1株野禽源H5N6亞型禽流感病毒的分離鑒定與遺傳進化分析

周佩嬌 ， 邢 利 ， 賈偉新 ， 廖 明

(1.華南農業大學獸醫學院人獸共患病防控制劑國家地方聯合工程實驗室農業部人畜共患病重點實驗室農業部獸用疫苗創制重點實驗室廣東省動物源性人獸共患病預防與控制重點實驗室 ， 廣東廣州510640 ；2. 廣州市南沙區動物防疫監督所 ， 廣東廣州511458)

1株野禽源H5N6亞型禽流感病毒的分離鑒定與遺傳進化分析

周佩嬌1,2， 邢 利1， 賈偉新1， 廖 明1

(1.華南農業大學獸醫學院人獸共患病防控制劑國家地方聯合工程實驗室農業部人畜共患病重點實驗室農業部獸用疫苗創制重點實驗室廣東省動物源性人獸共患病預防與控制重點實驗室 ， 廣東廣州510640 ；2. 廣州市南沙區動物防疫監督所 ， 廣東廣州511458)

為了解野生鳥類禽流感病毒的流行情況，對2015-2016年廣州地區野生鳥類進行流感監測，分離得到1株H5N6流感病毒。對病毒分離株進行基因克隆、測序和序列分析，結果顯示，HA基因屬于Clade2.3.4.4，HA蛋白的裂解位點處具有多個連續堿性氨基酸，具備高致病性禽流感病毒的典型分子特征。各基因片段分別與H5N6亞型的貓和家禽等的不同宿主病毒株相應片段具有較高相似性，揭示了野鳥作為流感病毒孵化器的可能性，提示需加強對野生鳥類禽流感監控。

野生鳥類 ； 禽流感病毒 ； 基因克隆 ； 進化分析

禽流感(Avian Influenza)是由A型流感病毒引起的一種禽類(家禽和野禽)的感染和/或疾病綜合征。高致病性AIV被世界動物衛生組織(OIE)定為A類傳染病，我國也將其列為一類動物疫病。高致病性禽流感臨床主要表現為高發病率、高死亡率、產蛋量急劇下降等，同時可引起人感染發病，甚至死亡，對養禽業和人類健康構成嚴重威脅。近年來，野生鳥類發生禽流感的事例不斷增多。2016年8月美國阿拉斯加州國家野生動物保護區的野生綠頭鴨確診出現H5N2亞型高致病性禽流感。2016年10月28日韓國在天安市所在的鳳岡川采集的野生鳥類糞便中檢測出H5N6型高致病性禽流感病毒。2016年11月2日，阿爾及利亞中南部的蓋爾達耶省一自然公園內發生1起野禽H7N1亞型高致病性禽流感疫情。2016年10月以來，德國、法國等歐洲多個國家暴發了H5N8亞型高致病性禽流感疫情并迅速傳播到亞洲和大洋洲，感染的禽類包括野生鳥類和家禽，流行病學調查發現，部分國家的家禽疫情可能是由野禽傳播病毒引起的，據統計，野禽疫情約占全部疫情的四分之三[1]。我國首次出現野生鳥類感染禽流感的報道是2005年5月發生在青海省剛察縣泉吉鄉年乃索麻村的青海湖國家級自然保護區斑頭雁非正常死亡，由國家農業疫病防治部門確診為H5N1亞型禽流感病毒，造成死亡候鳥6 000多只[2]。2015年1月15日，黃河濕地三門峽庫區陸續出現大天鵝、紅頭潛鴨、野鴨等野鳥死亡，經確診為H5N1亞型高致病性禽流感疫情。2016年研究人員在西藏、青海地區的野鳥中也分離到了H7N2禽流感病毒[3]。野生鳥類是禽流感病毒的天然宿主，未實施計劃免疫，特別是具有長距離、大范圍的遷徙特性，不同來源背景的禽流感病毒在遷徙棲息地與聚集地交匯，容易引發禽流感疫情，造成野生鳥類的發病和死亡，同時還可能將自身攜帶的禽流感病毒傳染給家禽，造成家禽的發病和死亡，甚至傳染給人類，引發公共衛生安全事件。對野生鳥類進行禽流感監測，研究其發生發展規律，已經變得十分緊迫。

