兩種接種途徑對羊布魯菌病疫苗免疫抗體變化的影響

張 雷 ， 曹 東 ， 鄭文金 ， 閆海濱 ， 林懷明 ， 楊國麗 ， 何利昆 ， 陳 瑤 ， 曹明慧

(1.遼寧省動物疫病預防控制中心 ， 遼寧沈陽110164 ； 2.遼寧省動物醫學研究院 ， 遼寧沈陽110164 ；3.遼寧省建昌縣動物疫病預防控制中心 ， 遼寧葫蘆島125300 ； 4.中國獸醫藥品監察所 ， 北京海淀100081)

兩種接種途徑對羊布魯菌病疫苗免疫抗體變化的影響

張 雷1，2， 曹 東1，2， 鄭文金3， 閆海濱1，2， 林懷明3， 楊國麗1，2， 何利昆1，2， 陳 瑤1，2， 曹明慧4

(1.遼寧省動物疫病預防控制中心 ， 遼寧沈陽110164 ； 2.遼寧省動物醫學研究院 ， 遼寧沈陽110164 ；3.遼寧省建昌縣動物疫病預防控制中心 ， 遼寧葫蘆島125300 ； 4.中國獸醫藥品監察所 ， 北京海淀100081)

動物布魯菌病是一種嚴重影響牛、羊養殖業的人獸共患傳染病，給畜牧業生產和人類健康帶來了巨大的危害。在疫情比較嚴重的地區，通過給易感動物接種布魯菌病疫苗，是目前防控動物發生布魯菌病的主要措施之一。在疫苗廠家提供的布魯菌病疫苗使用說明書中，規定可以通過口服或肌肉注射等方法進行免疫，但是這兩種免疫方法在實際的疫苗免疫中的免疫效果以及差異并沒有提到。本試驗通過口服和肌肉注射兩種接種途徑對羊進行布魯菌病S2疫苗的免疫，然后對免疫抗體產生情況進行了比較分析。

1 材料

1.1 疫苗 S2布魯菌病疫苗(批號：2016005)，新疆天康畜牧生物技術有限公司生產。

1.2 實驗動物 分別選擇1個綿羊規模場(A場)和1個山羊場(B場)，要求選擇的規模場2年內布病抗體檢測陰性或病原學無陽性，且防疫條件良好，能夠與外界形成有效的防疫隔離。

1.3 免疫工具 改良的連續注射器，可更換針頭和噴注噴頭。

1.4 試劑 虎紅平板凝集抗原(201602)、試管凝集抗原(批號：201601)，均購自中國疾病預防控制中心。

1.5 分析軟件 SPSS 17.0統計分析軟件。

2 方法

2.1 羊場的布魯菌病凈化 對選擇的羊場的全部羊只連續進行2次布魯菌病的凈化，兩次凈化間隔1個月，以避免本底血清和群體發生布魯菌病對試驗結果的影響。

2.2 羊群的分組 綿羊規模場(A場)隨機選擇羊34只(2月齡以上)，隨機分為2個組，分別為口服免疫組22只(A1組，免疫20只，空白對照2只)、肌肉注射免疫組12只(A2組，免疫10只，空白對照2只)。山羊規模場(B場)隨機選擇羊46只(2月齡以上)，隨機分為2個組，分別為口服免疫組23只(B1組，免疫20只，空白對照3只)、肌肉注射免疫組23只(B2組，免疫20只，空白對照3只)。羊群分組后，每組的羊只單獨飼養在一個圈舍內，不得與其他羊群混養。

2.3 免疫方法

2.3.1 口服疫苗組 按照疫苗說明書的方法進行免疫。將凍干疫苗用生理鹽水稀釋后，進行口腔噴注，每只羊免疫1頭份。免疫操作時，用改良的連續注射器將疫苗注入口內，然后捏緊嘴巴，待其將疫苗咽入后，再松開嘴巴。

