咪達唑侖對小型豬不同腦區氨基酸類神經遞質的影響

郭 岑 ， 李欣然 ， 李曉蕾 ， 李亞楠 ， 李麗娜 ， 王宇鑫 ， 張一鳴 ， 王 浩 ， 高 利

(東北農業大學動物醫學學院 ， 黑龍江哈爾濱150030)

咪達唑侖對小型豬不同腦區氨基酸類神經遞質的影響

郭 岑 ， 李欣然 ， 李曉蕾 ， 李亞楠 ， 李麗娜 ， 王宇鑫 ， 張一鳴 ， 王 浩 ， 高 利

(東北農業大學動物醫學學院 ， 黑龍江哈爾濱150030)

為了研究咪達唑侖對小型豬各腦區氨基酸類神經遞質的影響，探討咪達唑侖的中樞麻醉機制，將20只小型豬隨機分為4組，分別為對照組、誘導組、麻醉組和恢復組。連續觀察小型豬行為學變化，并于相應時間點采取腦組織，通過高效液相色譜(HPLC)法檢測天冬氨酸(ASP)、谷氨酸(GLU)、甘氨酸(GLY)、氨基丁酸(GABA)的含量。結果顯示，咪達唑侖的麻醉機制與抑制腦干內興奮性神經遞質釋放和促進大腦和小腦內抑制性神經遞質釋放相關。

咪達唑侖 ； 小型豬 ； 氨基酸類神經遞質 ； 麻醉

咪達唑侖作為新一代苯二氮卓類藥物，臨床療效較好，不良反應較輕，常用作抗焦慮、催眠、鎮靜[1]，在獸醫臨床多與其他藥物合用來增強效果[2-3]。氨基酸類神經遞質是中樞神經系統內重要的一類神經遞質，在認知、神經元損傷和中樞疲勞等生理病理過程起關鍵作用。許多學者在使用麻醉藥物后，檢測氨基酸類神經遞質含量的變化趨勢，以探究不同麻醉藥物對氨基酸類神經遞質的影響。因此，本試驗擬研究咪達唑侖對小型豬不同腦區氨基酸類神經遞質的影響，探討其可能的中樞麻醉作用機制，為咪達唑侖臨床使用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 Waters 600高效液相色譜儀，色譜柱Symmetry C18 (4.6×150 mm，5 μm)；甘氨酸(GLY)標準品(Sigma,109K0107)；L-谷氨酸(L-GLU)標準品(Sigma,BCBB5881)；天冬氨酸(ASP)標準品(Sigma,129K0181)；γ-氨基丁酸(GABA)標準品(Sigma,0001446172)；色譜級甲醇；色譜級乙腈。

1.2 實驗動物分組 實驗用巴馬小型豬20只，7～8 月齡，雌雄兼有，體重 32.2±4.3 kg，健康狀況良好。由東北農業大學外科教研室從三元豬場購入2頭成年公豬和8頭成年母豬自行繁育而得。隨機分為對照組、誘導組、麻醉組和恢復組共4個試驗組，每組5只。

1.3 腦組織樣品采取 對照組肌肉注射生理鹽水(0.2 mL/kg體重)處死后立即取腦組織，試驗組肌肉注射咪達唑侖(0.2mL/kg體重)后，根據小型豬行為學變化分別于小型豬倒地不起(誘導組)、翻正反射消失(麻醉組)、翻正反射恢復(恢復組)后處死，立即取腦組織，用冷藏后生理鹽水沖洗，并迅速于冰面上依次分離大腦皮層、海馬、腦干、小腦和丘腦，液氮冷凍，-80 ℃保存。

1.4 RP-HPLC檢測氨基酸神經遞質方法的建立 取腦組織制備勻漿液，4 ℃低溫離心取上清液400 μL。流動相C為0.05 mol/L的醋酸鈉緩沖液(pH值=6.5)，B為乙腈/水(V/V=50∶50)，進行梯度洗脫，流動相C的濃度由初始時65%經10 min至10%，18 min至40%；流速0.6 mL/min；檢測波長360 nm；柱溫28 ℃的色譜行為進行高效液相色譜-熒光檢測。取20 μL進樣分析，采用外標法定量，以測定4種氨基酸類神經遞質濃度。

1.5 數據分析 用平均值±標準差表示數據。所有結果通過SPSS 19數據分析系統做單因素方差分析，P>0.05為差異不顯著，P<0.05為差異顯著。

2 結果

2.1 咪達唑侖麻醉后小型豬不同腦區ASP的含量 如表1所示，大腦和海馬內ASP含量在誘導期與對照組相比上升68%，差異極顯著(P<0.01)，18%差異不顯著(P>0.05)；恢復期含量接近正常水平。丘腦、小腦ASP含量則在誘導期與對照組相比下降36%和24%，差異極顯著(P<0.01)；麻醉期和恢復期含量回升且高于正常水平，其中丘腦恢復期含量與對照組相比差異顯著(P<0.05)。腦干內ASP含量在麻醉期與對照組相比下降37%，差異極顯著(P<0.01)；恢復期含量仍低于正常水平且差異極顯著(P<0.01)。

