松樹蕈多糖乙酰化修飾工藝及其抗氧化活性

徐田甜,陳義勇

(常熟理工學(xué)院 生物與食品工程學(xué)院，江蘇 常熟,215500)

松樹蕈多糖乙酰化修飾工藝及其抗氧化活性

徐田甜,陳義勇*

(常熟理工學(xué)院 生物與食品工程學(xué)院，江蘇 常熟,215500)

松樹蕈多糖；乙酰化；響應(yīng)面；抗氧化

松樹蕈(Tricholomamatsutake)又名松口蘑、松茸等，屬于擔子菌門(Basidiomycota)，擔子菌綱(Basidiomycetes)，傘菌目(Agaricates)口蘑科(Tricholomaceae)，口蘑屬(Tricholoma)[1]。研究表明松樹蕈多糖(polysaccharides fromtricholomamatsutake，TMP)具有抗腫瘤[2]、美白[3]和抗輻射[4]等作用，具有重要的醫(yī)療價值和很高的市場開發(fā)前景。分子修飾對多糖活性有很大的影響，對多糖進行化學(xué)修飾，可以提高多糖的活性[5～7]。乙酰化修飾是糖類物質(zhì)的一種常見的修飾方法[6]，目前，對于松樹蕈多糖的研究主要集中在提取方法上，而對松樹蕈多糖的修飾研究未見報道。

為此，本文對TMP乙酰化修飾工藝進行探討，并利用響應(yīng)面法對TMP乙酰化化修飾工藝條件進行優(yōu)化研究，同時探討了乙酰化松樹蕈多糖(acetylation of polysaccharides fromtricholomamatsutake，Ac-TMP)的抗氧化活性。

1 材料和方法

松樹蕈(蘇州興福齋食品科技有限公司提供)。

1，1-二苯基-2-苦苯肼/DPPH，三羥甲基氨基甲烷/Tris，上海楷洋生物技術(shù)有限公司；無水乙醇、NaOH、乙酸酐、乙醚、石油醚、H2O2、FeSO4、HCl、水楊酸、酚酞、鄰苯三酚等以上試劑均為分析純。

1.1 儀器與設(shè)備

DJ-04粉碎機，上海淀久中藥機械制造有限公司；HH-2智能數(shù)顯恒溫水浴鍋，金壇市杰瑞爾電器有限公司；CR22GⅡ高速冷凍離心機，日本HITACHI公司；RE-52A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器有限公司；SHB-B95型循環(huán)水式多用真空泵，鄭州長城科工貿(mào)有限公司；DHG-9030A型電熱恒溫鼓風干燥箱，上海三發(fā)科學(xué)儀器有限公司；ME104E型分析天平，瑞士METTLER TOLEDO公司；FE20型pH計，瑞士METTLER TOLEDO公司；722分光光度計，上海菁華科技儀器有限公司；UVmini-1240紫外分光度計，日本島津；NicoletIS10 傅里葉紅外光譜儀，美國 Thermo Electron 公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 松樹蕈多糖(TMP)的制備

冷凍松樹蕈經(jīng)解凍、洗滌、干燥、粉碎后，按料液比1∶30(g∶mL)，加入蒸餾水，水浴浸提溫度為80 ℃，浸提時間為4 h。松樹蕈多糖提取液經(jīng)4 500 r/min離心10 min，合并上清液。將上清液減壓濃縮至一定體積，經(jīng)乙醚或石油醚脫脂和Sevage[V(三氯甲烷)∶V(正丁醇)=5∶1]法除蛋白后，加入4倍體積的體積分數(shù)為95%的乙醇，4 ℃條件下進行醇沉24 h后，離心，沉淀經(jīng)30 ℃鼓風干燥后得到TMP。

