高效液相色譜法測定牛羊雜碎等肉類中嘌呤及尿酸

王靜瑩，薄海波*，吉生軍，程子毓，陳秀紅

1(青海師范大學，青海 西寧，810000) 2(青海省出入境檢驗檢疫局，青海 西寧，810000)

高效液相色譜法測定牛羊雜碎等肉類中嘌呤及尿酸

王靜瑩1，薄海波1*，吉生軍1，程子毓1，陳秀紅2

1(青海師范大學，青海 西寧，810000) 2(青海省出入境檢驗檢疫局，青海 西寧，810000)

建立同時測定肉類食品中尿酸、鳥嘌呤、次黃嘌呤、黃嘌呤和腺嘌呤的高效液相色譜分析方法，并測定肉類樣品中上述4種嘌呤及尿酸的含量。色譜條件：資生堂CAPCELL PAK-C18(4.6 mm×250 mm,5 μm)色譜柱，柱溫30℃；流動相為7×10-3mol/L KH2PO4-H3PO4(pH=3.83)，流速1.0 mL/min；檢測器為紫外檢測器，檢測波長254 nm；進樣量10 μL。結果：在上述條件下4種嘌呤和尿酸分離和測定效果良好，4種嘌呤和尿酸的質量濃度和峰面積在0.05～50 μg/mL線性范圍內線性關系良好，相關系數均在0.999 6以上，檢出限在0.010～0.024 μg/mL之間，精密度檢測RSD為0.25%～0.81%，各組分回收率為92.0%～105.0%，方法精密度RSD為6.27%～11.09%。結論：該方法簡便，快捷，可靠，各組分分離度好，可應用于肉類食品中嘌呤和尿酸的同時分析測定。

高效液相色譜(HPLC)；牛羊雜碎；嘌呤；尿酸

嘌呤(C5H4O4)是一類生物堿，是核酸的重要組成部分，人體內嘌呤的主要來源有體內合成、人體組織中核酸分解以及食物中攝取，而飲食是人體嘌呤的一個重要來源。常見的嘌呤主要有腺嘌呤(adenine)、鳥嘌呤(guanine)、黃嘌呤(xanthine)和次黃嘌呤(hypoxanthine) 4 種[1]，嘌呤經體內代謝最終轉化生成尿酸(Uric acid)，正常情況下主要經腎排出體外。尿酸是人體內特有的天然水溶性抗氧化劑，具有刺激樹突狀細胞及T細胞成熟以維護機體免疫力、維持血壓、促進傷口愈合等功能[2]。長期攝入高嘌呤的食品再加上一些誘導因素會導致嘌呤在體內的最終產物——尿酸的沉積，最終引發痛風。

食品嘌呤含量的檢測方法和樣品前處理方法多種多樣，目前國內外沒有建立統一的標準。嘌呤檢測的方法主要有液相色譜法、紙層析法、電泳法、薄層色譜法、氣相色譜法和離子色譜法等[3]，隨著液相色譜法日漸普及，并因其方便、快速、靈敏、選擇性高，已成為檢測嘌呤的主流方法。樣品中嘌呤的提取方法有酸提取法[4-7]、有機溶劑萃取[8-9]和超聲輔助萃取法[10-12]。研究者多采用HClO4[13-19]、三氟乙酸和甲酸[20-21]進行樣品水解。HClO4水解樣品，分離效果較好,準確度和精密度較高,檢測時間短。因此本實驗采用高氯酸對樣品進行水解。

本研究建立了同時測定青藏高原牛羊雜碎等風味肉制品中腺嘌呤、鳥嘌呤、次黃嘌呤、黃嘌呤及尿酸的高效液相色譜分析方法，并對4種嘌呤和尿酸含量進行同時測定。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

樣品：新鮮黃牛肉、牦牛肉、手抓羊肉、牛肉、牛頭肉；牛腩、牛肚、牛筋、羊肝、羊心、羊腸等牛羊內臟；牛雜碎(含有牛肚，牛筋，牛肺，牛腸，牛腩等內臟)、羊雜碎(含有羊肚，羊心，羊肺，羊腸，羊肝等內臟)購自西寧市各大市場。-20 ℃冷凍保存。

標準品：尿酸、鳥嘌呤、次黃嘌呤、黃嘌呤、腺嘌呤標準品(純度>98.0%)，Agilent公司。

稱取尿酸、鳥嘌呤、次黃嘌呤、黃嘌呤和腺嘌呤標準品各0.050 0 g，加20 mL 0.1 mol/L的NaOH溶液助溶，分別用10%甲醇溶液定容至100 mL容量瓶中，搖勻，即得500 μg/mL的標準單一儲備液。-20 ℃保存。

