新城疫病毒分離株real-time RT-PCR檢測與其遺傳變異特性分析

周小桐 ， 初歡歡 ， 單 虎 ， 徐 燕 ， 于海龍 ， 王述柏

(1.青島農業大學動物科技學院 ， 山東青島266109 ； 2.青島農業大學教務處，山東青島266109；3.青島奕奕和農牧科技有限公司， 山東青島266109)

新城疫病毒分離株real-time RT-PCR檢測與其遺傳變異特性分析

周小桐1， 初歡歡1， 單 虎1， 徐 燕2， 于海龍3， 王述柏1

(1.青島農業大學動物科技學院 ， 山東青島266109 ； 2.青島農業大學教務處，山東青島266109；3.青島奕奕和農牧科技有限公司， 山東青島266109)

對肉雞養殖場的疑似新城疫病例提取病毒核酸，采用便攜式real-time RT-PCR儀T-COR4在2 h內檢測到5株新城疫病毒，分別編號為RS1、RS2、HY3、LZ4、PL5。對確診的陽性樣品進行病毒增殖，血凝/血凝抑制試驗，MDT、EID50、ICPI指數測定，F基因的遺傳變異分析，結果顯示，RS1、RS2、HY3株為新城疫基因Ⅶd型強毒株，LZ4、HY5株為新城疫基因Ⅱ型弱毒株。

新城疫病毒 ； 分離鑒定 ； F基因 ； 遺傳變異 ； 毒力

新城疫(ND)是由新城疫病毒(NDV)引起的禽類急性、高度接觸性傳染病，嚴重危害養禽業發展，我國農業部將其列為一類動物疫病。近年來，隨著ND全面防控免疫措施的深入，加之養禽業規模化集約化程度不斷提高，ND的流行得到一定控制，整體呈下降趨勢，但局部地區仍發生持續性地方流行，存在免疫失敗和免疫帶毒現象。對新城疫及時、快速、準確地檢測對疾病的診斷和治療具有重要意義。目前，NDV已有系統成熟的檢測方法，但大多需在實驗室標準條件下進行，檢測過程較長。本研究旨在探討NDV快速、實時的檢測方法及發病地區NDV的遺傳變異特性，從而為養禽場及時有效防控ND提供科學方法和理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.2 標準陽性血清 ND、禽流感(AI)(H5、H9)、產蛋下降綜合征(EDS76)標準血清，購自中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所。

1.1.3 SPF雞胚 購自山東省農業科學院家禽研究所，1 日齡雛雞為SPF雞胚于隔離器中自行孵化飼養。

1.1.4 主要儀器與試劑 便攜式real-time RT-PCR儀T-COR4(Tetracore Inc.,Rockville,MD,USA)；MagMAXTM-96 Viral RNA Isolation Kit、AgPath-IDTMOne-Step RT-PCR Kit(LifeTechnologies, Carlsbad, CA, USA)。

1.2 方法

1.2.1 雞群ND血清抗體水平的測定 雞群隨機抽檢10份樣品，翅靜脈采血檢測血清ND抗體水平[1]。

1.2.2 樣品處理 采取疑似患雞的肝和肺組織研磨至勻漿狀態，加入適量PBS制成20%無菌濾液。

1.2.3 RT-PCR反應

1.2.3.1 引物設計與合成 參考GenBank發表的F基因序列，設計探針和特異性引物，擴增基因片段大小為363 bp。

表2列出了學生對學習效果、工作量和組內表現等各項的綜合回答情況。t檢驗表明,探究式實驗相對于傳統實驗提高了學習效果。此外,探究式實驗的占分比例可合理地反映工作量,小組能很好地進行實驗。對表1中問題Q3的回答表明,學生建議今后開展探究式實驗的平均次數為1.2(95%置信區間1.1～1.3),這意味著在其后的每個年級應開設至少一次探究式實驗。

1.2.3.2 病毒RNA的提取 按ABI Life Technologies MagMAXTM-96 Viral RNA Isolation Kit說明書，提取樣品RNA。

1.2.3.3 一步法RT-PCR反應 運用便攜式real-time PCR儀T-COR4進行PCR擴增。共25 μL反應體系：2×reaction Buffer，12.5 μL；混合引物(0.4 μmol/L)，1.5 μL；探針(0.132 μmol/L)，0.5 μL；1×Enzyme Mix，1.0 μL；RNA，3.0 μL；H2O，6.5 μL。

RT-PCR反應程序為：反轉錄45 ℃，10 min；DNA聚合酶反應(95 ℃，10 min；95 ℃，15 s；60 ℃，45 s)，共45個循環。1.2.4 病毒增殖 陽性病料濾液接種9～11 日齡 SPF雞胚尿囊腔，每個樣品接種5枚雞胚，0.2 mL/枚，設置陰性對照接種生理鹽水，37 ℃恒溫孵箱孵育。觀察雞胚病變，無菌收集尿囊液，盲傳3代[2]。