本研究對2015-2016年廣州南部地區采集的野生鳥類糞便或咽肛拭子，進行病毒分離鑒定，得到1株H5N6亞型禽流感病毒，并進行基因克隆、測序和遺傳序列分析，研究基因內部位點變化，為禽流感的防控提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 總RNA抽提試劑盒，購自上海飛捷生物技術有限公司；瓊脂糖凝膠回收試劑盒，購自Magen公司；反轉錄酶及其Buffer、dNTP、RNA酶抑制劑、ExTaq聚合酶及其Buffer、DL-1 000 Marker、DL-2 000 Marker，購自TaKaRa公司；隨機引物、反轉錄引物、PCR擴增引物，購自廣州艾基生物有限公司。

1.2 樣品采集 采集2015年10月至2016年10月廣州南部地區野鳥樣品186份，采集的樣品包括糞便、咽及泄殖腔拭子。主要是采集在灘涂或樹葉、灌木上野生鳥類的糞便，同時對救護的野生鳥類采集咽拭子和泄殖腔拭子。將采集到的樣品裝入含有PBS緩沖液的采樣管中，低溫運輸，-20 ℃保存備用。

1.3 病毒分離 將裝有樣品的采樣管震蕩后，10 000 r/min離心3 min，取上清液接種3枚9～11日齡SPF雞胚。每隔12 h照胚，棄去24 h內死亡的雞胚，收集48 h后的胚胎尿囊液，進行血凝試驗(HA)和血凝抑制試驗(HI)，判斷尿囊液是否存在病毒并進行收集，進行RT-PCR檢測。

1.4 病毒RNA的抽提及反轉錄 將采集到的拭子樣品充分混勻，10 000 r/min離心3 min，取上清液進行RNA提取。RNA的提取按照上海飛捷生物技術有限公司提取的總RNA極速抽提試劑盒說明書操作。

1.5 基因克隆及測序 利用各基因特異性引物進行PCR擴增，擴增產物按照Megen試劑盒說明書進行目的核酸的純化與回收，純化產物克隆到pMD18-T載體上,陽性克隆送廣州艾基生物技術有限公司進行測序。

1.6 遺傳序列分析 將基因測序結果用EditSeq軟件進行序列拼接，得到完整的基因片段。用NCBI Blast進行序列比對，用MEGA6.06軟件進行進化樹分析。

1.7 關鍵位點分析 利用MEGA6.06軟件進行氨基酸序列突變位點分析。用NetNGlyc 1.0 Server分析序列糖基化位點。

2 結果

2.1 病毒分離結果 2015年10月至2016年10月共采集廣州南部地區野鳥樣品186份，其中糞便182份，咽、泄殖腔拭子4份。對樣品進行病毒培養后，共分離到1株H5N6亞型禽流感病毒，命名為A/Wildfowl/Guangdong/GZ882/2015(H5N6)(簡稱15 882株)。

2.2 相似性分析 將15882分離株進行全基因組測序，基因序列經NCBI BLAST 分析，結果顯示，HA基因開放閱讀框長度為1 704 bp，與2015年廣東分離到的貓流感毒株 A/feline/Guangdong/1/2015(H5N6)相似性達99%；NA基因開放閱讀長度為1 380 bp，與2015年湖北分離到的鴨流感毒株A/duck/Hubei/XG18/2015(H5N6) 相似性達99%；M基因開放閱讀框長度759 bp，與2013年深圳分離到的雞流感毒株A/chicken/Shenzhen/1061/2013(H5N6) 相似性達99%；NS基因開放閱讀框長度為675 bp，與2015年廣東分離到的毛腿沙雞的流感病毒株A/Syrrhaptes paradoxus/Guangdong/ZH283/2015(H5N6)相似性達99%；PA基因開放閱讀框長度為2 151 bp，與2015年武漢分離到的斑鳩流感毒株A/turtledove/Wuhan/HKBJ27/2015(H5N6)相似性達99%；PB1基因開放閱讀框長度為2 274 bp，與2015年廣東流感分離株A/environment/Guangdong/GZ670/2015(H5N6)相似性達99%；PB2基因開放閱讀框長度為2 280 bp，與2014年的越南分離到的鴨流感病毒株A/duck/Vietnam/LBM760/2014(H5N6)相似性達99%；NP基因開放閱讀框長度為1 497 bp，與2015年A/environment/Guangdong/GZ693/2015(H5N6)相似性達99%。

