牛傳染性鼻氣管炎gB基因TaqMan探針及SYBR Green1熒光定量PCR方法的建立與比較

張喜喜 ， 許 健 ， 李永清 ， 周雙海

(1.北京農(nóng)學(xué)院動(dòng)物科技學(xué)院 ， 北京昌平102206 ； 2.北京市農(nóng)林科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所 ， 北京海淀100097)

牛傳染性鼻氣管炎gB基因TaqMan探針及SYBR Green1熒光定量PCR方法的建立與比較

張喜喜1,2， 許 健2， 李永清2， 周雙海1

(1.北京農(nóng)學(xué)院動(dòng)物科技學(xué)院 ， 北京昌平102206 ； 2.北京市農(nóng)林科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所 ， 北京海淀100097)

為建立牛傳染性鼻氣管炎病毒(IBRV)熒光定量PCR檢測(cè)方法，本研究利用IBRVgB基因序列設(shè)計(jì)引物及相應(yīng)探針，分別建立TaqMan探針與SYBR Green 1熒光定量PCR方法，并對(duì)兩種方法的敏感性等綜合比較。結(jié)果顯示，SYBR Green 1熒光定量PCR方法的相關(guān)系數(shù)(R2)為0.998，擴(kuò)增效率(E)為95.7%；TaqMan探針熒光定量PCR方法的R2為0.999，E為108.3%；兩種方法的敏感性均為0.2 TCID50，變異系數(shù)均小于3%。綜合結(jié)果顯示，兩種檢測(cè)方法無(wú)顯著差異。最后，本研究成功建立了檢測(cè)IBRV的熒光定量PCR，將為IBRV的臨床檢測(cè)提供方法。

牛傳染性鼻氣管炎病毒 ；TaqMan 探針熒光定量PCR ； SYBR Green 1 熒光定量PCR ； 臨床檢測(cè)

牛傳染性鼻氣管炎(IBR)是由牛傳染性鼻氣管炎病毒(IBRV)引起牛的一種呼吸道疾病，以高熱、呼吸困難、鼻炎、鼻竇炎和上呼吸道炎癥為主要特征[1]。此病毒主要以潛伏感染和持續(xù)性感染為主，病牛長(zhǎng)期甚至終生帶毒，給防控工作帶來(lái)了極大的困難。臨床癥狀多種多樣：有呼吸道型、生殖道型、流產(chǎn)型、腦膜腦炎型[2]。目前此病毒感染過(guò)我國(guó)多省份地區(qū)的牛群，同時(shí)由于沒有適當(dāng)?shù)拿庖叻雷o(hù)措施，該病呈上升趨勢(shì)，對(duì)牛群肥育率、產(chǎn)奶量和繁殖影響極大，給養(yǎng)牛業(yè)造成了嚴(yán)重危害[3]。沒有特效藥物可以治療牛傳染性鼻氣管炎，截至目前，疫苗接種和撲殺是主要的防控措施。所以建立檢測(cè)牛傳染性鼻氣管炎的方法顯得尤為重要。

牛傳染性鼻氣管炎又稱為牛I型皰疹病毒，屬于皰疹病毒科皰疹病毒亞科水痘病毒成員，所以具有皰疹病毒科成員所共有的形態(tài)特征，是一種雙鏈DNA病毒[4]。IBRV的gB基因在病毒感染過(guò)程中起重要作用，而gB基因還具有高度保守性，可以用于建立SYBR Green 1與TaqMan探針熒光定量PCR來(lái)檢測(cè)IBRV。

1 材料與方法

1.1 病毒與細(xì)胞 IBRV病毒、MDBK細(xì)胞、牛病毒性腹瀉病毒、牛口蹄疫病毒，豬偽狂犬病病毒及雞馬立克病毒均來(lái)自北京市農(nóng)林科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所。

