四君子散對家兔生長性能和部分免疫學(xué)指標(biāo)的影響

王毅東 ， 王東林 ， 馮 韜 ， 陳紅偉

(西南大學(xué)榮昌校區(qū)動物醫(yī)學(xué)系 ， 重慶榮昌402460)

四君子散對家兔生長性能和部分免疫學(xué)指標(biāo)的影響

王毅東 ， 王東林 ， 馮 韜 ， 陳紅偉

(西南大學(xué)榮昌校區(qū)動物醫(yī)學(xué)系 ， 重慶榮昌402460)

選擇36只45日齡新西蘭斷奶仔兔， 研究日糧中添加不同含量的中藥四君子散對生長性能及其免疫功能的影響， 設(shè)高劑量5%、 中劑量3%、 低劑量1%組、 空白對照組。 飼喂時(shí)間為一個月， 從第1天開始進(jìn)行體重稱量， 每10天進(jìn)行一次體重采集； 飼喂結(jié)束對家兔無菌采血， 進(jìn)行外周血淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)， 同時(shí)處死家兔解剖后稱取免疫器官重量。 結(jié)果顯示， 四君子散高、 中劑量組可顯著促進(jìn)外周血淋巴細(xì)胞的增殖。 表明了四君子散對家兔免疫功能有促進(jìn)作用。

四君子散 ； 器官指數(shù) ； MTT ； 家兔

四君子湯由黨參、白術(shù)、茯苓、甘草組成，現(xiàn)代藥理研究主要圍繞該方的主治和功能，并結(jié)合脾虛證本質(zhì)的研究，從多方位、多角度進(jìn)行了大量藥理研究工作，發(fā)現(xiàn)該方具有較為廣泛的藥理活性，主要集中表現(xiàn)在調(diào)節(jié)胃腸運(yùn)動，促進(jìn)消化吸收功能和免疫調(diào)節(jié)、促進(jìn)代謝方面，其他如抗腫瘤、抗?jié)儭⒋龠M(jìn)微循環(huán)等也有報(bào)道[1]。動物臨床中常用其散劑。

目前四君子湯/散在動物體內(nèi)開展的相關(guān)研究多集中在從中獸醫(yī)理論角度改善或調(diào)理脾虛癥，又如魏彥明開展了四君子湯對家兔脾虛癥調(diào)整作用的實(shí)驗(yàn)研究，以及脾虛證模型家兔神經(jīng)內(nèi)分泌機(jī)能的變化及四君子湯對其調(diào)整作用等[2,3]。本文擬通過現(xiàn)代免疫藥理學(xué)方法，結(jié)合家兔生長性能等綜合考查四君子散在家兔體內(nèi)的免疫調(diào)節(jié)作用。

1 材料與方法

1.1 主要試驗(yàn)藥品 MTT(四甲基偶氮唑鹽)(Sigma公司產(chǎn)品)；ConA(刀豆蛋白A)(Sigma公司產(chǎn)品)等。

1.2 試驗(yàn)動物 45日齡新西蘭斷奶仔兔，雌雄各半。

1.3 主要儀器設(shè)備 3-18K高速臺式冷凍離心機(jī)：德國Sigma公司；KS200型飼料顆粒機(jī)：山東省棗莊騰達(dá)飼料機(jī)械廠；SL-200型高速多功能粉碎機(jī)：浙江省永康市松青五金工具廠；DW 86L386型立式超低溫保存箱：青島海爾特種電器有限公司。

1.4 方法

1.4.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 本試驗(yàn)采用完全隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，將36只45日齡新西蘭斷奶仔兔，分成4組。分別是高劑量(飼料中四君子散的含量為5%)、中劑量(飼料中四君子散的含量為3%)、低劑量(飼料中四君子散的含量為1%)和空白對照4個組，每個組3個重復(fù)，每個重復(fù)3只兔子，進(jìn)行為期30天的動物飼養(yǎng)試驗(yàn)；飼養(yǎng)過程中進(jìn)行飼養(yǎng)前、中、后3次體重稱量；飼養(yǎng)結(jié)束，進(jìn)行無菌采血和免疫器官采集、重量的稱量，最后進(jìn)行外周血淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)(MTT),并使用酶標(biāo)儀檢測OD值。

1.4.2 試驗(yàn)動物的飼養(yǎng)管理 試驗(yàn)兔采用籠養(yǎng)，人工飼喂，每日7:00和19:00分別飼喂適量添加了不同劑量的四君子散的自制顆粒飼料，自由飲水，采用自然光照，每天定時(shí)清糞、通風(fēng)。

基礎(chǔ)日糧參照NRC(1977)家兔飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)配制而成[4]，基礎(chǔ)日糧組成及營養(yǎng)水平見表1。

表1 試驗(yàn)基礎(chǔ)日糧組成及其營養(yǎng)水平 (風(fēng)干基礎(chǔ)/%)

