禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥病毒蛋白酶PR酵母雙雜交誘餌載體的構(gòu)建及鑒定

姜莉莉 ， 蔣培紅， 溫海燕 ， 樊兆斌

(1.菏澤學(xué)院藥物科學(xué)與技術(shù)系 ， 山東菏澤274015 ； 2.錦州醫(yī)科大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院 ， 遼寧錦州121001)

禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥病毒蛋白酶PR酵母雙雜交誘餌載體的構(gòu)建及鑒定

姜莉莉1，2， 蔣培紅1， 溫海燕1， 樊兆斌1，2

(1.菏澤學(xué)院藥物科學(xué)與技術(shù)系 ， 山東菏澤274015 ； 2.錦州醫(yī)科大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院 ， 遼寧錦州121001)

為研究禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥病毒(Reticuloendotheliosisvirus, REV)蛋白酶PR與宿主細(xì)胞的相互作用，將REV PR基因克隆入酵母雙雜交誘餌載體pGBKT7，構(gòu)建誘餌載體pGBK-PR，經(jīng)菌落PCR 、酶切鑒定及測(cè)序驗(yàn)證正確后，將重組誘餌質(zhì)粒轉(zhuǎn)化酵母菌株Y2H Gold感受態(tài)，進(jìn)行重組誘餌載體在酵母中的自激活活性和毒性檢測(cè)。結(jié)果表明，成功構(gòu)建誘餌載體pGBK-PR，此載體在酵母細(xì)胞Y2H Gold中無自激活活性和毒性。研究結(jié)果為進(jìn)一步利用酵母雙雜交技術(shù)篩選與REV 蛋白酶PR互作的宿主蛋白奠定了基礎(chǔ)。

禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥病毒 ； PR ； 酵母雙雜交 ； 誘餌載體

禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥是由禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥病毒(ReticuloendotheliosisVirus, REV)引起的一種重要的腫瘤性免疫抑制病。REV感染能引起慢性腫瘤、矮小綜合征[1]。還可引起免疫器官的萎縮，引發(fā)重劇的免疫抑制，造成免疫失敗或繼發(fā)其他傳染病[2]。近年來，REV 已在全球范圍內(nèi)流行[3]，在我國(guó)的流行愈發(fā)嚴(yán)重，雞群中REV的血清抗體陽性率逐漸增高，存在普遍的混合感染[4-5]，對(duì)養(yǎng)禽業(yè)危害嚴(yán)重。

REV屬反轉(zhuǎn)錄病毒科，哺乳動(dòng)物C型反轉(zhuǎn)錄病毒亞科，γ逆轉(zhuǎn)錄病毒屬，為雙倍體單股正鏈 RNA 病毒[6]。REV基因組有兩個(gè)開放閱讀框，有3個(gè)主要編碼基因：衣殼蛋白基因(gag)、聚合酶基因(pol)和囊膜蛋白基因(env)，主要編碼gag、pol和env三種結(jié)構(gòu)蛋白[7]。pol基因主要編碼REV的功能性蛋白，包括反轉(zhuǎn)錄酶(RT)及其衍生的蛋白酶(PR)和整合酶(IN)等。PR 的功能是水解前體蛋白以使之形成成熟蛋白。目前，對(duì)REV PR研究較少，尚未見該蛋白與宿主細(xì)胞之間相互作用的研究報(bào)道。為更好理解 PR的生物學(xué)功能，本試驗(yàn)構(gòu)建了REV PR酵母雙雜交誘餌載體，檢測(cè)其是否在酵母細(xì)胞中表達(dá)，為利用酵母雙雜交技術(shù)進(jìn)一步開展該蛋白與其他相關(guān)蛋白的相互作用研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株、質(zhì)粒、主要試劑及引物 pT-Rpol 質(zhì)粒由藥物科學(xué)技術(shù)學(xué)院預(yù)防獸醫(yī)學(xué)研究室構(gòu)建和保存；載體質(zhì)粒pGBKT7、pGADT7，酵母菌株Y2H、X-α-Gal、Aureobasidin Minimal SD Base、Minimal SD Agar Base、Yeastmaker Carrier DNA、酵母共轉(zhuǎn)化試劑盒等，均購自 Clontech公司；CEF cDNA酵母表達(dá)文庫由本研究室構(gòu)建；DDO(SD/-Leu/-Trp)、QDO(SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp)、QDO/X/A(SD/-Ade/-His/-Leu/Trp/X-α-Gal/Aureobasidin A)培養(yǎng)基按常規(guī)方法制備；EcoRI、BamHI、T4 DNA Ligase、DNA 聚合酶等，均購自寶生物工程(大連)有限公司；PR基因擴(kuò)增引物由上海生工基因股份有限公司合成(見表1)。

