水產(chǎn)用阿維菌素聚乳酸微球的制備工藝

戴瑜來(lái)，許寶青，張 樂(lè)，林啟存，戴楊鑫，馬恒甲，蔡麗娟，朱麗敏

(杭州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，浙江 杭州 310024)

水產(chǎn)用阿維菌素聚乳酸微球的制備工藝

戴瑜來(lái)，許寶青，張 樂(lè)，林啟存，戴楊鑫，馬恒甲，蔡麗娟，朱麗敏

(杭州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，浙江 杭州 310024)

為了優(yōu)化阿維菌素聚乳酸微球的制備工藝，形成契合水產(chǎn)養(yǎng)殖需求的微球制備工藝。采用乳化-溶劑揮發(fā)法制備微球，以微球粒徑和包封率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，通過(guò)正交試驗(yàn)對(duì)處方和工藝進(jìn)行優(yōu)化，并對(duì)微球在養(yǎng)殖水體中的釋放情況進(jìn)行了考察。結(jié)果所得微球外觀形態(tài)良好，粒徑在50～80 μm，包封率達(dá)72.6%，64 h藥物累計(jì)釋放率少于60%。相對(duì)于原藥在水體中4 h 100%溶出，阿維菌素聚乳酸微球具有顯著的緩釋作用。

阿維菌素； 水產(chǎn)用； 聚乳酸； 緩釋

阿維菌素(avermectin)是一類(lèi)具有殺蟲(chóng)、殺螨、殺線蟲(chóng)活性的十六元大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)化合物，由于其作用機(jī)制獨(dú)特，用量小，驅(qū)蟲(chóng)效果好，被廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)、畜牧業(yè)和水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中，并取得了巨大的經(jīng)濟(jì)社會(huì)效益[1]。

阿維菌素常規(guī)劑型有片劑、粉劑、乳劑、糊劑、透皮劑、口服液、注射液等[2]，水產(chǎn)上常用的是粉劑和乳劑。阿維菌素的常規(guī)劑型極易光分解氧化，導(dǎo)致其光穩(wěn)定性差，潑灑使用持效期短，無(wú)形中增加了漁民用藥次數(shù)和防治成本[3]。此外，常規(guī)劑型存在有效成分達(dá)峰快、峰值高和有效抗蟲(chóng)濃度持續(xù)時(shí)間短等缺陷，易引起養(yǎng)殖動(dòng)物急性毒性反應(yīng)，且導(dǎo)致藥物抗蟲(chóng)效果不佳。

上述問(wèn)題在較大程度上是由于常規(guī)藥物的加工劑型、使用方法和對(duì)象的不合理造成的，將現(xiàn)有藥物品種的配方及劑型進(jìn)行改進(jìn)是目前藥物研發(fā)的主要方向，相對(duì)于開(kāi)發(fā)新藥物具有更好的成效和更低的成本。緩釋制劑是指用常規(guī)藥物與載體材料、輔料制成持續(xù)穩(wěn)定釋放的劑型，它可根據(jù)病害發(fā)生規(guī)律、特點(diǎn)及環(huán)境條件，使藥物按照需要的劑量、特定的時(shí)間、持續(xù)穩(wěn)定地釋放，以達(dá)到經(jīng)濟(jì)、安全、有效地控制病害。目前，在農(nóng)林牧業(yè)中使用阿維菌素緩釋制劑已有相關(guān)研究，并取得較好使用效果，但應(yīng)用于水產(chǎn)上的阿維菌素緩釋制劑卻鮮有報(bào)道。

本研究選用無(wú)污染、可降解材料聚乳酸作為輔材，通過(guò)乳化-溶劑揮發(fā)制成阿維菌素緩釋制劑，并對(duì)其形態(tài)特征、粒徑大小及養(yǎng)殖水體的釋藥情況進(jìn)行研究，旨在為阿維菌素緩釋制劑應(yīng)用于水產(chǎn)提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器