表1 咪達唑侖麻醉下小型豬不同腦區ASP的含量變化 (μg/mL)

注：各組與對照組差異用*表示，*：與對照組比較差異顯著，P<0.05；**：與對照組比較差異極顯著P<0.01。各組與誘導組差異用#表示，#：與誘導組比較差異顯著，P<0.05；##：與誘導組比較差異極顯著，P<0.01，下表同

2.2 咪達唑侖麻醉后小型豬不同腦區GLU的含量 如表2所示：各腦區GLU含量在誘導期升至最高；麻醉期降至最低，麻醉期GLU含量與對照組相比分別下降15%、20%、4%、9%和37%，除丘腦外均差異顯著(P<0.01或P<0.05)。大腦、海馬、丘腦和小腦內GLU含量在恢復期均恢復至正常水平；腦干內GLU含量在恢復期低于正常水平，與對照組相比差異極顯著(P<0.01)。

表2 咪達唑侖麻醉下小型豬不同腦區GLU的含量變化 (μg/mL)

2.3 咪達唑侖麻醉后小型豬不同腦區GLY的含量 如表3所示，大腦、海馬、小腦和腦干內GLY含量在誘導期與對照組相比分別上升69%、63%、50%，差異顯著(P<0.05)，3%差異不顯著(P>0.05)；麻醉期和恢復期含量接近正常水平，差異不顯著(P>0.05)。丘腦內GLY含量與對照組相比，在麻醉期上升74%，差異顯著(P<0.05)；恢復期含量下降但高于正常水平，差異不顯著(P>0.05)。

表3 咪達唑侖麻醉下小型豬不同腦區GLY的含量變化 (μg/mL)

2.4 咪達唑侖麻醉后小型豬不同腦區GABA的含量 如表4所示，大腦、小腦和腦干內GABA含量在誘導期與對照組相比分別上升61%、16%和52%，差異顯著(P<0.01或P<0.05)；麻醉期和恢復期含量下降，接近正常水平。海馬內GABA含量在誘導期與對照組相比上升13%，差異不顯著(P>0.05)；麻醉期含量與對照組相比下降23%，差異顯著(P<0.05)；恢復期含量回升。丘腦內 GABA 含量在麻醉期與對照組相比下降29%，差異顯著(P<0.05)；恢復期含量回升并接近正常水平。

表4 咪達唑侖麻醉下小型豬不同腦區GABA的含量變化 (μg/mL)

3 討論

目前，大量研究表明，多數麻醉藥可通過直接或間接作用來改變中樞神經系統中不同氨基酸類神經遞質的含量，從而引起相應受體功能改變來發揮全麻機制。GLU在大腦發育、學習記憶、長時程增強及神經元可塑性等方面均起重要作用[4-5]。全麻藥可能通過抑制GLU與NMDA受體的結合，同時降低GLU突觸前膜的釋放，并增強GLU在突觸間隙的攝取，來調節谷氨酸能神經元的興奮性而產生麻醉效應。王恒林等[6]通過建立NMDA誘導的PC12細胞損傷模型，使用不同劑量的咪達唑侖進行處理，經測定后發現，只有GLU含量較對照組明顯降低，由此證明，咪達唑侖可抑制MNDA誘導的PC12細胞損傷導致的GLU釋放，由此推斷咪達唑侖可能是通過抑制GLU釋放而發揮其保護細胞的作用。與本試驗結果相符，咪達唑侖使小型豬5個腦區內GLU含量下降，提示咪達唑侖的麻醉作用與抑制興奮性突觸的傳遞，減少GLU的合成和釋放有關。

作為興奮性氨基酸類神經遞質，ASP作用效果不及GLU強烈。本試驗注射咪達唑侖后，小型豬大腦和海馬內ASP含量在誘導期升至最大值；恢復期含量接近于正常水平，與周穎等[7]報道的丙泊酚使大鼠丘腦內ASP含量降低一致；大腦和海馬內ASP含量升高相相反。這可能與動物種屬相關。提示咪達唑侖能減少丘腦、小腦和腦干內ASP合成與釋放，從而減少興奮性神經遞質與其受體的結合，降低神經元興奮性。