2.3 遺傳序列分析 15882分離株的HA、NA基因核酸序列進化分析結果表明， HA基因屬于Clade2.3.4.4(圖1)，NA基因屬于歐亞分支(圖2)。

圖1 HA基因進化樹分析

2.4 氨基酸序列分析與關鍵位點分析 HA氨基酸序列分析結果表明，HA基因編碼567個氨基酸，具有7個潛在糖基化位點(表1)。HA蛋白的裂解位點處具有多個連續堿性氨基酸PLRERRRKRGLF，符合高致病性禽流感病毒典型分子特征。HA受體結合位點存在S137A、K193N突變。NA蛋白相應位點沒有改變。PB2蛋白的E627K和D701E位點都沒有發生改變。

圖2 NA基因進化樹分析

表1 HA相關位點分析

3 討論

根據基因序列遺傳進化分析結果，本研究中的H5N6亞型禽流感分離株屬于近年流行的Clade2.3.4.4，與哺乳動物貓的流感病毒基因片段高度相似。NA基因、PB2基因、M基因與家禽流感病毒相應片段高度相似，NS基因、PA基因與野鳥流感病毒基因片段高度同源，這說明本研究中的15882分離株可能包含了哺乳動物、家禽和野鳥不同宿主來源的基因片段，不同宿主來源的流感病毒基因片段在野鳥體內進行組合包裝，隨著這種重組頻率的提升，不斷交流變異出具有高致病性和傳播性病毒的可能性也大大增強。

連接在天冬酰胺(Asn,N)的蛋白糖基化是一種廣泛存在于生物體內的共價修飾方式。病毒通過賦予其表面糖蛋白與宿主相同的糖鏈結構特征，可以逃避宿主免疫系統的監視。根據氨基酸序列分析結果，本研究中的HA蛋白具有7個潛在的糖基化位點，有助于病毒更加輕松的躲避機體的免疫攻擊。流感病毒主要通過HA蛋白識別宿主細胞唾液酸(SA) 受體而感染宿主，禽類和人類分別表達SA α-2、3 半乳糖受體和SA α-2、6半乳糖受體為主。HA受體結合位點的結構決定著病毒結合哪種唾液酸受體，從而影響感染宿主的范圍，改變受體結合特異性可能會導致宿主范圍的改變和病毒的傳播[4]。本研究中HA蛋白受體結合位點發生S137A、K193N突變，增加了對人的SAа-2，6半乳糖受體的辨識度，從而增強其對人的感染的可能性[5]。在HA 的第222～224 位存在保守氨基酸序列QRG，表明禽樣受體結合位點沒有實質性的改變[6]。

我國在2012年以前，禽流感流行株以H5N1亞型禽流感為主，自2014年開始轉變為以H5N6亞型禽流感病毒為主[7]。本研究在廣州南部野生鳥類中也分離到該亞型病毒株，可見H5N6亞型流感病毒擴散之廣，需要我們提高警惕，加強防控。廣州地處伶仃洋之濱、珠江出?？?，擁有大片紅樹林、灘涂和海岸線，形成了良好的鳥類、紅樹林及濕地生態系統。濕地內的土壤主要由海灣沉積物形成，由于良好的生態環境和地理位置，各種魚蝦、水草也在這片灘涂里自然生長，為過冬的候鳥提供了安全的棲息地和豐富的食物，是野生鳥類的重要的遷徙中轉地和棲息地，被喻為“候鳥天堂”[8]。2010年以來，發現的鳥類就有149種，其中冬候鳥或旅鳥77種，留鳥63種，夏候鳥9種，物種多樣性和科屬多樣性較為豐富，主要有黑翅長腳鷸，蒼鷺、斑嘴鴨、白琵鷺等[9]。在歷時近一年的采樣監測中，發現秋冬季野生鳥類較多，樣品密集度大，采集較易，夏季鳥類減少，采樣時間花費較多，這主要跟秋冬季候鳥南遷入廣州有關。世界上8條候鳥遷徙路線，有3條經過我國，其中西太平洋線，主要是從阿拉斯加等到西太平洋群島，經過我國東部沿海省份。其中廣州南部紅樹林濕地片區是候鳥重要的遷徙中轉地和棲息地，隨著近年來當地政府生態環境建設和保護力度的加強，停留鳥類種類和數量普遍增多，因此，對濕地候鳥的禽流感監測十分迫切，相應的研究需要積極開展。