表1 PR基因擴(kuò)增引物

1.2 PR基因的擴(kuò)增 根據(jù)pGBKT7載體的多克隆位點(diǎn)，設(shè)計(jì)擴(kuò)增REV PR的引物RPRU/RPRL(上下游分別引入EcoRI和BamHI、酶切位點(diǎn))，以pT-Rpol為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系：5×PrimeSTAR Buffer (Mg2+Plus)10 μL，dNTP Mixture (each 2.5 mmol/L) 4 μL，上、下游引物各1 μL，模板1 μL，PrimeSTAR?HS DNA Polymerase 0.5 μL，加ddH2O至50 μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。PCR反應(yīng)結(jié)束后在反應(yīng)體系加入rTaq0.5 μL，72 ℃延伸10 min，使PCR產(chǎn)物末端加A，并進(jìn)行膠回收。

1.3 PR誘餌載體的構(gòu)建 用EcoRI、BamHI對(duì)回收純化的PR PCR產(chǎn)物和載體pGBKT7分別進(jìn)行雙酶切處理。酶切體系：10×H Buffer 5 μL，PR PCR產(chǎn)物10 μL(pGBKT7 5 μL)，EcoRI、SalI各2.5 μL，加ddH2O至50 μL；37 ℃水浴2 h。酶切產(chǎn)物回收后進(jìn)行連接反應(yīng)，連接體系：T4 DNA連接酶1 μL，10×T4 Buffer 1 μL，PR回收產(chǎn)物6 μL，pGBKT7回收產(chǎn)物2 μL，16 ℃連接過夜。轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，提取質(zhì)粒。重組質(zhì)粒經(jīng)雙酶切鑒定正確后，送華大基因生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行測(cè)序，將正確插入RPR基因的誘餌載體命名為pGBK-PR。

1.4 誘餌載體自激活活性和毒性檢測(cè) 復(fù)蘇酵母菌Y2H Gold，按照YeastmakerTMYeast Transformation System 2(Clontech)操作規(guī)程，利用醋酸鋰法，制備Y2H Gold酵母感受態(tài)細(xì)胞。分別將誘餌載體pGBK-PR與空捕獲載體pGADT7轉(zhuǎn)化Y2H酵母感受態(tài)細(xì)胞。將待轉(zhuǎn)化質(zhì)粒1 μL(100 ng/μL)、Yeastmaker Carrier DNA 5 μL(10 μg/μL)、新鮮制備的50% PEG/LiAc 500 μL和50 μL酵母感受態(tài)細(xì)胞加入1.5 mL無菌EP管，混勻。30 ℃水浴30 min，每隔10 min輕振混勻；加入20 μL DMSO，混勻，42 ℃水浴15 min，每隔5 min輕振混勻；12 000 r/min離心10 s，棄上清，沉淀用100 μL 0.9%NaCl重懸，取100 μL重懸菌液涂于SD/-Trp(SDO) 固體培養(yǎng)板上，30 ℃倒置培養(yǎng)3～5 d，觀察2 個(gè)平板酵母菌菌落生長(zhǎng)的大小、數(shù)量、形態(tài)、顏色等有無差異，進(jìn)行誘餌質(zhì)粒pGBK-PR的毒性檢測(cè)。將上述已轉(zhuǎn)化好的pGBK-PR菌液各100 μL，分別涂于SD/-Trp(SDO)、SD/-Trp /X-α-Gal(SDO/X) 和SD/-Trp /X-α-Gal /AbA (SDO/X/A) 固體培養(yǎng)板上， 30 ℃倒置培養(yǎng)3～5 d，觀察各個(gè)平板酵母菌菌落生長(zhǎng)的大小、數(shù)量、形態(tài)、顏色，進(jìn)行誘餌質(zhì)粒pGBK-PR的自激活活性檢測(cè)。同時(shí)設(shè)陽性對(duì)照組：pGBKT7-53 / pGADT7-T共轉(zhuǎn)化組，和陰性對(duì)照組：pGBKT7-Lam/pGADT7-T共轉(zhuǎn)化組。

