青海大通牛新孢子蟲病血清學調查

伊平昌 ， 李國平

(青海省大通縣畜牧獸醫站 ， 青海西寧810100)

青海大通牛新孢子蟲病血清學調查

伊平昌 ， 李國平

(青海省大通縣畜牧獸醫站 ， 青海西寧810100)

新孢子蟲病(Neosporosis)是由犬新孢子蟲(Neosporacaninum)寄生于宿主細胞內引起犬、牛等多種動物共患的一種原生寄生蟲病，對牛的危害最明顯，給養牛業帶來了巨大的經濟損失。新孢子蟲主要寄生于中樞神經系統、肌肉、肝臟、腦及其他內臟組織中，家畜感染新孢子蟲后主要表現為腦炎、肝炎、持續性肺炎等，懷孕母畜則多出現流產、產弱胎、死胎和木乃伊胎等，新生仔畜則多表現為四肢運動障礙和神經系統疾病[1]。犬、狼、山狗和紅狐等犬科動物是新孢子蟲的終末宿主[2]。新孢子蟲的中間宿主種類較多，可感染牛、羊、禽類、靈長類及多種野生哺乳動物等；新孢子蟲有兩種感染途徑即垂直傳播和水平傳播，牛在誤食了被新孢子蟲卵囊污染的食物后感染，通過垂直傳播迅速在該牛群中散播，感染可持續多年[3]。截至目前，還沒有十分有效防治新孢子蟲病的藥物或疫苗[4]。新孢子蟲病流行于世界各地，廣泛存在于挪威、澳大利亞、新西蘭、中國等50多個國家。我國對該病研究起步較晚，自2003年劉群等[5]首次從奶牛血清中檢出新孢子蟲陽性抗體，隨后在全國多地相繼檢出了羊、奶牛等動物感染新孢子蟲病的報道。對新孢子蟲病作出早期診斷，及時隔離淘汰患病家畜是有效的防制措施。

目前，酶聯免疫吸附試驗(ELISA)應用較廣泛，主要用于血清和初乳中抗犬新孢子蟲IgG抗體的檢測，常用的ELISA抗原有Nc SAG1、Nc GRA7、Nc GRA2等[6]。有關于青海省動物感染新孢子蟲方面的報道甚少，尤其是大通縣地區牛感染新孢子蟲病方面仍為空白。鑒此，筆者于2016年1月對大通縣4個不同地區的200份牛血清樣品和1個牛場的100份牛血清樣品進行了新孢子蟲抗體ELISA檢測、診斷，獲得了大通縣地區有關牛新孢子蟲病感染現狀的實際數據，為進一步掌握大通縣地區牛新孢子蟲病的綜合防控提供了科學依據。

1 材料與方法

1.1 血清樣品 2016年1月分別隨機采自大通縣4個鄉鎮200份血樣(其中向化鄉50份，青林鄉50份，青山鄉50份，崗沖鄉50份)和1個牛場的100份血樣，共計300份血清樣品。經牛尾靜脈采血，擺成斜面，低溫保存送回實驗室，室溫放置過夜或37 ℃靜置0.5～1 h后，以3 000 r/min離心10 min，分離血清，置-20 ℃冷凍保存，備用。

1.2 主要儀器 LED-3型超凈工作臺，購自蘇州凈化設備有限公司；PHS-3B型精密PH計、FA2014N型電子天平，購自上海精密科學儀器有限公司；85-2A型雙向恒溫磁力攪拌器，購自金壇市醫療儀器廠；TGL18M型臺式高速冷凍離心機，購自長沙易達儀器有限公司；AUCMA低溫保存箱、BCD-202K型冰箱，購自澳柯瑪股份有限公司；722N型可見分光光度計，購自上海菁華科技儀器有限公司；IMARK型酶標儀，購自Bio-Rad Laboratories, Inc, Japan；DNX-9620型電腦洗板機，購自北京普朗新科技有限公司；精宏電熱恒溫培養箱，購自上海精宏實驗設備有限公司；SPX-250B型生化培養箱，購自金壇市白塔金昌實驗儀器廠。

1.3 主要試劑 牛新孢子蟲抗體(Neosporiasis Ab)酶聯免疫分析試劑盒(生產批號：2015010D05)，購自上海恒遠生物科技有限公司，美國TSZ進口分裝。

1.4 主要操作步驟 按嚴格牛新孢子蟲抗體酶聯免疫分析檢測試劑盒的說明書進行操作，具體步驟省略。

1.5 計算和判定標準 試驗有效性：陽性對照孔平均值≥1.00，陰性對照平均值≤0.10；臨界值(CUT OFF)計算：臨界值=陰性對照孔平均值+0.15；陰性判定：樣品OD值<臨界值(CUT OFF)者為牛新孢子蟲抗體(Neosporiasis Ab)陰性；陽性判定：樣品OD值≥臨界值(CUT OFF)者為牛新孢子蟲抗體(Neosporiasis Ab)陽性。

1.6 統計分析 利用Microsoft Excel 2003軟件，對不同地區、品種和年齡的樣本進行卡方檢驗，當P<0.05時差異顯著，P<0.01時差異極顯著。

2 結果

2.1 本次調查應用ELISA方法，對大通縣向化、青山、青林、崗沖4個不同地區和1個牛場的300份牛血清樣品進行牛新孢子蟲病血清學檢測。檢測中陽性判定均值為1.372，陰性判定均值為0.084，試驗成立。根據臨界值作陰、陽性判定，結果表明，在大通縣地區300份牛血清樣品中共檢出18份陽性血清，平均陽性率為6%；大通縣向化、青山、青林、崗沖地區和某牛場牛新孢子蟲陽性率分別為8%、12%、14%、2%和0%，大通縣向化、青山、青林和崗沖地區均為牛新孢子蟲病的流行地區，其中青山和青林地區流行較嚴重，某牛場的100份牛血清樣品均未檢測出陽性，見表1。