注：A：預(yù)混料為每千克飼糧提供The premix provides following per kilogram of diet：VA 8 000 IU；VD31 000 IU;VE 50 mg;Lys 1.59;Met 1.5 g;Cu 50 mg;Fe 100 mg;Mn 30 mg;Mg 150 mg;I 0.1 mg;Se 0.1 mg。B：營養(yǎng)水平為計(jì)算值。Nutrient levels were calculated values

1.4.3 測定指標(biāo)和方法

1.4.3.1 生長性能的測定 每10 d測量1次兔體重，計(jì)算出平均日增重。飼養(yǎng)1個月后，計(jì)算平均日增重、料肉比等指標(biāo)。

1.4.3.2 免疫器官指數(shù)的測定 放血解剖兔并摘取其免疫相關(guān)器官活組織，剔除脂肪和結(jié)締組織，用濾紙吸去血漬，千分之一天平稱重，計(jì)算免疫器官指數(shù)。

免疫器指數(shù)=免疫器官重量(g)/動物體重(kg)；胸腺指數(shù)=胸腺重(g)/體重(kg) ×1 000;脾臟指數(shù)=脾臟重(g)/體重(kg) ×1 000;圓小囊指數(shù)=圓小囊重(g)/體重(kg)×1 000;引突指數(shù)=引突重(g)/體重(kg)×1 000。

1.4.3.3 血漿中淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)(MTT試驗(yàn)) 取1 mL新鮮抗凝血與全血及組織稀釋液1∶1，混勻后小心加于等體積本分離液之液面上；以1 500 r/min離心15 min。此時(shí)離心管中由上至下細(xì)胞分4層，第1層是血漿層；第2層是為環(huán)狀乳白色淋巴細(xì)胞層；第3層是透明的分離液層；第4層是紅細(xì)胞層；收集第2層細(xì)胞放入含洗滌液(Hank′s液)4～5 mL的試管中，充分混勻后，以1 800 r/min離心20 min，棄去上清液留沉淀細(xì)胞重新懸起，重復(fù)洗滌2次即得所需淋巴細(xì)胞。加入1 640培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106個/mL，接種入96孔板，每孔100 μL,每個樣品重復(fù)8孔，同時(shí)加入用終濃度為10 μL/mL的ConA液刺激，另設(shè)細(xì)胞凋零孔。將細(xì)胞板放入5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，每孔避光條件下每孔加入20 μL MTT液，繼續(xù)培養(yǎng)3 h后取出，每孔吸出上清液，加入100 μL裂解液，在微量震蕩器上混勻使其顏色變澄清，用酶聯(lián)免疫儀檢測490 nm下的吸光度，作為淋巴細(xì)胞增殖的指標(biāo)[5]。

2 試驗(yàn)結(jié)果

2.1 四君子散對兔子生產(chǎn)性能影響 見表2。

表2 四君子散對家兔生產(chǎn)性能的影響 (Means±SD,n=9)

從表2的數(shù)據(jù)結(jié)果分析，可以看出試驗(yàn)組與空白對照組進(jìn)行單因素方差分析日增重和料肉比差異均不顯著(P>0.05)，說明四君子散對家兔生產(chǎn)性能影響不明顯。

2.2 四君子散對兔子免疫器官指數(shù)的影響 見表3。

表3 四君子散對兔子免疫器官指數(shù)的影響 (Means±SD,n=9)

從表3的數(shù)據(jù)結(jié)果分析，試驗(yàn)組兔的免疫器官指數(shù)高于空白對照組。試驗(yàn)組圓小囊和脾臟的免疫指數(shù)空白普遍高于空白對照組，但單因素方差分析差異不顯著(P>0.05)。試驗(yàn)組圓小囊、胸腺、脾臟和引突的免疫指數(shù)在低劑量時(shí)都高于空白對照組，但差異不顯著(P>0.05)。

2.3 血漿中淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)(MTT試驗(yàn)) 見表4。

表4 血漿中淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)(MTT試驗(yàn))結(jié)果(OD值)(Means±SD,n=9)

注：同列肩注*表示差異顯著(P<0.05)

從表4可以看出，試驗(yàn)組與對照空白組的淋巴細(xì)胞增殖情況比較，中劑量和高劑量均顯著高于空白對照組(P<0.05)。說明中藥四君子散添加劑可以顯著促進(jìn)外周血淋巴細(xì)胞增殖。

3 分析討論

四君子湯由黨參、白術(shù)、茯苓、甘草組成，具有增強(qiáng)免疫功能、促進(jìn)代謝、護(hù)肝、增強(qiáng)垂體一腎上腺皮質(zhì)系統(tǒng)功能、抗腫瘤與抗突變、改善微循環(huán)、抗血小板聚集、延緩衰老、抗應(yīng)激反應(yīng)等作用[1]。目前四君子散在動物試驗(yàn)方向主要研究的是其對動物胃腸運(yùn)動的調(diào)節(jié)，消化吸收功能的改善、新陳代謝的促進(jìn)和免疫調(diào)節(jié)等。

試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，試驗(yàn)組與空白對照組進(jìn)行單因素方差分析，日增重和料肉比差異不顯著，說明四君子散對家兔生產(chǎn)性能影響不明顯，在低、高劑量組與空白對照組的比較，日增重略有降低，料肉比略有上升。