2 結(jié)果

2.1 PR基因擴(kuò)增及序列分析 PCR反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，在接近750 bp處可見清晰條帶，大小與預(yù)期相符(圖1)。測(cè)序結(jié)果顯示，擴(kuò)增的PR基因?yàn)?48 bp。

2.2 誘餌載體的構(gòu)建 重組誘餌質(zhì)粒pGBK-PR轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)DH5α，經(jīng)EcoRI、BamHI雙酶切，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，在7.3 kb和700 bp附近，均出現(xiàn)目的條帶(圖2)。與空載體片段7.3 kb和預(yù)期插入片段648 bp大小相近，將重組質(zhì)粒送華大基因生物工程技術(shù)有限公司測(cè)序，比對(duì)結(jié)果顯示插入片段正確，表明重組質(zhì)粒pGBK-PR構(gòu)建正確。

2.3 誘餌載體自激活作用和毒性檢測(cè) 圖3為pGBK-PR誘餌載體和pGBKT7空載體在SDO、SDO/X、SDO/X/A三種平板上的生長(zhǎng)狀況以及陰陽性對(duì)照生長(zhǎng)情況。由圖3可以看出，陽性對(duì)照組(pGADT7-53 / pGADT7-T共轉(zhuǎn)組)在SDO/X/A平板上菌落顏色變藍(lán)；陰性對(duì)照組(pGADT7-Lam / pGADT7-T共轉(zhuǎn)組)在SDO/X/A平板上無菌落生長(zhǎng)，說明陰陽性對(duì)照組成立。pGBKT7 空載體轉(zhuǎn)化菌在SDO/X平板上生長(zhǎng)正常，菌落顏色為白色，在SDO/X/A平板上無菌落生長(zhǎng)。pGBK-PR轉(zhuǎn)化菌在SDO/X平板上可見與pGBKT7空載體轉(zhuǎn)化菌類似的白色菌落，酵母生長(zhǎng)狀況良好，菌落數(shù)量和大小與pGBKT7空載體轉(zhuǎn)化相比無明顯差異，說明構(gòu)建的誘餌載體pGBK-PR對(duì)酵母菌株無毒性作用。pGBK-PR轉(zhuǎn)化菌在SDO和SDO/X平板上生長(zhǎng)正常，菌落顏色為白色，在SDO/X/A平板上無菌落生長(zhǎng)，說明誘餌載體pGBK-PR無自激活活性。因此，構(gòu)建的誘餌載體pGBK-PR可以用于下一步文庫的篩選試驗(yàn)。

圖1 PR基因擴(kuò)增

圖2 誘餌載體pGBK-PR雙酶切鑒定

圖3 pGBK-PR誘餌質(zhì)粒自激活活性與毒性檢測(cè)

3 討論

酵母雙雜交技術(shù)是一種經(jīng)典的蛋白互作研究技術(shù)，外源蛋白能在真核酵母細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，并通過不同的營(yíng)養(yǎng)條件篩選相互作用的蛋白。作為研究病毒與宿主相互作用的常用方法之一，酵母雙雜交技術(shù)既可檢測(cè)已知蛋白之間的相互作用，又能篩選與已知蛋白相互作用的未知蛋白，可用于蛋白文庫中篩選與已知蛋白相互作用的蛋白[8-9]。且該系統(tǒng)可捕捉活細(xì)胞內(nèi)蛋白之間微弱的、瞬時(shí)的作用信號(hào)，適用于高通量篩選相互作用蛋白[10]。