試劑：甲醇(色譜純)，天津市光復精細化工研究所；HClO4(分析純)，天津東方化工廠；KH2PO4(分析純)，北京紅星化工廠；H3PO4(分析純)，天津市濱海科迪化學試劑有限公司；KOH(分析純)，四川成都化工廠；實驗用水均為超純水。

1.2 儀器與設備

U1tiMate3000高效液相色譜儀(配有紫外檢測器)，美國戴安公司；FW-100高速萬能粉碎機，紹興市科弘儀器有限公司；雷磁PHS-3C型pH計，上海儀電科學儀器股份有限公司；L600離心機，湘儀公司；WB-2000水浴鍋，鄭州長城科工貿有限公司；TG332A微量分析天平，湘儀天平儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件

色譜柱：資生堂CAPCELL PAK-C18(4.6 mm×250 mm,5 μm),柱溫30 ℃；流動相：7×10-3mol/L KH2PO4-H3PO4(pH=3.83)，流速1.0 mL/min；檢測器：紫外檢測器，檢測波長254 nm；進樣量10 μL。

1.3.2 樣品的制備與前處理

將樣品室溫下自然解凍，新鮮黃牛肉、牦牛肉、手抓羊肉、牛肉、牛頭肉等肉類和牛腩、牛肚、牛筋、羊肝、羊心、羊腸等牛羊內臟；用刀切碎，再用高速萬能粉碎機絞碎并勻漿，貼明標簽，-20 ℃冷凍保存備用。

將市購的牛雜碎(含有牛肚，牛筋，牛肺，牛腸，牛腩等內臟)和羊雜碎(含有羊肚，羊心，羊肺，羊腸，羊肝等內臟)分別分樣為牛雜碎肉(干物質)、牛雜碎湯、牛雜碎肉和湯(混合物)、羊雜碎肉(干物質)、羊雜碎湯、羊雜碎肉和湯(混合物)，用高速萬能粉碎機絞碎并勻漿，貼明標簽，-4 ℃冷凍保存備用。

稱取0.200 0 g樣品于10 mL具塞刻度離心管中，加入3 mL 體積分數10%的HClO4，搖勻后在沸水浴中水解60 min，冷卻。用1 mol/L的KOH溶液調節pH至3.8，再用超純水定容至10 mL，以3 000 r/min的轉速離心30 min，上清液濾紙過濾，再用0.22 μm微孔水膜過濾，待進樣分析。

2 結果與分析

2.1 實驗條件的優化

2.1.1 色譜柱的選擇

CAPCELL PAK-C18柱采用高純度多孔球形硅膠作為基質，表面包覆單層有機硅聚合物薄膜，并在其上鍵合十八烷基(C18)等各種官能團的高性能填料填充的色譜柱。該填料既具有硅膠類填料的高分離能力，又具有聚合物填料的耐久性。該色譜柱適合測定極性成分，能與極性較強的水流動相兼容使分離的各組分呈現出良好的色譜峰形。實驗結果表明：使用資生堂CAPCELL PAK-C18能將4種嘌呤和尿酸完全分離。

2.1.2 檢測波長的選擇

尿酸、鳥嘌呤、次黃嘌呤、黃嘌呤和腺嘌呤都有著共軛雙鍵，在紫外區220～300 nm之間有強吸收峰。綜合考慮4種嘌呤和尿酸的吸收峰，選擇以波長254 nm作為實驗檢測波長。

2.1.3 流動相的優化

2.1.3.1 流動相pH的選擇

流動相的酸度對嘌呤類物質的分離程度和保留時間影響較大，應選擇合適的pH值使4種嘌呤和尿酸達到最佳分離效果。考察了濃度相同(7.0×10-3mol/L)，不同pH(3.65，3.83、3.93、4.15)的KH2PO4- H3PO4溶液對4種嘌呤及尿酸峰形和分離效果的影響。見圖1。

1-尿酸；2-鳥嘌呤；3-次黃嘌呤；4-黃嘌呤；5-腺嘌呤圖1 流動相pH為3.65、3.83、3.93、4.15的色譜圖Fig.1 Chromatogram of mobile phase pH is 3.65、3.83、 3.93、 4.15

觀察上圖中4種嘌呤和尿酸的分離情況結果，在pH為3.83時，4種嘌呤和尿酸可以完全分離，而且基線穩定，重復性最好，出峰順序依次為尿酸、鳥嘌呤、次黃嘌呤、黃嘌呤、腺嘌呤。因此確定流動相pH為3.83。