Waters Alliance e2695高效液相色譜儀(美國(guó)沃特世)；FA2204B電子分析天平(上海精科實(shí)業(yè)有限公司)；Olympus BX53顯微鏡(奧林巴斯有限公司)；S-3400N型掃描電子顯微鏡(日本HITACHI)；RS-360E超聲波清洗儀(上海華巖儀器設(shè)備有限公司)；DSX電動(dòng)攪拌機(jī)(杭州儀表電機(jī)有限公司)；HS-2恒溫水浴鍋(太倉(cāng)市華利達(dá)實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)。

1.1.2 藥物與試劑

阿維菌素標(biāo)準(zhǔn)品，純度95.0%，德國(guó)DR.Ehrenstorfer公司；阿維菌素原藥，純度98.0%，浙江盛通科技有限公司；聚乙烯醇124為優(yōu)級(jí)純，二氯甲烷、甲醇、吐溫80等為分析純，均購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 方法

1.2.1 處理設(shè)計(jì)

為了優(yōu)化制備工藝，根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，將聚乳酸濃度(A)、聚乙烯醇濃度(B)、給藥量(C)、攪拌速率(D)確定為試驗(yàn)影響因素，每個(gè)因素選1～3個(gè)水平，分別為A 2%、3%和4%，B 0.6%、0.8%和1.0%，C 0.75、1.00和1.25 g，D 300、400和500 r·min-1。根據(jù)L9(34)正交表設(shè)計(jì)安排試驗(yàn)。

1.2.2 制備方法

采用O/W(油相/水相)乳化-溶劑揮發(fā)法制備。分別稱(chēng)取一定量原藥阿維菌素和聚乳酸攪拌溶于二氯甲烷中組成分散相(共25 mL)；聚乙烯醇(連續(xù)相穩(wěn)定劑)加熱溶解于蒸餾水中(共250 mL)，將分散相緩慢加入到連續(xù)相中，以一定攪拌速率攪拌形成油-水乳劑，至乳滴固化形成球狀體后升高系統(tǒng)溫度到45 ℃，降低攪拌速率，直至有機(jī)溶劑揮發(fā)停止攪拌，靜置后，過(guò)濾得到固體微粒，經(jīng)蒸餾水洗滌3次，干燥后貯存?zhèn)溆肹4]。

1.3 主要性能測(cè)定

1.3.1 形態(tài)觀察

光學(xué)顯微鏡觀察。用去離子水將一定量的微球粉末配制成懸浮液后，滴于載玻片上，用光學(xué)顯微鏡觀察微球形態(tài)、粒徑大小，并選取有代表性的區(qū)域進(jìn)行拍照。

電鏡觀察。將微球首先進(jìn)行噴金處理，以掃描電子顯微鏡觀察微球的整體形態(tài)和單個(gè)微球的表面狀態(tài)。

1.3.2 質(zhì)量濃度檢測(cè)

以高效液相色譜法(HPLC)為檢測(cè)方法。色譜條件為：C18色譜柱(4.6 mm×250 mm×5 μm)，柱溫35 ℃，流動(dòng)相為甲醇-水(85∶15)，流速1.0 mL·min-1，進(jìn)樣量10 μL，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)245 nm。

標(biāo)準(zhǔn)曲線制作。準(zhǔn)確稱(chēng)取12.5 mg阿維菌素對(duì)照品至25 mL容量瓶，用甲醇溶解定容。分別吸取適量，用甲醇稀釋?zhuān)瞥珊⒕S菌素為0.1、0.5、1、2、5、10、20、50、100、200 μg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)溶液。各取10 μL，用HPLC分析，制成標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.3 載藥量和包封率測(cè)定

準(zhǔn)確稱(chēng)取0.05 g微球，用二氯甲烷溶解后，再用甲醇定容至25 mL，稀釋10倍后經(jīng)0.22 μm濾膜過(guò)濾，用高效液相色譜(HPLC)測(cè)定濾液中阿維菌素含量。