REV病毒粒子有3種酶蛋白：反轉(zhuǎn)錄酶(RT)、蛋白酶(PR)和整合酶(IN)。REV的PR來自Gag-Pro蛋白前體，類似于其他逆轉(zhuǎn)錄病毒，REV編碼的蛋白酶(PR)，能專一地切割病毒的多聚蛋白，使之形成成熟蛋白和復(fù)制所需要的酶，在病毒的復(fù)制過程中發(fā)揮重要作用[11]。此外，逆轉(zhuǎn)錄病毒PR也可以催化包括細(xì)胞骨架蛋白和細(xì)胞支架相關(guān)蛋白在內(nèi)的宿主細(xì)胞蛋白的水解作用[12]。

PR與逆轉(zhuǎn)錄病毒的生命周期和感染的過程密切相關(guān)，本試驗(yàn)擴(kuò)增REV 蛋白酶PR基因，將其定向克隆到酵母雙雜交誘餌pGBKT7載體上，成功構(gòu)建pGBK-PR酵母誘餌載體，以期通過酵母雙雜交技術(shù)進(jìn)一步研究REV PR蛋白功能。將構(gòu)建的誘餌載體pGBK-PR轉(zhuǎn)化Y2H Gold 酵母感受態(tài)細(xì)胞，涂布SDO和SDO/X培養(yǎng)基，發(fā)現(xiàn)pGBK-PR轉(zhuǎn)化菌在兩種培養(yǎng)基上長(zhǎng)出白色菌落，生長(zhǎng)狀況良好，與pGBKT7空載體轉(zhuǎn)化組相比，菌落數(shù)量、大小無明顯差異，說明構(gòu)建的誘餌載體pGBK-PR對(duì)酵母菌株無毒性作用。且pGBK-PR轉(zhuǎn)化菌在SDO/X/A培養(yǎng)基上無菌落生長(zhǎng)，說明誘餌載體pGBK-PR無自激活活性。本試驗(yàn)構(gòu)建的誘餌載體pGBK-PR可應(yīng)用于酵母雙雜交篩選，為進(jìn)一步研究與REV蛋白酶PR相互作用的宿主蛋白奠定了基礎(chǔ)。

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Construction and Identification of the Bait Vector ofReticuloendotheliosisvirusPR using Yeast Two-hybrid System

JIANG Li-li1,2， JIANG Pei-hong1， WEN Hai-yan1， FAN Zhao-bin1,2

(1.Drug Bioscience and Technology Department, Heze University, Heze 274015, China; 2.Institute of animal husbandry veterinary, Jinzhou Medical University, Jinzhou 121001, China)

To investigate the interaction betweenReticuloendotheliosisvirus(REV) PR and the host cells, PR cDNA was amplified and subcloned into the bait vector pGBKT7 of yeast two-hybrid system, and the recombinant bait vector pGBK-PR was constructed. After verifying by PCR amplification, enzymatic detection and sequencing validation, the yeast bait plasmid was transformed into Yeast strain Y2H Gold competent cells. Then the self-activation and toxicity of the bait vector were tested using the Matchmaker Gold Yeast Two-Hybrid System. Results showed that the bait vector pGBK-PR was successfully constructed with no self-activation and toxicity to Y2H Gold yeast cells. This study laid the foundation for further researches on the effect and mechanism of the interaction betweenREVPR and its host cells.

Reticuloendotheliosisvirus; PR ; yeast two-hybrid ; bait vector

FAN Zhao-bin

2016-07-19

家禽產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系北京市創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目(BAIC04-2017)

趙世穎(1988-)，女，工程師，碩士，從事實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)管理工作，E-mail：syzhao@genetics.ac.cn

張國(guó)中，E-mail：zhanggz@cau.edu.cn

S854.43

A

0529-6005(2017)05-0027-03