表1 大通縣地區新孢子蟲感染情況

2.2 不同品種牛血清樣本新孢子蟲病感染情況調查 本次試驗對300份血清樣本進行了新孢子蟲抗體檢測，并將不同的品種黃牛、奶牛和牦牛區分檢測，見表2。結果表明，黃牛的陽性率為11.96%，奶牛的陽性率為3.47%，牦牛的陽性率為2.86%，不同品種牛間都易感，牛新孢子蟲感染率最高的是黃牛，其次是奶牛、牦牛。

表2 大通縣地區不同品種牛新孢子蟲感染情況

2.3 不同年齡段間牛血清樣本新孢子蟲病感染情況調查 不同年齡段間的牛新孢子蟲病檢測結果，見表3。其中0～2歲的陽性率為3.06%，3～5歲陽性率為9.38%，6歲以上陽性率為6.52%，說明年齡越高易感性就越大，3歲以上年齡段牛比2歲以內牛感染率高4.37%。

表3 不同年齡間牛新孢子蟲感染情況

2.4 大通縣不同地區牛新孢子蟲病感染對比情況 大通縣向化、青山、青林和崗沖四個地區新孢子蟲感染情況對比，見圖1。如圖1所示，青林和青山地區牛新孢子蟲病感染之間差異不顯著(P>0.05)，青林、青山與崗沖之間差異顯著(P<0.05)。青林、青山、向化與崗沖之間牛新孢子蟲感染率存在顯著差異(P<0.05)。

圖1 大通縣不同地區牛新孢子蟲病感染情況對比

3 小結與討論

3.1 自1988年Dubey等[7]發現新孢子蟲病以來，科學家們對牛新孢子蟲病的研究方法取得了很大的進展，如檢測抗原、抗體的免疫學診斷方法ELISA、聚合酶鏈反應(PCR)、間接熒光抗體試驗與免疫組織檢測等很多方法。近年來，檢測牛新孢子蟲病的方法很多，但操作方法復雜，不適合臨床應用，而ELISA方法，操作簡便、快速，且特異性和敏感性都較高，廣泛應用于牛新孢子蟲病檢測[8]。本次試驗應用美國TSZ進口分裝的牛新孢子蟲抗體(Neosporiasis Ab)酶聯免疫分析試劑盒對采集的300頭份牛血清樣品進行牛新孢子蟲病檢測，結果檢出了18份陽性血清樣品，平均陽性總檢出率為6%(18/300)。檢測結果初步說明，在大通縣檢測的四個不同地區存在牛感染新孢子蟲病的情況，且陽性率也略有不同，而在牛場未檢出陽性，調查初步掌握了大通縣地區牛新孢子蟲病的感染情況。

3.2 在對大通縣向化、青山、青林、崗沖四個不同地區和某牛場的300份血清樣本進行牛新孢子蟲病抗體調査研究中，向化、青山、青林、崗沖四個地區均是牛新孢子蟲的感染地區，其中青山和青林地區感染較為嚴重，崗沖地區感染率最低，這可能與地理環境、飼養管理方式有關。試驗中向化、青山、青林屬于腦山地區以放牧為主，崗沖位于淺山地區飼養管理以夏季放牧和冬季舍飼為主，腦山地區陽性率高于淺山地區，說明放牧飼養牛對新孢子蟲病更易感；牛場飼養方式主要為圈飼，飼養管理較正規，未檢出陽性。在不同品種間牛新孢子蟲病調查顯示，黃牛陽性率髙于牦牛陽性率，說明牦牛的抗病能力高于黃牛的抗病能力。在不同年齡的牛血清中6歲以上的陽性率高于0～2歲的陽性率，說明成年牛更易感染此病。調查中發現陽性率較高的地區有犬存在，因犬既是新孢子蟲的中間宿主也是終末宿主，造成牛感染新孢子蟲病的機率就大，易感性增加。

[1] 郭俊林.犬新孢子蟲病[J].北京農業, 2012(25):33.

[2] Gondim L F, Mc Allister M M, Pill W C,etal. Coyotes (Canis latrans) are definitive of Neospora caninum [J]. Vet Parasitol, 2004，34(2):159-161．

[3] Dubey J P, Schares G, Ortega-Mora L M. Epidemiology and control of neosporous and Neospora caninum[J].Clin MicrobiolRev, 2007, 20(2):323-367．

[4] 劉群,李博,齊長明,等. 奶牛新孢子蟲病血清學檢測初報[J].中國獸醫雜志,2003,39(2):8-9.

[5] Dubey J P, Buxton D, Wouda W. Pathogenesis 0f bovine Neosporosis[J]. Journal of Comparative Pathology, 2006, 134(4):267-289.

[6] Jin C, Yu L, Wang Y,etal. Evaluation of Neospora caninum truncated dense granule protein 2 for serodiagnosis by enzyme-linked immunosorbent assay in dogs[J]. Experimental Parasitology, 2015, 157:88-91.

[7] Dubey J P, Carpenter J L, Speer C A,etal. Newly recog nized falal protozoan disease of dogs[J]. Am Vet Med Assoc, 1988, 192(9):1269-1285.

[8] 賈立軍,張守發,魯承.犬新孢子蟲可溶性抗原分析及間接ELISA檢測方法的建立[J].中國獸醫雜志, 2009, 45(9):25-26.

2016-05-19

伊平昌(1979-)，男(蒙古族)，獸醫師，博士，主要從事動物疾病診斷和防控工作，E-mail：yipingchang_111@126.com

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0529-6005(2017)05-0057-02