1.2.2 乙酰化松樹蕈多糖(Ac-TMP)的制備

Ac-TMP的制備參照文獻[8]的方法并適當調(diào)整,精確稱取100 mg的TMP樣品，加入10 mL蒸餾水，完全溶解，用NaOH溶液(0.5 mol/L)調(diào)pH為9，一定溫度下，向多糖溶液滴加一定量的乙酸酐，滴加完畢后，恒溫反應(yīng)一段時間后，待反應(yīng)結(jié)束，用HCl調(diào)pH至中性，將反應(yīng)液裝入截留分子量為14 000的透析袋中，用蒸餾水透析48 h，透析液經(jīng)減壓濃縮后，用4倍體積分數(shù)為95%的乙醇醇沉24 h，沉淀經(jīng)30 ℃鼓風干燥得到乙酰化松樹蕈多糖(Ac-TMP)。

1.2.3 乙酰化取代度的測定[9]

稱量乙酰化松樹蕈多糖10 mg，加入10 mL NaOH溶液(0.01 mol/L)將其完全溶解。以酚酞為指示劑，HCl溶液(0.01mol/L)進行滴定，滴定終點為紅色消失[9]。取代度(DS)按下式計算：

(1)

(2)

式中：A為乙酰基含量，%；V0為加入NaOH溶液的體積，mL；C0為NaOH溶液的濃度，(mol/L)；V1為消耗HCl溶液的體積，mL；C1為HCl溶液的濃度，mol/L；m為樣品質(zhì)量，g。

1.2.4 單因素實驗

1.2.4.1 料液比對TMP乙酰化反應(yīng)的影響

取100 mg TMP，反應(yīng)時間為4 h，反應(yīng)溫度為50 ℃，分別考察了不同料液比(g∶mL)1∶20、1∶25、1∶30、1∶35和1∶40對TMP乙酰化反應(yīng)的影響，進而確定最佳料液比。

1.2.4.2 反應(yīng)時間對TMP乙酰化反應(yīng)的影響

取100 mg TMP，料液比為1∶35(g∶mL)，反應(yīng)溫度為50 ℃，分別考察了1、2、3、4和5 h不同的反應(yīng)時間對TMP乙酰化反應(yīng)的影響，進而確定最佳反應(yīng)時間。

1.2.4.3 反應(yīng)溫度對TMP乙酰化反應(yīng)的影響

取100 mg TMP，料液比為1∶35(g∶mL)，反應(yīng)時間為3 h，分別考察了30、40、50、60和70 ℃不同的反應(yīng)溫度對TMP乙酰化反應(yīng)反應(yīng)的影響，進而確定最佳反應(yīng)溫度。

1.2.5 響應(yīng)面試驗設(shè)計

在單因素試驗結(jié)果的基礎(chǔ)上，采用Box-Benhnken 的中心組合試驗設(shè)計原理，以乙酰化取代度為指標，設(shè)計以料液比、反應(yīng)時間、反應(yīng)溫度為反應(yīng)主要考察因素，利用Design-Expert軟件系統(tǒng)進行響應(yīng)面分析和優(yōu)化TMP乙酰化的工藝條件。

1.2.6 Ac-TMP的結(jié)構(gòu)表征

1.2.6.1 紅外光譜分析

分別取一定量充分干燥的TMP和Ac-TMP，與一定量KBr充分混勻后壓片，在400～4 000 cm-1范圍下進行紅外光譜掃描。

1.2.6.2 掃描電鏡分析

分別取一滴4×10-3mg/ mL的TMP和Ac-TMP溶液于解理后的云母片上，1%鋨酸熏蒸固定2 h ,噴金，掃描電鏡下觀察。

1.2.7 Ac-TMP的抗氧化活性測定

1.2.7.1 羥基自由基(·OH)清除能力的測定[10]

配FeSO4溶液(9 mmol /L)，水楊酸-乙醇溶液(9 mmol /L)，H2O2溶液(8.8 mmol/L)。將TMP和Ac-TMP配成0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL 5種不同濃度。每2 mL樣品中各加1 mL的FeSO4溶液和2 mL水楊酸-乙醇溶液，最后加入2 mL H2O2溶液，啟動反應(yīng)，在室溫下反應(yīng)1 h。用蒸餾水代替樣品溶液作空白調(diào)零，于510 nm波長處測定其吸光度。羥基自由基的清除率用下式計算：

(3)

