5個燕麥品種基因組DNA的提取

閆艷華，杜京旗，李嬌嬌

(呂梁學院 生命科學系，山西 呂梁 033000)

5個燕麥品種基因組DNA的提取

閆艷華，杜京旗，李嬌嬌

(呂梁學院 生命科學系，山西 呂梁 033000)

以5個不同品種的燕麥種子和葉片為原料，用CTAB法提取燕麥基因組DNA，最后通過吸光度來檢測所提取DNA的純度和質量，確保提取出純度較高的燕麥基因組DNA樣品。結果表明，燕麥葉子基因組DNA比燕麥種子基因組DNA要容易提取得多，得到的DNA溶液質量比較高，而這5種燕麥的基因組DNA的提取難易程度不同，只有符合要求純度的燕麥基因組DNA才可以用于進一步研究。

燕麥； 基因組DNA； CTAB法； 吸光度

燕麥屬于禾本科燕麥屬一年生草本植物，分為有殼和無殼兩大類，即皮燕麥和裸燕麥。燕麥抗旱、抗寒，是我國主要高寒作物之一，在貧苦地區是不可缺少的干糧，市場開發前景廣闊[1-5]。但是燕麥DNA提取過程中易受纖維、蛋白質、酚類，脂類、糖類及其他干擾物質含量的影響，DNA提取的質量較差，嚴重影響燕麥分子生物學方面的研究與進展[6-8]。

本研究旨在用燕麥葉片和種子兩種不同材料通過改良的CTAB法得到優質的基因組DNA，為進一步研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

供試燕麥種子由呂梁學院生物實驗室提供，保存于4 ℃冰箱內。5個品種分別是定燕1號、白燕2號、寧莜1號、晉燕17號和晉燕8號。

主要試劑有無水乙醇、氯仿、異戊醇、CTAB(十六烷基三甲基溴化銨)、Tris(三羥甲基氨基甲烷)、EDTA(乙二胺四乙酸)、氯化鈉、2-巰基乙醇、濃鹽酸、氫氧化鈉、蒸餾水等。

主要儀器有HH-6型數顯恒溫水浴鍋、Neofuge13R型臺式高速冷凍離心機、UV-1601雙光束紫外/可見分光光度計、超低溫冰箱、pH值試紙、玻璃棒、移液器、研缽、1.5 mL的離心管、電子天平、微波爐。

1.2 方法

1.2.1 提取DNA的方法與步驟

采取CTAB法對燕麥基因組DNA進行提取。植物材料經過粉碎，提取液中的陽離子去垢劑十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)能夠溶解細胞膜和核膜，解聚核蛋白，且與DNA形成復合物。在高鹽條件下，該復合物是可溶的[9]。用氯仿等有機溶劑抽提可使蛋白質變性，使多糖沉淀，經過離心，CTAB-DNA復合物仍留在上清液中；降低鹽濃度，則CTAB-DNA復合物發生沉淀，沉淀用高鹽TE緩沖液溶解后，加入無水乙醇，CTAB仍留在溶液中，但DNA發生沉淀，沉淀溶于TE緩沖液中，即可得到植物基因組DNA[9]。

1.2.2 備用試劑的配制

氯仿/異戊醇。按照體積比24∶1的比例配制即可，在4 ℃下保存備用。

CTAB/NaCl溶液。4.1 g NaCl溶解于80 mL蒸餾水中，緩緩加入10 g CTAB，邊加熱邊攪拌至溶解，用蒸餾水定容至100 mL。

TE緩沖液。10 mL 0.01 mol·L-1pH值8.0的Tris-HCl和40 mL 0.001 mol·L-1pH值8.0的EDTA混合，加入蒸餾水定容至100 mL，配制成TE緩沖液。

pH值8.0 Tris-HCl。50 mL 0.2 mol·L-1的Tris加26.8 mL的0.2 mol·L-1的HCl，定容至200 mL。

pH值8.0 CTAB提取液。2 g CTAB加蒸餾水40 mL，加0.1 mol·L-1Tris-HCl(pH值8.0)10 mL、0.5 mol·L-1EDTA(pH值8.0)4 mL和5 mol·L-1NaCl 28 mL，待CTAB溶解后用蒸餾水定容到100 mL。