GABA是中樞神經系統中最主要的抑制性神經遞質，夏夢等[8]認為，苯二氮卓類藥物可以與GABAA受體相應位點結合，促進GABA與低親和力的GABA位點進行結合來增加C1-內流。一方面能夠使大腦、海馬、小腦和腦干GABA合成和釋放增加，另一方面亦作用于這些腦區中的GABAA受體，使GABA與GABAA受體的作用加強，降低神經元興奮性。本試驗結果可推測咪達唑侖能夠促進大腦、海馬、小腦和腦干內GABA的釋放，從而增強抑制性突觸的傳遞，降低神經元興奮性，產生麻醉作用。

GLY受體在脊髓和腦干的抑制性突觸傳遞中起重要作用，而且該受體廣泛分布于中樞神經系統中[9]。陳颯颯等[10]通過研究氯胺酮麻醉對大鼠腦內氨基酸類神經遞質的影響，認為大鼠海馬內GLY含量的增加是氯胺酮麻醉行為學改變的機制之一。本試驗顯示咪達唑侖能增加五個腦區GLY釋放，使得抑制性電位增強，神經元興奮性降低。

4 結論

咪達唑侖麻醉后，小型豬腦干興奮性神經遞質含量下降37%，大腦和小腦抑制性神經遞質含量分別升高65%和33%，咪達唑侖的麻醉機制可能與抑制腦干內興奮性神經遞質釋放和促進大腦和小腦內抑制性神經遞質釋放相關。

[1] Rajeev J, Rajeev K Y. Voltammetric behavior of sedative drug midazolam at glassy carbon electrode in solubilized systems[J]. Journal of Pharmaceutical Analysis，2012,2(2):123-129.

[2] 陳鴻，潘寧玲. 全身麻醉誘導時咪唑安定與氯胺酮催眠相互作用的研究[J]. 臨床麻醉學雜志，2010,26(10):851-853.

[3] 李強，張衛，謝積勝. 咪達唑侖聯合氯胺酮在巴馬香豬腮腺核磁共振檢查中的麻醉效果[J]. 廣西醫學，2015,37(9):1219-1221.

[4] Collingridge G L, Singer W. Excitatory amino acid receptors and synaptic plasticity[J]．Trends Pharmacol Sci，1990(11):290-296．

[5] Kubo Y，Sekiya H，Namiki S，et tal. Imaging extrasynaptic glutamate dynamics in the brain[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences，2010,107(14):6526.

[6] 王恒林，王卓強，劉秀珍，等．咪達唑侖對N-甲基-D-天冬氨酸致傷PC12細胞氨基酸水平的影響[J]．解放軍醫學雜志，2008,33(1):75-76．

[7] 周穎，康金錄，王明遠，等．丙泊酚對大鼠不同腦區氨基酸類遞質的影響[J]．中華麻醉學雜志，2009,25(4):329-331．

[8] 夏夢，于布為．作用于GABA-R的靜脈麻醉藥(異丙酚與咪唑安定)之間相互作用的研究進展[J]．國外醫學麻醉學與復蘇分冊，2003,24(4):231-234．

[9] Greenblatt E P, Meng X, Divergence of volatile anesthetic effects in inhibitory neurotransmitter receptors[J]. Anesthesiology, 2001,94(6):1026-1033.

[10] 陳颯颯，段世明，王鈞．氯胺酮麻醉期間大鼠腦內氨基酸遞質水平的變化[J]．中國藥理學通報，2002,18(1):117-118．

Effects of midazolam on amino acid neurotransmitter in different encephalic regions of miniature pigs

GUO Cen ， LI Xin-ran ， LI Xiao-lei ， LI Ya-nan ， LI Li-na ，WANG Yu-xin ， ZHANG Yi-ming ， WANG Hao ， GAO Li

(College of Veterinary Medicine， Northeast Agricultural University， Harbin 150030， China)

In this study，we investigated the effects of midazolam on amino acid neurotransmitter in different encephalic regions of miniature pigs ,and the anesthetic mechanism of midazolam on the central nervous system. 20 miniature pigs were divided randomly into 4 groups:control group，inducing group maintenance of anesthesia group，and recovery-from-anesthesia group,and In different anesthetic periods, the content of amino acid neurotransmitters in different encephalic regions of miniature pigs was detected by high performance liquid chromatography (HPLC).The results indicate that the anesthetic mechanism of midazolam may be related with the inhibition excitatory neurotransmitter release of brain stem and promote inhibitory neurotransmitter release of brain and cerebellum.

Midazolam ； Pigs ； Amino acid neurotransmitter ； Anesthesia

GAO Li

2016-07-27

國家自然科學基金面上項目(31372491，31572580)

郭岑(1992- )，女，碩士生，從事臨床獸醫學研究，E-mail：554892820@qq.com

高利， E-mail：gaoli43450@163.com

S857.144

A

0529-6005(2017)05-0034-03