式中：A0，標準空白管的吸光度；A1，對照管的吸光度；A2，測定管的吸光度。

1.2.7.2 DPPH自由基清除能力的測定[11]

用無水乙醇配DPPH溶液(0. 1 g /L)。將TMP和Ac-TMP配成0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL 5種不同濃度。每1 mL樣品待測液和1.0 mL DPPH溶液(需現(xiàn)用現(xiàn)配)振蕩搖勻，對照樣為1.0 mL蒸餾水和1.0 mL DPPH溶液混合，常溫避光反應(yīng)30 min后于波長517 nm處比色，以蒸餾水作參比調(diào)零。DPPH自由基清除率計算式為：

(4)

式中，A0，對照組吸光度；A，樣品待測液吸光度。

(5)

2 結(jié)果與討論

2.1TMP的乙酰化修飾

2.1.1 單因素實驗結(jié)果分析

2.1.1.1 料液比對TMP乙酰化反應(yīng)的影響

料液比對TMP乙酰化反應(yīng)的影響見圖1。由圖1知，隨著料液比的增加，多糖取代度先升高后降低，當料液比為在1∶35時，乙酰化取代度達到最大，之后隨著料液比的增大，取代度逐漸下降，因此確定適宜的料液比為1∶35。

圖1 料液比對取代度的影響Fig.1 Effect of polysaccharides-to-acetic anhydrideratioon substitution degree of Ac-TMP

2.1.1.2 反應(yīng)時間對TMP乙酰化反應(yīng)的影響

反應(yīng)時間對TMP乙酰化反應(yīng)的影響見圖2。由圖2知，反應(yīng)時間對多糖取代度的影響較大，隨著時間的增長，多糖取代迅速提高，到3 h時，達到最高值，此后，隨著時間的延長，取代度較大幅度的下降，因此確定適宜的反應(yīng)時間為3 h。

圖2 反應(yīng)時間對取代度的影響Fig.2 Effect ofreaction time on substitution degree of Ac-TMP

2.1.1.3 反應(yīng)溫度對TMP乙酰化反應(yīng)的影響

反應(yīng)溫度對TMP乙酰化反應(yīng)的影響見圖3。由圖3知，反應(yīng)溫度對取代度的影響十分明顯。在30～40 ℃內(nèi)，隨著反應(yīng)溫度的上升，取代度迅速增大，反應(yīng)溫度超過40 ℃后，取代度明顯下降，因此確定適宜的反應(yīng)溫度為40 ℃。

圖3 反應(yīng)溫度對取代度的影響Fig.3 Effect of reaction temperature on substitution degree of Ac-TMP

2.1.2 TMP乙酰化工藝條件優(yōu)化

2.1.2.1 響應(yīng)模型的建立與分析

在單因素試驗結(jié)果的基礎(chǔ)上，以乙酰基取代度為指標，設(shè)計以料液比(A)、反應(yīng)時間(B)、反應(yīng)溫度(C)三因素的回歸方程來擬合因素與響應(yīng)值之間的函數(shù)關(guān)系，實驗因素和水平設(shè)計見表1，響應(yīng)面試驗設(shè)計方案及結(jié)果見表2，響應(yīng)面分析得出的回歸模型參數(shù)方差分析見表3。

表1 響應(yīng)面分析試驗因素與水平

表2 響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果

表3 回歸模型方差分析

注：P<0.05為差異顯著;P<0.001為差異極顯著。

利用Design-Expert軟件對表2中的試驗結(jié)果進行二次方程擬合，得到TMP對料液比、反應(yīng)時間和反應(yīng)溫度的二次多項回歸方程的模型為：

Y=0.58-7.428×10-3A-0.026B+0.058C+0.093AB-0.015AC+0.029BC-0.080A2-0.088B2-0.11C2

從表3方差分析結(jié)果來看，模型的F值為11.80，P<0.05，表明擬合得到的模型顯著。同時，失擬誤差項P>0.05，不顯著，說明未知因素對試驗結(jié)果干擾很小，模型選擇較合適。模型的總回歸系數(shù)R2=0.938 2，說明該模型的擬合程度較好，用于評估各因素對TMP乙酰化取代度的影響較為準確。