2.1.3.2 流動相濃度的選擇

采用KH2PO4- H3PO4溶液做流動相，考察了相同pH(3.83)，不同濃度(2.0×10-4、5.0×10-3、7.0×10-3、1.0×10-2、2.0×10-2mol/L)的KH2PO4-H3PO4溶液對4種嘌呤及尿酸峰形和分離效果的影響，見圖2。

1-尿酸；2-鳥嘌呤；3-次黃嘌呤；4-黃嘌呤；5-腺嘌呤圖2 流動相濃度為2.0×10-4、5.0×10-3、7.0×10-3、1.0×10-2、2.0×10-2 mol/L的色譜圖Fig.2 Chromatogram of mobile phase concentration is 2.0×10-4、5.0×10-3、7.0×10-3、1.0×10-2、2.0×10-2 mol/L

觀察上圖中4種嘌呤和尿酸的分離情況，流動相的濃度對于峰形、分離度影響較大。在濃度7.0×10-3mol/L的情況下，基線較穩定，分離度好。因此最終確定流動相濃度為7.0×10-3mol/L[22]。

2.2 線性范圍及檢出限、定量限

分別移取500 μg/mL標準單一儲備液,用超純水稀釋至0.05、 10、 20、30、40、50 μg/mL的標準系列混合溶液。將系列標準混合溶液分別用0.22 μm微孔濾膜過濾至進樣瓶中, 在1.3.1所述的色譜條件下，各進樣10 μL，繪制標準曲線。

采用外標法對進樣的系列標準溶液的峰面積和相應質量濃度進行線性回歸計算，得峰面積(Y)與質量濃度(X)的線性方程和相關系數。按3倍信噪比計算檢出限(LOD)，10倍信噪比計算定量限(LOQ)。數據結果見表1。

表1 四種嘌呤和尿酸的回歸方程和線性范圍

表1數據結果顯示：4種嘌呤和尿酸的質量濃度和峰面積在0.05～50 μg/mL線性范圍內線性關系良好，相關系數(R)在0.999 6～0.999 9之間，檢出限在0.010～0.024 μg/mL之間。說明此方法適合實際樣品的測定。

2.3 精密度考察

將20 μg/mL的混合標準溶液在日內連續進樣6次，根據定量的質量濃度分別計算4種嘌呤和尿酸的精密度。數據結果見表2。

表2數據結果顯示：尿酸、鳥嘌呤、次黃嘌呤、黃嘌呤和腺嘌呤的相對標準偏差為0.25%～0.81%,精密度良好。

表2 精密度實驗結果

2.4 回收率考察

采用牛肚作為實驗樣品進行添加回收率實驗，取已知4種嘌呤和尿酸含量的牛肚樣品18份，每份0.200 0 g，加入3個不同濃度水平的四種嘌呤和尿酸的標準混合溶液,每個濃度水平平行6份，按照1.3.2節中的前處理方法進行處理后,根據添加的標準樣品質量濃度和測定出的加標樣品質量濃度計算4種嘌呤和尿酸的回收率，尿酸、鳥嘌呤、次黃嘌呤、黃嘌呤、腺嘌呤的平均加標回收率分別為99.1%、99.0%、105.0%、92.0%、92.6%，根據實驗測得的18份加標樣品中4種嘌呤和尿酸的回收率，計算出方法精密度RSD為6.27%～11.09%，均符合分析測定的要求。

2.5 樣品測定結果

將牛羊雜碎等肉類樣品按1.3.3節進行處理，按1.3.1節的色譜條件下進樣分析。采用外標法對實測樣品的4種嘌呤和尿酸進行定性定量分析。部分樣品色譜圖見圖3～圖5。樣品測定數據結果見表3。

1-尿酸；2-鳥嘌呤；3-次黃嘌呤；4-黃呤；5-腺嘌呤圖3 牛肚色譜圖Fig.3 Chromatogram of tripe

1-尿酸；2-鳥嘌呤；3-次黃嘌呤；4-黃嘌呤；5-腺嘌呤圖4 牛肉色譜圖Fig.4 Chromatogram of beef

1-尿酸；2-鳥嘌呤；3-次黃嘌呤；4-黃嘌呤；5-腺嘌呤圖5 羊肝色譜圖Fig.5 Chromatogram of Sheep liver

表3 樣品中4種嘌呤和尿酸的含量 單位：mg/kg

注：4種嘌呤折算為尿酸的量是根據相對分子質量計算4種嘌呤轉化為尿酸的理論含量值。

表3結果顯示：青藏高原牛羊雜碎等風味肉制品中總尿酸含量為89.12～3 750.26 mg/kg，總嘌呤含量為67.44～2 659.75 mg/kg。在實測樣品中羊肝的尿酸和總嘌呤含量最高，其總嘌呤含量達到2 659.75 mg/kg，牦牛肉、黃牛肉、牛肉和學府巷-羊排中總嘌呤含量次之；牛羊雜碎湯中總嘌呤含量最低，牛羊肚次之。采用本方法在羊肺和學府巷-羊排中未檢測到尿酸；在羊心、羊肚、冷湖-羊排、羊腸、牛雜碎肉和羊雜碎肉和湯中尿酸含量較低。