1.2.5 血凝試驗(HA) 測定尿囊液的HA效價[1]。

EID50的對數=高于50%感染的病毒最高稀釋度的對數+距離比×稀釋系數的對數

1.2.9 接種致病指數(ICPI)測定 參考文獻方法，測定病毒ICPI指數[4]。

1.2.10 PCR產物的克隆及序列測定分析 用DNAStar軟件對PCR產物的克隆測序結果進行遺傳進化分析[5]。

2 結果

2.1 發病地區新城疫流行特點及主要臨床癥狀

自山東省肉雞養殖場共收集疑似新城疫樣品52份，檢測到5株NDV，分別編號為RS1、RS2、HY3、LZ4、PL5。發病雞群的血清抗體水平、主要臨床癥狀和流行特點見表1。

表1 發病雞群的血清抗體水平、主要臨床癥狀和流行特點

2.2 RT-PCR反應 經real-time RT-PCR儀T-COR4擴增，Ct值在21.0時出現熒光增長曲線，為陽性反應(見中插彩版圖1)。

2.3 病毒的分離鑒定 接種病毒的雞胚多在48 h后死亡，死亡胚體全身出血，頭部、頸部、肢端出血嚴重，收集的尿囊液清澈。盲傳3代后檢測HA效價均為28左右，HI檢測5株分離株對NDV陽性血清呈陽性，對AI(H5、H9)和EDS76標準陽性血清呈陰性，確定分離株為NDV。

2.4 病毒致病指數測定結果 由表2可見，RS1、RS2、HY3三株的MDT值均低于60 h，ICPI值均大于1.5，根據標準判定為NDV強毒株。LZ4、PL5兩株的MDT值在試驗稀釋倍數下未能測出結果，ICPI值小于0.5，判定為低等毒力毒株。

表2 病毒致病指數測定結果

2.5 NDV分離株F基因的分子特性分析

2.5.1 各毒株F基因的克隆測序及基因型分析 RS1、RS2、HY3三株分離株的蛋白裂解位點為112R-R-Q-K-R-F117，第101位氨基酸為K，第121位氨基酸為V，為基因Ⅶ型強毒株。LZ4、HY5分離株的蛋白裂解位點為112G-R-Q-G-R-L117，屬于基因Ⅱ型弱毒株[4-5]。

2.5.2 F基因核苷酸及其編碼氨基酸序列的同源性分析 RS1、RS2、HY3三株Ⅶ型NDV間同源性為98%以上，與國內外標準毒株的核苷酸同源性為83.2%～91.7%，與Ⅶ型標準株Taiwan95的核苷酸同源性約為91.0%。LZ4、PL5兩株Ⅱ型NDV分離株間的核苷酸同源性為98.6%，與國內外標準毒株的核苷酸同源性為83.2%～99.7%，氨基酸同源性為89.3%～100.0%。與疫苗株LaSota、Clone30的核苷酸同源性約為99%。

2.5.3 F基因系統進化樹的構建 分離株RS1、RS2、HY3與國內流行基因Ⅶd型毒株(KJ184581、EF57579733、JN618348)屬同一分支。LZ4、PL5與標準株LaSota、Clone30處于同一分支，為基因Ⅱ型。

3 討論

3.1 現場快速檢測NDV方法的應用 ND作為禽類高發的急性烈性傳染病，對NDV的高效快速檢測對疾病的診斷具有重要意義。本研究應用的MagMAXTM-96 Viral RNA Isolation Kit采用磁珠凈化技術，經現行國家獸醫服務實驗室(NVSL)評價能完美應用于NDV檢測，克服了病毒滴度低、待處理樣本量大且復雜、操作環境要求高的困難[6]。運用的AgPath-IDTMOne-Step RT-PCR Kit可一步性的進行反轉錄、PCR反應，該試劑可以完美適用于便攜式real-time RT-PCR儀T-COR4，只需配備電池式便攜離心機即可完成RT-PCR反應，可同時進行4個樣品的檢測。上述檢測方法包括制備樣品、提取病毒核酸、RT-PCR反應可在2 h內完成，能夠完美適用于NDV的野外現場檢測，檢測結果直觀有說服力，給NDV的快速鑒別診斷帶來極大的便利。

圖2 NDV F基因系統進化樹注：方框內為試驗分離株，其余均為參考株

3.2 ND的發病流行特點 ND作為養禽業高發的急性傳染病，NDV一直處于不斷進化中，給ND的防治帶來了新的考驗[7]。本研究檢測的發病雞群ND抗體水平均勻度不一，在4.4～6.0之間，有的雞群達到5個滴度的跨度，調查發現該雞場飼養管理粗放，生物安全措施不到位，不能做到免疫后的抗體監測，疫苗免疫質量低，增加了病原入侵的風險，導致NDV強毒感染。有的雞群HI抗體效價達到6.0也能檢測到NDV，這與宋敏訓[8]的報道一致。田夫林[9]調查證實，高HI抗體并不能抵抗ND強毒入侵，抗體滴度為6作為NDV感染臨界值的評估方法存在不足，HI抗體效價的高低不能完全代表雞群的免疫狀況。