1.2 主要試劑 膠回收試劑盒，購(gòu)自Bioteke；小提質(zhì)粒試劑盒與小片段連接試劑盒，購(gòu)自TianGen；TOP10感受態(tài)細(xì)胞，購(gòu)自康為世紀(jì)生物科技有限公司；PGM-T vector、DNA 片段膠回收試劑盒和質(zhì)粒小提試劑盒，均購(gòu)自QIAGEN生物制品有限公司；SYBR?Green I Real-time PCR Master Mix，購(gòu)自Bio-Rad；Marker DM-2000,購(gòu)自康維世紀(jì)生物科技有限公司；Low MolecμLar weight DNA Ladder，購(gòu)自BioLabs；PremixExTaq(probe qPCR)，購(gòu)自TaKaRa生物科技有限公司；引物與探針均在上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.3 主要儀器 德國(guó)耶拿PCR儀，Bio-Rad iQTM5熒光定量PCR儀，恒溫金屬浴，37 ℃搖床,生物安全柜，離心機(jī)。

1.4 引物與探針系列

表1 引物與探針的設(shè)計(jì)

1.5 病毒 DNA 的提取 按照DNA提取試劑盒步驟，從接毒后的細(xì)胞中提取IBRV的DNA于-40 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 目的片段擴(kuò)增及質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品制備 將病毒DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系為:2×TaqMaster Mix 12.5 μL ,引物質(zhì)粒up和質(zhì)粒down 各1 μL，DNA模板2 μL，加水補(bǔ)齊25 μL體系。反應(yīng)條件為94 ℃ 5 min, 94 ℃ 20 s,60 ℃ 20 s,72 ℃ 30 s 35個(gè)循環(huán)，72 ℃ 10 min，4 ℃ forever。

按照 DNA 片段膠回收試劑盒說(shuō)明書回收純化目的片段，連接到 pGM-T vector 載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌 TOP10 感受態(tài)細(xì)胞，最終得到質(zhì)粒，并送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行測(cè)序。對(duì)IBRV-PGMT-T 質(zhì)粒濃度進(jìn)行測(cè)定，換算成拷貝數(shù)。

1.7 SYBR Green 1熒光定量PCR與TaqMan探針熒光定量PCR的建立

1.7.1 熒光定量PCR條件的優(yōu)化 (1)退火溫度的優(yōu)化：在熒光定量PCR儀上進(jìn)行溫度梯度擴(kuò)增，溫度在52 ℃～57 ℃之間，分析其熔解曲線和擴(kuò)增曲線，Ct值出現(xiàn)早的和熔解曲線無(wú)特異峰值的為最佳退火溫度；(2)引物濃度的優(yōu)化：在熒光定量PCR儀上引物濃度為10 μmol/L,分別取0.2 μL～1 μL八個(gè)連續(xù)濃度梯度進(jìn)行熒光定量PCR找出最佳引物濃度。TaqMan探針與SYBR Green 1熒光定量PCR引物濃度一致。TaqMan 探針(1 μmol/L)分別取1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7 μL，水補(bǔ)足20 μL體系，摸索最佳探針濃度。

1.7.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 對(duì) IBRV質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行10倍梯度稀釋，選取其中8個(gè)連續(xù)梯度的質(zhì)粒 DNA 作為模板進(jìn)行 Real-time PCR 擴(kuò)增。SYBR Green 1反應(yīng)體系為：10 μL SYBR?Green I Real-time PCR Master Mix，上下游引物(10 μmol/L)各0.4 μL，2 μL 質(zhì)粒，ddH2O補(bǔ)足至 20 μL。TaqMan探針反應(yīng)體系：PremixExTaq(probe qPCR) 10 μL,上下游引物各0.4 μL，TaqMan探針6.5 μL，水0.7 μL，DNA 2 μL。兩者反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)；然后95 ℃ 1 min，55 ℃ 30 s，95 ℃ 30 s 以得到熔解曲線。PCR反應(yīng)結(jié)束后，熒光定量 PCR 儀將自動(dòng)生成擴(kuò)增曲線、熔解曲線、標(biāo)準(zhǔn)曲線與回歸方程。同時(shí)將 PCR 產(chǎn)物在 3%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，確定 PCR 產(chǎn)物大小。

1.7.3 特異性試驗(yàn) 將牛病毒性腹瀉病毒、牛口蹄疫病毒，和同為皰疹科病毒的豬偽狂犬病病毒、雞馬立克病病毒等病毒 DNA 或 cDNA 分別作為模板，同時(shí)進(jìn)行上述 Real-time PCR 擴(kuò)增，以檢測(cè)其特異性。