2.3.2 肌肉注射疫苗組 按照疫苗說明書的方法進行免疫。將凍干疫苗用生理鹽水稀釋后，用連續注射器注入頸部肌肉，每只羊免疫1頭份。免疫過程中每只羊使用1個針頭，避免交叉污染。

2.3.3 血清采集時間 分別在免疫后3、7、9、15、35、70、97、121、166、185日齡進行采血檢測，后續血清采集時間依據抗體水平檢測結果再決定。

2.3.4 抗體檢測方法 按照國家標準GB/T18646—2002中虎紅平板凝集方法和試管凝集方法操作，先用虎紅平板凝集試驗進行初篩，初篩陽性的血清再用試管凝集試驗進行下一步的抗體檢測。

2.3.5 抗體滴度檢測方法 按照國家標準GB/T18646—2002中試管凝集方法操作，將檢測的血清倍比稀釋，稀釋的滴度分別為1∶25，1∶50，1∶100，1∶200，1∶400。

2.4 免疫效果分析 將試驗結果統計后，利用統計軟件SPSS17.0 比較分析兩種免疫途徑對動物布魯菌病群體免疫抗體的差異。

3 結果

3.1 羊場布魯菌病凈化結果 兩個養殖場的兩次凈化的布魯菌病抗體檢測結果全部為陰性，可以進行下一步的試驗。

3.2 群體免疫抗體產生分析結果

3.2.1 群體抗體陽性率產生情況 試驗羊只在免疫后按照計劃的時間進行血清采集檢測，并對免疫群體的抗體陽性率情況進行分析。兩種免疫途徑的群體抗體陽性率產生情況見表1，并將抗體陽性率產生情況繪制成圖，見圖1。

表1 兩種免疫途徑的群體抗體陽性率產生情況

圖1 兩種免疫途徑的群體抗體陽性率產生情況

3.2.2 兩種免疫途徑對群體免疫抗體滴度的影響

(1)抗體滴度匯總：對口服免疫和肌肉注射免疫產生的抗體滴度進行匯總分析。由于第1天、第3天、第185天抗體滴度全部為0,就不再進行統計分析，只進行第5天、9天、15天、35天、70天、97天、121天、166天共8批次的匯總分析，匯總結果見表2，并繪制抗體滴度分布百分比圖(中插彩版圖2)，其中抗體滴度<1∶25用白色部分顯示，抗體滴度>1∶25的滴度都用彩色顯示，顏色隨著滴度的增加而逐漸加深；(2) 平均抗體滴度變化情況：在統計分析之前，需要將抗體滴度表示方式轉化為對數方式和編碼滴度(見表3)，然后計算群體平均抗體編碼滴度[1](見表4)，并繪制群體平均抗體編碼滴度曲線圖(見圖3)；(3) 差異性檢驗：利用SPSS 17.0統計分析軟件對兩種免疫途徑產生的抗體進行t檢驗，并將t檢驗值進行匯總(見表5)。

表2 免疫后不同日期抗體滴度匯總表

表3 抗體滴度轉化成編碼滴度方式

*：<1∶25按照1∶12.5計算；**：T/C =滴度倒數/C最初稀釋度

4 討論

動物布魯菌病是近些年來威脅養殖業以及人類健康的一個重要的人獸共患傳染病，采取布魯菌病疫苗免疫是防控該病的一個有效的措施。在疫苗廠家提供的疫苗使用說明書中，推薦動物布魯菌病的免疫方法為口服免疫或肌肉注射，但是對于這兩種免疫方法的免疫效果的差別以及產生的抗體持續情況、抗體滴度的消長情況等未做具體說明，而且目前國內外也未見相關報道。

