比黃芪提取物中高131%。推測為GM菌發酵過程中產生大量有機酸以及GM菌馴化后分泌新的胞外酶對黃芪細胞壁的水解作用，促使黃芪多糖從細胞壁或蛋白復合體中游離出來。這些結果的差異可能與菌種種類，菌種與中藥之間的相互作用，菌種生長對營養來源的需求，培養基組成成分，中藥有效成分釋放原理等方面的不同有關。

解淀粉芽孢桿菌發酵黃芪過程中，由于菌種-解淀粉芽孢桿菌在代謝過程中發生的化學反應復雜多樣，同時中藥黃芪本身含有的活性成分比較復雜，經學者研究黃芪其主要藥效成分是黃酮、皂苷和黃芪多糖，且目前從黃芪及其同屬近緣植物中已分離出的皂苷類成分達40多種，黃酮類成分也多達30種[10]，這使整個發酵過程變得更為復雜，那么整個發酵過程中的活性成分發生了怎么的變化?如藥性的改變、藥效的增減，物質的生成和轉化，這些問題都尚不清楚，本實驗僅對經解淀粉芽孢桿菌發酵的黃芪三種有效成分的質量分數進行了對比，其經發酵前、后物質的組成成分及各物質間的轉化的問題仍有待進一步的研究。

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Changes of effective components of Astragalus in the solid fermentation ofBacillusamyloliquefaciens

HOU Mei-ru ， LIU Yu ， WANG Yan ， YIN Jun-yi ， CHEN Nan-nan ， ZHOU Qing-min ，QIN Ping-wei ， SHI Tong-rui ， YANG Shu-ping

(Heilongjiang Institute of Veterinary Medicine Science ， Qiqihaer 161006 ， China)

To determine the influence ofBacillusamyloliquefaciensfermentation on the effective components of astragalus, astragalus fermentation byBacillusamyloliquefacienswas performed at 37 ℃ for 72 h, and the control group for astragalus culture excludingBacillusamyloliquefacienswas performed under the same condition. Then, the total contents of saponins, total polysaccharide and total flavone were determined by UV spectrophotometry in the two groups. The results showed the contents of polysaccharide, total flavonoids and total saponins in astragalus fermentation group were increased 39.59%， 41.59%， and 22.63% compared control group， respectively. Our findings indicate that, astragalus fermentation byBacillusamyloliquefacienscan promote the release of its effective components under certain condition.

Radix astragalus ；Bacillusamyloliquefaciens； Fermentation of Chinese herbal medicine ； Astragalus polysaccharide ； Flavonoids ； Total saponins

SHI Tong-rui

2016-10-14

黑龍江科技計劃項目(GC13B404)

侯美如(1985-)，女，助理研究員，碩士，研究方向為動物疾病防控，E-mail:houmeiru168@126.com

史同瑞，E-mail:systr@sina.com

S853.72

A

0529-6005(2017)05-0064-05