1.7.4 重復(fù)性試驗(yàn) 對(duì)質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行 10 倍梯度稀釋，選取第3、4、5稀釋度的重組質(zhì)粒 DNA，每個(gè)濃度用建立的兩種熒光定量PCR 方法進(jìn)行6次重復(fù)性檢測(cè)，計(jì)算Ct平均值與變異系數(shù)，來(lái)評(píng)價(jià)該兩種方法的可重復(fù)性。

1.7.5 敏感性試驗(yàn) 培養(yǎng)MDBK細(xì)胞，進(jìn)行IBRV的TCID50，然后提取病毒DNA，稀釋至200 TCID50、 20 TCID50、2 TCID50、0.2 TCID50、0.02 TCID50，分別進(jìn)行TaqMan探針熒光定量PCR與SYBR Green 1熒光定量PCR，得出檢測(cè)最低濃度。

1.8 臨床樣品檢測(cè)及統(tǒng)計(jì)分析 取20份某牛場(chǎng)陽(yáng)性血清檢測(cè)，進(jìn)行建立的兩種熒光定量PCR檢測(cè)，分別統(tǒng)計(jì)檢出率。

2 結(jié)果

構(gòu)建的質(zhì)粒經(jīng)NanoDrop 測(cè)定，OD260/OD280為1.93，濃度為357.2 ng/μL，換算成拷貝數(shù)為1.013×1011copies/μL。

2.1 熒光定量PCR條件摸索

2.1.1 退火溫度的選擇 采用熒光定量PCR儀進(jìn)行溫度梯度擴(kuò)增，溫度在52 ℃～56 ℃之間，隨著溫度增高，擴(kuò)增效率先提高后下降，在54.6 ℃達(dá)到最高。所以溫度選54.6 ℃為最佳退火溫度。如圖1所示。

圖1 熒光定量PCR溫度梯度擴(kuò)增結(jié)果注：1～8分別為52 ℃～56 ℃之間隨機(jī)溫度

2.1.2 引物濃度的優(yōu)化 模板為標(biāo)準(zhǔn)品的第3個(gè)稀釋樣品，引物濃度為10 μmol/L,分別取0.2 μL～1.0 μL九個(gè)連續(xù)濃度，從擴(kuò)增曲線與其所對(duì)應(yīng)的Ct值可以看出最佳引物取值為0.4 μL(10 μmol/L)，見圖2。

圖2 引物濃度的優(yōu)化注：1～9分別為0.2～1.0 μL九個(gè)濃度梯度所對(duì)應(yīng)的編號(hào)擴(kuò)增曲線

2.1.3TaqMan探針與引物濃度比例摸索 體系中PremixExTaq(probe qPCR) 取10 μL，上下游引物各取0.4 μL(10 μmol/L)，探針(1 μmol/L)分別取1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7 μL，其余用水補(bǔ)足20 μL。最終選擇TaqMan探針取6.5 μL。

2.2 熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

2.2.1 SYBR Green 1熒光定量PCR 將所構(gòu)建的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行10倍梯度稀釋，從中選取中間8個(gè)連續(xù)梯度建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，即進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增，結(jié)果顯示，擴(kuò)增曲線平滑規(guī)則，熔解曲線為單峰，標(biāo)準(zhǔn)曲線顯示出良好的擴(kuò)增效率和重復(fù)效率，見圖3。

圖3 SYBR Green 1熒光定量PCR擴(kuò)增曲線、熔解曲線和標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2.2TaqMan探針熒光定量PCR結(jié)果 進(jìn)行TaqMan探針熒光定量PCR擴(kuò)增，與SYBR Green 1 熒光定量做法一致，結(jié)果顯示，擴(kuò)增曲線平滑規(guī)律，標(biāo)準(zhǔn)曲線顯示出較高的擴(kuò)增效率、重復(fù)性良好，見圖4。

圖4 TaqMan探針熒光定量PCR擴(kuò)增曲線與標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2.3 特異性試驗(yàn) 將牛病毒性腹瀉病毒、牛口蹄疫病毒，和同為皰疹科病毒的豬偽狂犬病病毒、雞馬立克病病毒等病毒 DNA 或 cDNA 分別作為模板，同時(shí)進(jìn)行上述 Real-time PCR 擴(kuò)增，未發(fā)現(xiàn)有擴(kuò)增信號(hào)，表明特異性良好。