1.2.3 DNA的提取

燕麥種子在清水中浸泡后除去外殼，放在預冷的研缽內迅速磨碎，用電子天平稱取0.1 g燕麥種子粉末，轉入1.5 mL無菌離心管。

將一定量CTAB提取液中加入2-硫基乙醇至終體積分數的2%，在水浴鍋中加溫至65 ℃。然后向上述裝有燕麥種子粉末的離心管中加入600 μL的預熱CTAB提取液，在65 ℃的水浴鍋中保溫30 min，期間不斷搖晃離心管。

向上述離心管中加入500 μL的氯仿/異戊醇，顛倒離心管數次，然后在4 ℃，11 000 r·min-1下離心10 min，取上清液轉移到另一個離心管中。

向上清液中加入1/10體積的CTAB/NaCl溶液并預熱到65 ℃，顛倒離心管數次。再向離心管中加入相同體積的氯仿/異戊醇，晃動離心管幾次。室溫，11 000 r·min-1下離心10 min，用移液管吸取上清液轉移到另一個離心管中。

然后再加入等體積的氯仿/異戊醇，相同條件下重復離心幾次，直到中間沒有白色物質，取上清到一個無菌離心管中。

向上述離心管中加入2倍體積的無水乙醇，-20 ℃下靜置30 min。

在4 ℃條件下，14 000 r·min-1離心15 min，棄上清，留下沉淀物。

沉淀用75%的乙醇潤洗1次，室溫干燥，用TE緩沖液溶解沉淀，得到DNA溶液，在-20 ℃下保存備用。

葉片DNA的提取方法和步驟與種子基本一樣。

1.3 紫外分光光度計檢測提取的DNA純度

核酸之所以具有紫外吸收的性質，是因為其堿基均具有共軛雙鍵。核酸在260～290 nm處有較強吸收峰，在260 nm處吸收值最大，230 nm吸收值最小；蛋白質在280 nm處吸收值最大。因此可以根據所測定樣品的D260/D280的比值來判斷提取的DNA的純度。

在紫外分光光度計上分別設置260、280 nm兩個波長，用TE緩沖液進行空白對照，對每種燕麥提取的基因組DNA溶液進行吸光度測定，并計算D260/D280。

2 結果與分析

D值檢測燕麥中提取的基因組DNA純度的標準是由D260，D280和D260/D280的比值來判斷的，當D260/D280≈1.8時，DNA純度最高；當D260/D280<1.8時，說明有蛋白質等雜質；當D260/D280≈2.0時，說明RNA含量較高，DNA降解多[10]。

由表1可知，寧莜1號種子的D260/D280>2.00，而且在260 nm時吸光度最大，說明寧莜1號在DNA提取過程中有RNA的干擾。晉燕17號種子中提取的DNA在280 nm下D值較大，說明在提取過程中沒有很好的抽提掉蛋白質，排除蛋白質的干擾。由吸光度比值可知，定燕1號提取的DNA純度最高，其次是白燕2號、晉燕17號和晉燕8號，最后是寧莜1號。燕麥葉子中提取的DNA的D值基本與之保持一致。

表1 提取的5種燕麥基因組DNA吸光度

提取部位燕麥品種D260D280D260/D280種子定燕1號124406581892白燕2號117810041773寧莜1號127406322013晉燕17號116210191714晉燕8號126306551926葉片定燕1號129407181802白燕2號119306651793寧莜1號114105991902晉燕17號126207271734晉燕8號136407181893

由圖1可以看出，葉片中DNA純度次序基本與種子中一樣，葉片中提取的DNA的D260/D280趨向于1.80這條標準線。也就是說，葉片中提取的DNA的質量和純度比種子中提取的DNA的質量和純度要高。總體上葉片中提取的DNA更加適合做燕麥基因組DNA模板，用于下一步的研究。由此可知，葉片比種子中的DNA更易提取，或者說葉子中本身的干擾因素少。

1表示定燕1號，2表示白燕2號，3表示寧莜1號，4表示晉燕17號，5表示晉燕8號圖1 種子和葉片提取的DNA的純度對比

3 小結與討論

燕麥的種子中含有較多的多糖、蛋白質和脂質，這些物質都對燕麥基因組DNA的提取造成一定程度的干擾，去除這些雜質是提取純度較高的DNA的重要一步。葉子中雖含有多酚類物質較多，但相對種子來說比較好抽提，所以葉子中提取的DNA質量比種子中提取的DNA質量高。