載藥量/%=微球中阿維菌素的質(zhì)量÷微球的總質(zhì)量×100；

包封率/%=微球中阿維菌素的質(zhì)量÷實(shí)際加入阿維菌素的質(zhì)量×100。

1.3.4 養(yǎng)殖水體中藥物溶出測(cè)定

分別稱(chēng)取等量原藥和緩釋微球(以阿維菌素量計(jì))，先經(jīng)乳化劑(吐溫80)乳化后，稀釋潑灑于養(yǎng)殖水體(2 m×2 m水泥池，水體深1 m)，分別在0.5、1、2、4、8、16、32、64 h取樣(每次取1 L，取樣后加入等量養(yǎng)殖水)，裝瓶后待處理。試驗(yàn)分別設(shè)有2個(gè)平行組。

1.3.5 水樣處理

將1 L水樣用3×50 mL二氯甲烷萃取，經(jīng)無(wú)水硫酸鈉過(guò)濾后在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上濃縮至1～2 mL，然后用高純氮吹干，色譜甲醇定容至5 mL后待測(cè)[5]。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

不同濃度阿維菌素的標(biāo)準(zhǔn)溶液經(jīng)高效液相色譜上機(jī)分析后，以色譜峰面積為橫坐標(biāo)、進(jìn)樣質(zhì)量濃度為縱坐標(biāo)作標(biāo)準(zhǔn)曲線，得標(biāo)準(zhǔn)曲線為A=1.84×104C+6.85×103，r=0.999 9。

2.2 正交設(shè)計(jì)結(jié)果

由表1結(jié)果可見(jiàn)，正交設(shè)計(jì)最佳制備工藝條件是A3B2C1D2，即聚乳酸濃度為4.0%、聚乙烯醇濃度為0.8%、給藥量為0.75 g、攪拌速率為400 r·min-1；從極差大小判斷，四因素對(duì)包封率的影響程度由大到小依次為A>C>B>D。因?yàn)樽罴压に囄丛谡辉囼?yàn)表中，根據(jù)最佳工藝試驗(yàn)制備微球，并測(cè)其包封率為72.6%，載藥量達(dá)54.8%。

表1 制劑工藝優(yōu)化正交試驗(yàn)

試驗(yàn)編號(hào)ABCD平均包封率/%111114832122255331333420421235895223155662312609731325698321368593321541均值Ⅰ485547592527-均值Ⅱ585598561577-均值Ⅲ599513515565-極差113757750-

2.3 微球表征觀察

由圖1可看出，微球粒徑在50～80 μm，分散均勻，形態(tài)均一，球形度較好。

2.4 養(yǎng)殖水體中藥物溶出結(jié)果

由圖2可知，原藥的溶出速度最快，到試驗(yàn)4 h已經(jīng)完全溶出，而各組微球均具有良好的緩釋性能，到試驗(yàn)結(jié)束(64 h)釋放均不超過(guò)60%的藥量；最優(yōu)制備條件下制得的微球緩釋效果除略小于試驗(yàn)組6外，均好于其他試驗(yàn)組。圖中顯示，阿維菌素微球均存在突釋和緩釋2個(gè)階段，前1 h表現(xiàn)出突釋效應(yīng)，到8 h左右處出現(xiàn)緩釋平臺(tái)。

圖1 最佳制備工藝條件下的微球

圖2 正交組、最優(yōu)工藝、原藥在養(yǎng)殖水體中的釋放曲線

3 小結(jié)與討論

制備微球的方法主要有乳化-溶劑揮發(fā)法、相分離法、乳化溶劑萃取法、噴霧干燥法、熔融法等，其中乳化溶劑揮發(fā)法最為常用[6]。該方法制備微球與藥物性質(zhì)、揮發(fā)性溶劑、乳化劑種類(lèi)、攪拌速率、儀器設(shè)備、聚合物在分散中的濃度等有關(guān)[7-8]。本研究所選藥物為脂溶性藥物，在水中幾乎不溶(10 μg·L-1)，非常適用于O/W乳化-溶劑揮法制備載藥微球[9]。為了獲得最佳工藝條件，本試驗(yàn)在單因素考察的基礎(chǔ)上，研究了輔料濃度、投藥量、乳化劑濃度、攪拌速率對(duì)微球質(zhì)量的影響，所制得的微球形態(tài)均一、球形度好，在養(yǎng)殖水體中具有較好的緩釋效果。