2.2.4 重復(fù)性試驗(yàn) 對(duì)質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行10倍梯度稀釋，選取3個(gè)濃度的重組質(zhì)粒 DNA，每個(gè)濃度用建立的 Real-time PCR 方法進(jìn)行6 次重復(fù)性檢測(cè)，計(jì)算Ct平均值與變異系數(shù)，來(lái)評(píng)價(jià)兩者方法的可重復(fù)性。由圖5、圖6結(jié)果可看出變異系數(shù)均小于3%(<5%)。

2.2.5 敏感性試驗(yàn) 進(jìn)行兩者的敏感性試驗(yàn)，從結(jié)果來(lái)看，兩者并沒有顯著差別，可以檢測(cè)到最低濃度為0.2 TCID50。具體結(jié)果見圖7。

2.2.6 臨床檢測(cè) 取20份某牛場(chǎng)陽(yáng)性血清檢測(cè)，進(jìn)行本人建立的熒光定量PCR檢測(cè)和普通PCR檢測(cè)，分別統(tǒng)計(jì)兩者檢出率均為100%，都比普通PCR檢出率高，兩者沒有區(qū)別。

圖5 SYBR Green 1熒光定量PCR第3、4、5稀釋度質(zhì)粒重復(fù)試驗(yàn)的擴(kuò)增曲線和對(duì)應(yīng)擴(kuò)增Ct值

圖6 TaqMan探針熒光定量PCR第3、4、5稀釋度質(zhì)粒重復(fù)試驗(yàn)的擴(kuò)增曲線和擴(kuò)增曲線對(duì)應(yīng)的Ct值

圖7 SYBR Green 1熒光定量PCR敏感性試驗(yàn)與TaqMan探針熒光定量PCR敏感性試驗(yàn)

3 討論

牛傳染性鼻氣管炎(IBR) ，又稱“紅鼻病”或“壞死性鼻炎”，是由牛傳染性鼻氣管炎病毒(IBRV)引起的牛的一種急性、熱性、接觸性傳染病。該病被世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)列為B類動(dòng)物傳染病，為法定報(bào)告?zhèn)魅静　BRV感染牛后可侵染多個(gè)部位，導(dǎo)致持續(xù)性感染、免疫抑制，造成牛群大范圍感染，給IBR防控和根除造成極大困難。其發(fā)病率及傳播速度較高、較快，不僅威脅到飼養(yǎng)人員的生命安全，還造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。有學(xué)者討論，捕殺陽(yáng)性病牛是對(duì)該病預(yù)防的最明顯和有效的防制措施[5]，損失太大，所以及早檢測(cè)出陽(yáng)性病牛是關(guān)鍵。

牛傳染性鼻氣管炎是由牛傳染性鼻氣管炎病毒(IBRV)引起的一種急性傳染病，臨床癥狀分為5大類型，呼吸道型、生殖道型、結(jié)膜炎型、流產(chǎn)型、腦炎型。牛傳染性支氣管炎病毒又命名為1型牛皰疹病毒(BHV-1)，為雙股DNA病毒，全長(zhǎng)約138 kb。IBRV大約編碼40種結(jié)構(gòu)蛋白，有11種為結(jié)構(gòu)蛋白。gB基因具有高度保守性，此基因的同源性在所有皰疹病毒科最高，所以不同皰疹病毒之間的進(jìn)化關(guān)系可以利用此基因進(jìn)行分析，并由此可以檢測(cè)IBRV[6]。

本研究根據(jù)IBRVgB基因保守序列設(shè)計(jì)引物，構(gòu)建質(zhì)粒，進(jìn)行SYBR Green 1熒光定量與TaqMan探針熒光定量PCR，兩者共用1對(duì)引物擴(kuò)增，建立了檢測(cè)IBRV方法并比較兩者方法。其中SYBR Green 1熒光定量PCR擴(kuò)增效率為95.7%，TaqMan探針熒光定量PCR 擴(kuò)增效率為108.3%(0.8～1.2之間)，表示條件優(yōu)化提高擴(kuò)增效率；SYBR Green 1熒光定量PCR R2=0.998，TaqMan探針熒光定量PCR R2=0.999(R2﹥0.99)，表示線性比較好；SYBR Green 1熒光定量PCR熔解曲線無(wú)非特異峰值，表示引物特異性良好，擴(kuò)增曲線平滑有規(guī)律；敏感性試驗(yàn)中檢測(cè)到最低濃度值為0.2 TCID50。綜上所有試驗(yàn)結(jié)果表明SYBR Green 1熒光定量與TaqMan探針熒光定量PCR兩者差別不大。