從表3還可知，試驗組合中的各因素中反應(yīng)溫度影響最大。影響程度大小的順序為：反應(yīng)溫度(C)>反應(yīng)時間(B)>料液比(A)。

2.1.2.2 響應(yīng)面圖分析

試驗得到的響應(yīng)面圖見圖4。從圖4分析得出，溫度對乙酰化取代度的影響最為顯著，表現(xiàn)為曲線最陡；時間的影響次之，而圖中料液比曲線最平滑，因此影響最不顯著。時間和料液比兩者之間的交互作用顯著，溫度與時間的交互作用次之，而溫度和料液比的交互作用不太明顯。

圖4 兩因素交互作用對取代度的影響Fig.4 Effects of cross-interaction of two factors on substitution degree of Ac-TMP

2.1.2.3 最佳工藝條件確定及驗證實驗

利用Design-Expert 8.06軟件對響應(yīng)面試驗結(jié)果進行分析，預(yù)測得到TMP乙酰化的最佳工藝條件為：料液比1∶34.07(g∶mL)，反應(yīng)時間為2.8 h，反應(yīng)溫度為42.42 ℃。在該優(yōu)化條件下，乙酰化松樹蕈多糖取代度達0.587。為了檢驗響應(yīng)面試驗預(yù)測結(jié)果的可靠性，采用最佳工藝條件對TMP進行乙酰化修飾。考慮實驗實施的可行性，將預(yù)測工藝條件調(diào)整為料液比1∶34(g∶mL)，反應(yīng)時間為2.8 h，反應(yīng)溫度為42 ℃，在此條件下測得的Ac-TMP的取代度為0.588，與預(yù)測值誤差很小，驗證了該預(yù)測試驗的可靠性。

2.2 結(jié)構(gòu)表征分析

2.2.1 紅外光譜

圖5 TMP和Ac-TMP的紅外光譜圖Fig.5 Infrared spectra of TMP and Ac-TMP

2.2.2 電鏡分析

TMP和Ac-TMP的電鏡圖見圖6。由圖6知，TMP樣品呈片狀，表面形貌平滑，提高放大倍率，也是光滑表面。由圖7知，Ac-TMP樣品呈孔隙狀，表面形貌粗糙。TMP屬于天然高分子凝膠，糖鏈間通過氫鍵交聯(lián)，乙酰化修飾后，很有可能糖苷鍵被切斷，由酯基取代，導(dǎo)致糖鏈間氫鍵交聯(lián)鍵密度變小， 疇結(jié)構(gòu)變大，即表面粗糙度增加[13]。

圖6 TMP電鏡觀察Fig.6 Scanning electron microscope observation of TMP

圖7 Ac-TMP電鏡觀察Fig.7 Scanning electron microscope observation of Ac-TMP

2.3 Ac-TMP的抗氧化作用

2.3.1 Ac-TMP對·OH清除作用

Ac-TMP對·OH清除作用見圖8。由圖8可知，在一定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，TMP和Ac-TMP對·OH的清除作用都隨著濃度升高而增強，與TMP相比，Ac-TMP對·OH的清除能力有極為明顯的減弱(P<0.01)。乙酰化多糖生物活性不僅受到乙酰基數(shù)量的影響，還與取代的位置相關(guān)，O-3位具有乙酰基時，多糖抗腫瘤活性最強；O-5位具有乙酰基時，抗腫瘤活性顯著減弱；當O位全部乙酰化時，活性消失[14]。與TMP相比，Ac-TMP對·OH的清除作用下降的原因可能可能與取代基的位置及取代度的多少有關(guān)。曲瑾郁[15]等對蛹蟲草多糖進行乙酰化修飾，發(fā)現(xiàn)修飾后的多糖對·OH的清除能力減弱。乙酰基能改變多糖分子的定向性和橫向次序，從而改變了多糖的空間排布，因此對其活性產(chǎn)生影響。王雪松等證實不是所有的基團的加入都會提高多糖的活性, 有些基團的加入甚至?xí)档突钚訹16]。但是也有研究發(fā)現(xiàn)，乙酰化靈芝多糖[17]、南瓜多糖[18]、青錢柳葉多糖[19]比未修飾多糖抗氧化作用有了一定程度的提高，這可能是由于不同來源的多糖種類、結(jié)構(gòu)差異導(dǎo)致修飾前后多糖抗氧化活性差異。