流行毒株與免疫疫苗株的基因型差異，也是高免雞群感染ND的原因。持續的ND監測發現，我國雞群主要流行基因型為Ⅶ型，疫苗免疫中主要采用的不同毒力的弱毒疫苗和滅活疫苗，均為經典基因Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型[9]。流行株與疫苗株在抗原性上存在較大差異，常規疫苗不能對基因Ⅶ型等流行毒株提供良好的保護作用。2014年揚州大學利用反向遺傳操作技術研制出與國內流行的基因Ⅶ型NDV抗原性和基因型匹配性良好的一類新獸藥—重組ND滅活疫苗(A-Ⅶ株)，為我國ND的防控和養禽業的健康發展提供了堅實的保障[10]。

4 結論

山東省發病地區肉雞ND的發生呈非典型癥狀、多種基因型并存、免疫帶毒等特點。本研究通過現場制備檢測樣品、提取病毒核酸，經便攜式real-time RT-PCR儀T-COR4檢測分析，可在2 h內對ND進行確診。共分離到5株NDV，其中3株(RS1、RS2、HY3)為基因Ⅶ型強毒株，與當前山東、江蘇等地流行的Ⅶd型ND分離株屬同一分支，兩株(LZ4、HY5)屬于基因Ⅱ型弱毒株，與標準疫苗株LaSota的親緣關系較近。

[1] 于淼.山東雞新城疫病毒分離鑒定與Ⅱ+Ⅶ基因型滅活疫苗研究[D].南京：南京農業大學, 2009.

[2] 郝東敏.山東地區Ⅰ群禽腺病毒的分離鑒定及多價油乳劑滅活疫苗的研制[D].泰安：山東農業大學,2014.

[3] 孫旭輝.我國新城疫分子流行病學及不同基因型滅活疫苗免疫保護力初步研究[D].南京：南京農業大學, 2006.

[4] 馬由詔.長春地區新城疫病毒地方株的分離、鑒定及F基因的遺傳進化分析，吉林農業大學， 2014.

[5] 程相朝.新城疫病毒地方株分子流行病學調查及其疫病控制，[D].南京：南京農業大學, 2003.

[6] LIu L, Benyeda Z, Zohari S,etal. Assessment of preparation of samples under the field conditions and a portable real-time RT-PCR assay for the rapid on-site detection of Newcastle disease virus[J].TransboundaryandEmergingDiseases, 2016(No.2): e245-e250.

[7] 劉建忠.雞新城疫流行新特點及防治措施.中國畜牧獸醫文摘[J]. 2016, 01: 160.

[8] 宋敏訓,譚文君,王莉莉,等.雞新城疫不同毒株間的交叉保護性研究.山東家禽,2001,04: 6-7.

[9] 孫旭輝.我國新城疫分子流行病學及不同基因型滅活疫苗免疫保護力初步研究[D].南京：南京農業大學, 2006.

[10] 劉秀梵,胡順林,胡增壘,等.新城疫重組病毒滅活疫苗(A-VII株)的研制和臨床試驗.北京：中國畜牧獸醫學會禽病學分會, 2012: 2.

Real-Time RT-PCR Assay for the Rapid On-Site Detection and Genetic Variation Characteristics Analysis of Newcastle Disease Virus

ZHOU Xiao-tong1， CHU Huan-huan1， SHAN Hu1， XU Yan2， YU Hai-long3， WANG Shu-bai1

(1.College of Animal Science and Technology, Qingdao Agricultural University, Qingdao 266109， China；2.Teaching Administration Office of Qingdao Agricultural University, Qingdao 266109， China；3.Qingdao Yiyihe Agro-pastoral Technology Co.,Ltd, Qingdao 266109， China)

Viral nucleic acids of suspected Newcastle disease virus(NDV) infection were extracted in broiler farms. 5 Newcastle disease virus (NDV) strains were detected with the real-time RT-PCR method in the portable T-COR4 platform within 2 h, named with RS1, RS2, HY3, LZ4 and PL5 respectively. Then the confirmed positive samples were detected with virus proliferation, HA/HI test, MDT, EID50, ICPI indexes determination, and F gene genetic variation analysis. The test results showed that RS1, RS2 and HY3 isolates were genotype Ⅶd velogenic NDV, and LZ4 and HY5 were genotype Ⅱ lentogenic NDV.

NDV ; separation identification ; F gene ; genetic variation ; virulence

WANG Shu-bai

2016-07-29

山東省自主創新及成果轉化專項(2014ZZCX07105)；山東省現代農業產業技術體系家禽產業創新團隊建設項目(SDAIT-11-14)

周小桐(1992-)，男，碩士生，主要從事動物營養與飼料科學研究， E-mail:895556858@qq.com

初歡歡(1991-)，女，碩士生，研究方向為預防獸醫學，E-mail:15275210115@126.com

王述柏，E-mail：wshubai@163.com

S855.3

A

0529-6005(2017)05-0030-04

注：初歡歡與周小桐對本文具有同等貢獻