曲光剛等[7]2012年建立TaqMan熒光定量PCR敏感性試驗(yàn)中檢測(cè)到質(zhì)粒最低濃度為11個(gè)拷貝/μL。陳圣軍等[8]2013年建立的牛傳染性鼻氣管炎病毒SYBR Green 1熒光定量的檢測(cè)敏感度為360 copies/25μL，喬波等[9]2015建立的傳染性鼻氣管炎病毒TaqMan-MGB熒光定量 PCR 檢測(cè)敏感度為14.9拷貝/μL，本試驗(yàn)建立的SYBR Green 1熒光定量PCR與TaqMan探針熒光定量PCR檢測(cè)到最低質(zhì)粒濃度為100 copies/μL。2009年，唐泰山等[10]建立的IBRV-gB基因TaqMan熒光定量PCR敏感性試驗(yàn)中檢測(cè)下限為0.02 TCID50；蔣珊珊等2013年建立的gB基因的TaqMan熒光定量PCR敏感性試驗(yàn)中檢測(cè)到最低濃度為0.2TCID50[11]，本研究敏感試驗(yàn)中兩者熒光定量PCR檢測(cè)到最低濃度也為0.2TCID50。 所有建立的方法由于引物不同，探針不同，得到的結(jié)果就會(huì)不同，臨床上檢測(cè)IBRV的方法會(huì)越來(lái)越多。

本研究建立的IBRV-gB SYBR Green 1熒光定量PCR和TaqMan探針熒光定量PCR增加了臨床檢測(cè)牛傳染性鼻氣管炎病毒的方法，使臨床檢測(cè)增加了更多的選擇，并且在本試驗(yàn)中比較了SYBR Green 1熒光定量PCR和TaqMan探針熒光定量PCR兩者結(jié)果，兩者沒有明顯的區(qū)別。

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The establishment and comparison of real-time fluorescent quantitative PCR assay with TaqMan probe and SYBR Green 1 real-time PCR of gB gene ininfectiousbovinerhinotracheitisvirus

ZHANG Xi-xi1,2, XU Jian2, LI Yong-qing2, ZHOU Shuang-hai1

(1.College of Animal Science and Veterinary Medicine, Beijing University of Agriculture, Beijing 102206, China；2.Institute of Animal Husbandry and Veterinary Medicine, Beijing Municipal Academy of Agriculture and Forestry Sciences, Beijing 100097, China)

To establish the real-time fluorescent quantitative PCR assay to detectinginfectiousbovinerhinotracheitisvirus(IBRV), primers and one corresponding TaqMan probe were designed. Real-time fluorescent quantitative PCR assay with TaqMan probe and SYBR Green 1 real-time PCR were separately carried out and their sensitivities were comprehensively compared. The results showed that the correlation index (R2) was 0.998, and amplification efficiency (E) was 95.7% for in SYBR Green 1 real-time PCR; For the real-time fluorescent quantitative PCR assay withTaqman probe, R2 was 0.999 and E was 108.3%. Their sensitivities was 0.2TCID50; the variations was no more than 3%. All results showed that there was no obvious difference in both methods. In conclusion, two methods of detection of IBRV are established and can be used for clinical tests.

InfectiousBovineRihinotracheitisVirus; real-time fluorescent quantitative PCR assay with TaqMan probe ; SYBR Green 1 real-time PCR ; clinical tests

LI Yong-qing

2016-10-19

現(xiàn)代農(nóng)業(yè)技術(shù)體系北京市奶牛創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)崗位專家自助經(jīng)費(fèi)項(xiàng)目(bjcystx-ny-3)

張喜喜 (1990-)，女，碩士生，主要從事畜禽疾病防控研究，E-mail：1573566425@qq.com

李永清，E-mail：chunyudady@sina.com

S858.23

A

0529-6005(2017)05-0042-05