突釋現(xiàn)象是藥物較難解決的問(wèn)題，突釋效應(yīng)可造成短時(shí)間內(nèi)釋放出大量的藥物，使體內(nèi)的血藥水平陡然升高，產(chǎn)生不良反應(yīng)[9]。本研究發(fā)現(xiàn)，原藥和微球的溶出過(guò)程中均存在突釋現(xiàn)象，微球藥物中的原藥雖然被輔料填充在材料內(nèi)，但仍存在突釋現(xiàn)象，其原因可能是微球表面粘附原藥或微球干燥時(shí)藥物向微球表面遷移富集引起[10]。然而，微球藥物的突釋效應(yīng)要遠(yuǎn)小于阿維菌素原藥，因此，使用微球藥物較原藥具有更高的安全性。

[1] 邢麗紅，冷凱良，翟毓秀，等. 鱸魚(yú)組織中阿維菌素、伊維菌素殘留的高效液相色譜熒光檢測(cè)法研究[J]. 海洋水產(chǎn)研究，2008，29(4)：52-57.

[2] 唐輝，陳文，姚新成，等. 緩釋阿維菌素明膠微球的研制及其體外釋放特性[J]. 中國(guó)新藥雜志，2002，11(6)：463-464.

[3] 吳傳萬(wàn)，杜小鳳，王偉中. 阿維菌素光分解及其光穩(wěn)定劑的篩選[J]. 農(nóng)藥，2006，45(12)：828-833.

[4] 王敏儒，陳杖榴，馮淇輝. 伊維菌素聚乳酸微球的研制及其體外釋藥試驗(yàn)[J]. 中國(guó)獸醫(yī)科技，1999，29(8)：10-12.

[5] 張衛(wèi)，虞云龍，林匡飛，等. 阿維菌素在土壤中的微生物降解研究[J]. 應(yīng)用生態(tài)學(xué)報(bào)，2004，15(11)：2175-2178.

[6] 張海龍，林建強(qiáng). 乳化溶劑揮發(fā)法在微球制備中的應(yīng)用[J]. 西北藥學(xué)雜志，2007，22(2)：51-52.

[7] WATTS P J，DAVIES M C，MELIA C D. Microencapsulation using emulsification/solvent evaporation：An overview of techniques and application[J]. Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems，1990，7(3)：235-259.

[8] 王哲，倪宏哲，張明耀，等. 聚乳酸微球制備工藝的研究[J]. 高分子材料科學(xué)與工程，2007，23(6)：207-210.

[9] 龍娜，呂竹芳. 微球緩釋系統(tǒng)的突釋現(xiàn)象及其影響因素[J]. 中國(guó)藥師，2010，13(3)：421-423.

[10] 王愷源，高永良. 影響PLGA微球突釋的因素以及控制技術(shù)[J]. 中國(guó)新藥雜志，2011，20(6)：557-562.

(責(zé)任編輯：張瑞麟)

2017-03-14

杭州市農(nóng)業(yè)科研攻關(guān)專(zhuān)項(xiàng)(20150432B10)；國(guó)家大宗淡水魚(yú)類(lèi)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系(CARS-46)

戴瑜來(lái)(1986—)，男，浙江奉化人，工程師，從事水產(chǎn)病害防治與水域環(huán)境監(jiān)測(cè)研究工作，E-mail：dylaiuai@163.com。

10.16178/j.issn.0528-9017.20170543

TS254

B

0528-9017(2017)05-0858-03

文獻(xiàn)著錄格式：戴瑜來(lái)，許寶青，張樂(lè)，等. 水產(chǎn)用阿維菌素聚乳酸微球的制備工藝[J].浙江農(nóng)業(yè)科學(xué)，2017，58(5)：858-860.