免疫指數(shù)在一定程度上反映了動物的免疫功能，免疫指數(shù)越大，說明免疫性能越好[6]。而引突和圓小囊是兔子特有的免疫器官，引突位于盲腸的末端，圓小囊位于結(jié)腸和盲腸的交接處，同上這兩個免疫器官指數(shù)在一定程度上也反映兔子的免疫功能，免疫指數(shù)越大，說明免疫性能越好。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，試驗(yàn)組圓小囊、胸腺、脾臟和引突的免疫指數(shù)在低劑量時(shí)都高于空白對照組，但差異不顯著。

T細(xì)胞和B細(xì)胞能特異性識別抗原，并能活化、增殖、分化，分別介導(dǎo)細(xì)胞免疫和體液免疫，T細(xì)胞和B細(xì)胞還可以進(jìn)一步分為若干亞群，這些淋巴細(xì)胞及亞群在免疫應(yīng)答過程中相互協(xié)作、相互制約，共同完成對抗原物質(zhì)的識別、應(yīng)答和清除，從而維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定[7]。淋巴細(xì)胞增殖能力的強(qiáng)弱，在某種程度上代表了淋巴細(xì)胞功能的高低，因此，檢測淋巴細(xì)胞增殖水平是細(xì)胞免疫研究的一種常用方法[8]。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，試驗(yàn)組比空白對照組的淋巴細(xì)胞增殖數(shù)高，中劑量和高劑量組均顯著提高 。說明中藥四君子散添加劑可以顯著促進(jìn)外周血淋巴細(xì)胞增殖。

[1] 李玉,孫志闊,王希春，等.加味四君子湯對脾虛小鼠免疫機(jī)能應(yīng)激和消化吸收的影響[J].中國畜牧獸醫(yī),2015,42(3):714-720.

[2] 魏彥明.四君子湯對家兔脾虛癥調(diào)整作用的實(shí)驗(yàn)研究[J].甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),1997，32(3):261-266.

[3] 魏彥明,瞿自明.脾虛證模型家兔神經(jīng)內(nèi)分泌機(jī)能的變化及四君子湯對其調(diào)整作用[J].中國獸醫(yī)學(xué)報(bào), 1999，29(5):486-488

[4] 麻名文,李福昌.日糧精氨酸水平對斷奶～2月齡肉兔生長性能、免疫器官指數(shù)及血清指標(biāo)的影響[J]. 動物營養(yǎng)學(xué)報(bào),2009,21(3):405-410.

[5] 陳紅偉,李英倫,張志強(qiáng),等.兔抗菌組蛋白對小白鼠生長和細(xì)胞免疫功能的影響[J].中國獸醫(yī)學(xué)報(bào),2014,34(5)：798-803

[6] 王宜強(qiáng).淺論基礎(chǔ)免疫學(xué)研究新進(jìn)展對眼科免疫學(xué)研究的啟示[J].中華實(shí)驗(yàn)眼科雜志,2014,32(7):577-582.

[7] 錢國英,陳永富.免疫學(xué)[M]. 杭州: 浙江大學(xué)出版社, 2010:286.

[8] 賈琳,郭斌. 蘿藦多糖粗提物對免疫抑制小鼠免疫器官及淋巴細(xì)胞增值影響的初步研究[J]. 遼寧醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2011, 32(5): 400-402.

Effect ofSijunziPowder on immune organ index and lymphocyte proliferation in rabbits

WANG Yi-dong , WANG Dong-lin , FENG Tao , CHEN Hong-wei

(Department of Veterinary Medicine, Southwest University,Rongchang Campus, Chongqing 402460,China)

To study on the impact of sijunzi powder on the growth performance and immune function,36 45-day-old New Zealand weaned rabbits were randomly assigned to high, medium and low dose groups and blank control group,and 5%,3%,and 1% ofSijunziPowder added in the basic diet.The experimental time was one month,and the rabbits were weighed every 10 days Blood sampled were couected to carry out peripheral blood lymphocyte proliferation test at the last day of the experiment ,and at the same time,the immune organs were weighed. The results showed that the effect ofSijunziPowder on the production performance of rabbits was not obvious, but the middle dose group weight gain was increased by 0.74%,and the feed conversion ratio was decreased by 0.80%.We also found that it improved the immune organ index of rabbit sacculus rotundus and spleen, but there was no significant. The high dose group significance promoted the peripheral blood lymphocyte proliferation. It is concluded that theSijunziPowder has a promoting effect on the immune function of rabbits.

SijunziPowder ； Organ index ； MTT ； Rabbit

CHEN Hong-wei

2016-11-21

中央高校基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)(SWU114026,XDJK2016B010)；西南大學(xué)教育教學(xué)改革研究重點(diǎn)項(xiàng)目(2014JY096)

王毅東(1994-)，男，碩士生，研究方向?yàn)楂F醫(yī)免疫藥理學(xué)，E-mail:chw80926@126.com

陳紅偉，E-mail：chw80926@126.com

S853.72

A

0529-6005(2017)05-0061-03