圖8 TMP和Ac-TMP對·OH的清除作用Fig.8 Scavenging capacity of TMP and Ac-TMP on hydroxyl free radicals

2.3.2 Ac-TMP對DPPH自由基清除作用

Ac-TMP對DPPH自由基清除作用見圖9。

圖9 TMP和Ac-TMP對DPPH自由基的清除作用Fig.9 Scavenging capacity of TMP and Ac-TMP on DPPH free radicals

由圖9可知，在一定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，TMP和Ac-TMP對DPPH自由基均有一定的清除作用，且隨著濃度上升，清除作用逐步增強，當多糖質(zhì)量濃度大于0.6 mg/mL，Ac-TMP對DPPH自由基的清除作用明顯弱于TMP(P<0.01)，可能是因為松樹蕈多糖對不同自由基的活性部位不同，在乙酰化修飾后，不同的活性部位被修飾，從而導(dǎo)致抗氧化活性的差異。曲瑾郁[15]等對蛹蟲草多糖進行乙酰化修飾，發(fā)現(xiàn)修飾后的多糖對DPPH自由基的清除能力減弱。

圖10 TMP和Ac-TMP對的清除作用Fig.10 Scavenging capacity of TMP and Ac-TMP on superoxide anion free radicals

3 結(jié)論

本文以TMP為原料，采用乙酸酐法對TMP進行乙酰化修飾，同時以取代度為指標，利用響應(yīng)面優(yōu)化分析確定TMP乙酰化修飾最佳工藝條件為料液比1∶34.07(g∶mL)，反應(yīng)時間為2.8h，反應(yīng)溫度為42.42 ℃。在此優(yōu)化條件下，Ac-TMP的取代度達到0.587。

乙酰化修飾作為一種常用的分子修飾方法，它能夠改變多糖分子的定向性和橫向次序，從而改變糖鏈的空間排布。本研究通過松樹蕈多糖進行乙酰化修飾，對于研究多糖構(gòu)效關(guān)系，進而探尋多糖的活性中心、闡明結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系及松樹蕈多糖的開發(fā)與應(yīng)用具有重要的意義。乙酰基的取代位置、取代度大小、乙酰化產(chǎn)物的空間構(gòu)象等均可影響其抗氧化活性，目前其構(gòu)效關(guān)系和作用規(guī)律尚不清楚，仍有待進一步研究。

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Acetylated modification and antioxidant activity of polysaccharides fromTricholomamatsutake

XU Tian-tian, CHEN Yi-yong*

(School of Biology and Food Engineering, Changshu Institute of Technology, Changshu 215500,China)

Polysaccharides fromTricholomamatsutake(TMP) was actylated by acetic anhydride, and its acetylated modification was studied. Effect of polysaccharides-to-acetic anhydride ratio, reaction time and reaction temperature on the substitution degree of actylated polysaccharides fromTricholomamatsutake(Ac-TMP) were investigated through the single factor experiment. The optimization of acetylation was obtained by response surface experiments with BoxBehnken design. Antioxidant activityinvitroof Ac-TMP was assessed by DPPH, hydroxyl and superoxide anion free radical scavenging assays. The optimal conditions were: polysaccharides-to-acetic anhydride ratio 1∶34.07(g∶mL), reaction time 2.8 h and reaction temperature 42.42 ℃.Under the above conditions, the degree of substitution was 0.587. Compared with TMP, scavenging capacities of Ac-TMP against hydroxyl free radicals and DPPH free radicals were reduced, but the scavenging capacity against superoxide anion free radicals was improved.

polysaccharides fromTricholomamatsutake; acetylation; response surface methodology; antioxidant activity

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201704026

本科生(陳義勇副教授為通訊作者，E-mai:chenyyxp@126.com)。

國家星火計劃項目(No 2015GA690021)

2016-04-28，改回日期：2016-09-22