在牛肉和牛雜碎中總嘌呤含量順序為：黃牛肉>牛肉>牦牛肉>牛腩>牛筋>牛頭肉>牛排>牛雜碎肉>牛雜碎肉和湯>牛肚>牛雜碎湯;在羊肉和羊雜碎中總嘌呤含量順序為：羊肝>羊肺>學府巷-羊排>羊心>手抓羊肉>五四大街-羊排>羊雜碎肉>羊腸>冷湖路-羊排>羊雜碎肉和湯>羊肚>羊雜碎。

由表3可知，不同地方購買的牛羊雜碎等肉類中總嘌呤和尿酸含量差異較大，尤其是不同地的羊排中總嘌呤和尿酸含量有著顯著的差異，羊排中總嘌呤含量學府巷-羊排>五四大街-羊排>冷湖路-羊排，三個地區結果差異較大。嘌呤含量差異大可能是由于生物體生長環境和自身生長情況不一樣，造成同一部位的肉中嘌呤含量差異較大。

在痛風發病率高的青藏高原地區，為預防和治療痛風癥，建議人們少量食用高嘌呤含量的黃牛肉、牦牛肉、牛肉、羊肺、羊排，尤其是嘌呤含量特高的羊肝；可合理食用牛羊肚和牛羊雜碎等嘌呤含量較低的食物。

3 結論

本研究建立的方法對尿酸、鳥嘌呤、次黃嘌呤、黃嘌呤和腺嘌呤分離效果好，能快速、準確的檢測定量肉類食品中4種嘌呤和尿酸的含量。此方法在線性范圍0.05～50 μg/mL內線性關系良好，相關系數(R)在0.999 6～0.999 9之間，方法檢出限在0.010～0.024μg/mL之間，精密度RSD為0.25%～0.81%，各組分回收率在92.0%～105.0%之間，方法精密度RSD為6.27%～11.09%，適用于4種嘌呤和尿酸的同時分析測定。應用此方法測定的青藏高原牛羊雜碎等特色肉類食品中嘌呤和尿酸的含量數據，可為通風發病率高的青藏高原地區消費者提供科學健康的飲食指導。

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Determination of purine and uric acid in cooked cow and sheep offal by high performance liquid

WANG Jing-ying1, BO Hai-bo1*, JI Sheng-jun1, CHENG Zi-yu1, CHEN Xiu-hong2

1(Department of Chemistry, Qinghai Normal University, Xining 810008, China) 2(Qinghai Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Xining 810008, China)

A high performance liquid Chromatography method for the determination of uric acid, guanine, hypoxanthine, xanthine and adenine in meat was established and applied. The detecting method for Chromatography was: Shiseido CAPCELL PAK-C18(4.6 mm×250 mm, 5 μm)column, column temperature was at 30 ℃.The mobile phase was 7×10-3mol/L KH2PO4-H3PO4(pH=3.83)at a flow rate of 1.0 mL/min. The UV detector was used and the wavelength was set at 254 nm and the Sample volume was 10 μL. Result: Under the above conditions, good separation was obtained and four kinds of purines and uric acid was showed in the range of 0.05-50 μg/mL; a good linear relation was observed between the concentration and peak area,and all the correlation coefficients are higher than 0.9996, the limit of detection was between 0.010-0.024 g/mL, precision detection of RSD% was between 0.25%-0.81%,the recovery rate of each component was between 92.0%-105.0%, the precision RSD% was between6.27%-11.09%. Conclusion: The method was simple, rapid and reliable，had a good separation for each component, and can be used for the analysis and determination of purine and uric acid in meat products.

HPLC; cooked chopped entrails of cattle and sheep; purine; uric acid

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201704037

碩士研究生(薄海波教授為通訊作者，E-mail：1025104004@qq.com)。

青藏高原特色風味食品中危害物質高通量篩查及快速檢測技術研究(2014-ZJ-722)

2016-08-23，改回日期：2016-10-16