4 結論

本研究從野生鳥類樣品中分離到1株H5N6亞型禽流感病毒株,屬于近年流行的Clade2.3.4.4，各基因片段分別與哺乳動物、野禽和家禽相應片段相似度較高。同時，該分離株的氨基酸序列分析結果顯示，病毒株具有高致病性禽流感病毒典型分子特征，HA存在7個潛在糖基化位點，受體結合位點也發生了改變。建議加強對野生鳥類的流感監控，將其納入到禽流感防控的常規監測中，建立長效防控機制。

[1] 蔣文明，宋建德，黃保續.近期全球H5N8亞型禽流感疫情分析[J].中國動物檢疫，2017,34(1):1-7.

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[6] Gambaryan A S,Tuzikov A B,Bovin N V,etal.Differences between influenza virus receptors on target cells of duck and chicken and receptor specificity of the 1997 H5N1 chicken and human influenza viruses from Hong Kong[J].Avian Dis,2003,47(3): 1154-1160．

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[8] 常宏，廖寶文，粟娟，等.廣州南沙紅樹林濕地鳥類群落多樣性(2005—2010)[J].應用與環境生物學報，2012，18(1):30-34.

[9] 常弘，廖寶文.廣州市南沙濕地公園的鳥類多樣性與禽流感監控[J].濕地科學與管理，2009，5(1):64-65.

Isolation, identification and phylogenetic analysis of one H5N6 avian influenza virus from wide birds

ZHOU Pei-jiao1, 2, XING Li1, JIA Wei-xin1， LIAO Ming1

(1.College of Veterinary Medicine, South of China Agricultural University, National and Regional Joint Engineering Laboratory for Medicament of Zoonosis Prevention and Control, Key Laboratory of Zoonoses, Ministry of Agriculture, Key Laboratory of Animal Vaccine Development,Ministry of Agriculture, Key Laboratory of Zoonoses Control and Prevention of Guangdong,Guangzhou 510640, China; 2.Servicing department of pasturage, Nansha, Guangzhou 511458, China)

In order to study the epidemiology of avian influenza in wild birds, one H5N6 subtype of avian influenza virus was isolated from wild birds in Guangzhou during influenza virus surveillance from 2015 to 2016. The gene segments were cloned, sequenced and analyzed. The results showed that the HA gene of the isolate belonged to clade 2.3.4.4 lineage and contained multiple basic amino acids at the cleavage site , which was characteristic of highly pathogenic AIV. The other gene segments of the strain had high homology with the strains of feline and poultry, implicating that the wild birds were the possible incubator of influenza virus.Our findings suggest that the influenza virus surveillance in wild birds should be strengthened.

Wild birds ; Avian influenza virus ; Gene clone ; Phylogenetic analysis

LIAO Ming

2017-02-20

科技基礎性工作專項(2012FY111000)；現代農業產業技術體系建設專項資金(CARS-42-G09)；農業部動物疫情監測與防治項目[農醫發(2016)11號]；東莞市科技計劃項目(2014108101041)

周佩嬌(1981-)，女，獸醫師，碩士，從事禽流感防控工作，E-mail：52856393@qq.com

廖明，E-mail：mliao@scau.edu.cn

S852.65+9.5

A

0529-6005(2017)05-0003-04