本試驗采用的是CTAB法提取燕麥2個部位的DNA。1)由檢測結果看，CTAB法可得到較高質量總DNA，從成本上看，是較理想的方法[11]。2)氯仿/異戊醇抽提雜質時，并不是一次就可以成功，必須進行多次離心、多次抽提才可以把雜質最大程度的去除，但有時會起到負作用。3)用無水乙醇沉淀DNA時，乙醇的溫度特別重要，只有在低溫下才可以較多的沉淀出DNA，然后再在低溫下進行離心才可以得到較多DNA沉淀；如果溫度沒有控制好，DNA沉淀的會很少，甚至已經沉淀的DNA裂解了，以至于得不到高質量的DNA。4)EDTA在堿性溶液中才能較好的溶解，在溶解EDTA時可以加入氫氧化鈉。而CTAB必須在65 ℃左右才是液體狀，濃度高的CTAB低溫下會變成膠狀，濃度低的CTAB在低溫下會結晶。5)酚是芳香烴環上的氫被羥基取代的一類芳香族化合物。最簡單的酚為苯酚。酚類化合物是指芳香烴中苯環上的氫原子被羥基取代所生成的化合物，根據其分子所含的羥基數目可分為一元酚和多元酚。因為燕麥中多酚物質的影響，DNA很快會發生褐變，2-巰基乙醇的存在有效防止了DNA的氧化褐變。6)本試驗采取的CTAB法提取燕麥基因組DNA并沒有適合所有的燕麥種類，有些燕麥可能適合另外一些提取DNA的方法。但要想滿足后續的分子生物學實驗，要求所提取的DNA必須純度很高，所以之后要根據提取的材料去找到一種最適合的方法，確保提取到純度、濃度都很大的DNA模板。

[1] 馬曉剛，任有成，王顯萍. 發展燕麥生產在青海經濟和生態建設中的作用 [J]. 作物雜志，2001(5)：9-11.

[2] 齊冰潔. 燕麥種質資源遺傳多樣性研究[D]. 內蒙古：內蒙古農業大學，2009.

[3] 章海燕，張暉，王立，等. 燕麥研究進展[J]. 糧食與油脂，2009(8)：7-9.

[4] 齊雅坤，安迎新. 我國燕麥品種資源的蛋白質與脂肪含量的初步研究[J]. 內蒙古農業科技，1987(2)：4-7.

[5] 趙秀芳，戎郁萍，趙來喜. 我國燕麥種質資源的收集和評價[J]. 草業科學，2007，24(3)：36-40.

[6] 郝豆豆，朱勇，雷鳴，等. 燕麥種子基因組DNA不同提取方法的比較[J]. 黑龍江農業科學，2015(10)：20-23.

[7] 戴劍，洪德林，張大棟，等. 一種快速高效的DNA提取方法研究[J]. 麥類作物學報，2011，31(3)：437-442.

[8] 紫建芳，劉旭，賈繼增. 一種適于PCR擴增的小麥基因組DNA快速提取法[J]. 植物遺傳資源學報，2006，7(2)：246-248.

[9] 侯艷霞，湯浩茹，張勇，等. DNA提取方法對一串紅不同部位DNA提取的比較[J]. 基因組學與應用生物學，2009，28(1)：94-100.

[10] 張麗，黃學琴，吳金忠. 黑核桃葉片基因組DNA的提取方法比較研究[J]. 中國農學通報，2011，27(28)：125-129.

[11] 劉學春，潘春欣，宋云枝，等. 一種單子葉植物總DNA提取方法的改進及應用[J]. 山東農業大學學報，1995，26(4)：491-495.

(責任編輯：張瑞麟)

2016-01-23

呂梁學院自然科學校內青年基金(ZRQN201512)

閆艷華(1985—)，女，山西呂梁人，碩士，從事植物遺傳與分子生物學方面的工作，E-mail: yanhua19852008@163.com。

10.16178/j.issn.0528-9017.20170541

S512

A

0528-9017(2017)05-0852-03

文獻著錄格式：閆艷華，杜京旗，李嬌嬌. 5個燕麥品種基因組DNA的提取[J].浙江農業科學，2017，58(5)：852-855.