表4 免疫后不同日期的群體平均編碼滴度情況

圖3 免疫后不同日期群體平均抗體編碼滴度變化

表5 兩種途徑免疫后不同天數的抗體滴度t檢驗比較結果

a：差異極顯著； b：差異顯著

本試驗主要采用了口服和肌肉注射兩種方式進行免疫，并在免疫后的不同日期檢測免疫抗體。在免疫抗體評估的指標上，主要選擇了群體免疫的評估方法。所謂群體免疫，就是當傳染病的病原體傳入某一動物群體時，動物群體的大部分個體因接種疫苗而獲得了免疫力，使其他沒有免疫力的個體間接受到保護而免于感染。在預防接種的群體免疫效果評估指標中，常用的評估指標有抗體轉陽率、保護率、效果指數、保護指數、抗體平均滴度和抗體持續時間等[2]。其中效果指數是指對照組的發病率/接種組的發病率，一般大于1，保護指數是指(對照組發病率-接種組發病率)/對照組發病率，但是對于本試驗來說，由于無法進行暴露試驗或攻毒試驗，因此保護率、效果指數、保護指數都不適合動物布魯菌病的疫苗評估，只選擇了抗體轉陽率、抗體平均滴度和抗體持續時間等指標，并對這些指標進行了統計分析。

在抗體轉陽判定的滴度值方面，由于在動物布魯菌病免疫效果評價過程中目前還沒有相關規定，而在GB/T18646—2002中，規定血清感染抗體在1∶50 稀釋時出現50%凝集的動物即可判定為陽性，因此在本試驗中暫時將1∶50的滴度凝集做為判定標準，可能在轉陽率的判定過程中稍有誤差，但不影響抗體滴度曲線變化及差異顯著性的統計分析。

在試驗動物的選擇上，同時選擇了綿羊和山羊，以避免在試驗結果的分析中受到畜種差別的影響。在每個試驗組中，都設置了哨兵動物做為空白對照。在整個試驗過程中，空白對照都未檢出抗體，表明在整個試驗過程中試驗結果未受到外來布魯菌病的影響。

從本試驗的結果來看，口服免疫產生的效果明顯比肌肉注射的效果差。

在抗體產生時間上，口服免疫在免疫后第9天才檢測到抗體，而肌肉注射免疫在第5天即可檢測到；在群體抗體轉陽率上，肌肉注射的群體轉陽率迅速上升，在第5天時，平均抗體陽性率就達到70%，峰值出現在第15天，群體轉陽率達到96.7%，持續時間長，一直持續到第166天仍可檢測到抗體，而口服免疫雖然峰值出現的時間也在第15天，但是群體抗體轉陽率僅為25%，檢測到抗體的時間持續到第121天，在第166天以后就沒有檢測出抗體。

在抗體滴度的檢測上看，肌肉注射的抗體滴度也明顯超過口服免疫，口服免疫產生的最高平均編碼滴度出現在第15天，僅為0.75，而肌肉注射產生的平均編碼滴度最高為4.3，而且在第5天到第97天期間產生的平均編碼滴度都超過口服免疫產生的最高平均編碼滴度。將兩者的抗體滴度產生情況進行t檢驗，發現從第5天開始，一直到第166天為止，兩者的差異都在顯著以上，在第5天到第97天期間，兩者的差異為極顯著。

分析口服免疫途徑產生的抗體效果差的原因，可能是在接種過程當中，疫苗受到消化道中各種消化液成分的影響。

動物機體防御布魯菌病的過程既是體液免疫的過程，也是細胞免疫的過程。在評估動物免疫效果的評價指標中，除了血清抗體指標以外，還需要進行細胞免疫方面的評估，包括IFN、IL、免疫細胞變化等，將兩者綜合分析，才能完全揭示出機體的整體免疫情況。本研究從免疫抗體變化規律方面反映了動物布魯菌病疫苗免疫后的效果，為動物布魯菌病的防控提供了參考數據。

[1] 黃保續.獸醫流行病學[M].北京：中國農業出版社，2009:248-253.

[2] 何啟蓋.群體免疫、群體健康與豬病防控[J].養殖與飼料，2015(1)：1-4.

2016-12-31

張雷(1976-)，男，高級獸醫師，碩士，從事動物疫病檢測和研究工作，E-mail: leizhang266@163.com

S851.35

B

0529-6005(2017)05-0052-03