蠶豆醬傳統發酵微生物群落中的菌株相互作用分析

范子豪，朱林江，劉思遠 ，王佳琪 ，李崎*

1(江南大學，工業生物技術教育部重點實驗室，江蘇 無錫，214122) 2(江南大學 生物工程學院，江蘇 無錫，214122)

蠶豆醬傳統發酵微生物群落中的菌株相互作用分析

范子豪1,2，朱林江1,2，劉思遠1,2，王佳琪1,2，李崎1,2*

1(江南大學，工業生物技術教育部重點實驗室，江蘇 無錫，214122) 2(江南大學 生物工程學院，江蘇 無錫，214122)

蠶豆醬傳統發酵過程中微生物菌群在不同批次保持相對穩定，為了分析這種微生物群落的穩定形成機制，該研究以從發酵過程中分離的不同基因型菌株為實驗對象，利用杯碟法和濾紙片法分析優勢好氧菌與兼性厭氧芽孢桿菌、乳酸菌及酵母菌的相互作用，同時利用PCR技術檢測優勢菌株基因組內可能存在的抗菌肽編碼基因。研究結果表明，所有厭氧菌和酵母菌株均被1株或多株優勢生長的好氧芽孢桿菌菌株抑制，而且部分優勢菌株存在較強的抑制作用，同時抑制多個菌種的生長，其中以1株BacillussubtilisHYM05，1株B.amyloliquefaciensHYM24以及1株B.tequilensisHYM42為典型代表。通過PCR探測，發現HYM42和HYM05的基因組中存在編碼Subtilosin以及Plipastatin的基因，而3株菌的基因組中均沒有完整地編碼Surfactin的3個基因。所以，蠶豆醬傳統釀造過程中，好氧芽孢桿菌存在生長優勢，通過多個菌株之間的協同相互作用，抑制其他微生物生長，在各個批次之間形成相對穩定的微生物群落結構。

相互作用；杯碟法；濾紙片法；芽孢桿菌；細菌素

豆瓣醬，也叫蠶豆醬，以豆瓣、谷物、面粉等植物性原料發酵而成，是我國很多地區傳統的調味品。豆瓣營養豐富，經過發酵后，大分子物質經過微生物代謝和一些物理化學反應后被分解轉化成多肽、氨基酸、脂肪酸、低聚糖、單糖等，加上光照、溫度變化等也產生一系列非酶促化學反應。這些復雜的微生物發酵和非酶促反應，給豆瓣醬產品帶來獨特的風味特色[1-2]。

豆瓣醬的釀造歷史可以追溯到清朝。數百年來人們都遵循著最傳統的釀造技藝，大致可以分為4個部分，包括原料的處理，制曲，發酵和罐裝[3]。釀造的核心是微生物發酵，豆瓣醬的發酵過程是一個天然的多菌種混合發酵過程。蒯輝等人利用基于培養的PCR指紋技術和未培養的PCR-DGGE技術，跟蹤研究了豆瓣醬發酵過程中微生物群落的動態變化。研究結果表明，豆瓣醬的發酵過程有多種微生物參與，好氧芽孢桿菌為優勢菌群，包括枯草芽孢桿菌、淀粉液化芽孢桿菌、特基拉芽孢桿菌等；同時檢測到數量較少的厭氧菌、乳酸菌和酵母菌，其中厭氧菌以兼性的蠟狀芽孢桿菌為主，而乳酸菌在發酵前期的鹽水中大量存在，但發酵10天后其數量顯著下降，并持續保持較低水平；酵母菌在發酵中期開始生長并被檢測到，但是一直保持在較低水平。此外，通過比較多個不同時間的發酵批次的微生物群落表明，這種微生物群落結構的變化可在不同發酵批次之間保持相對穩定[4]。

不同地區的豆醬發酵過程的微生物群落結構存在一定差異，體現地域差異性，比如我國東北地區的大醬傳統發酵過程含有芽孢桿菌、乳桿菌、明串珠菌等[5]，而在東部地區生產豆醬的過程則以芽孢桿菌、乳桿菌、魯氏酵母等為主[6]；部分韓國豆醬的生產過程由芽孢桿菌主導，而另一些則由乳酸菌主導[7]。

所以，傳統豆醬生產過程中會形成具有各自特點的微生物群落，目前的研究主要集中在醬醅微生物群落組成，對豆瓣醬發酵過程中微生物群落穩態形成機制卻研究很少。一般而言，微生物相互作用是微生物群落結構穩定形成的重要基礎，本次研究在前期的蠶豆醬發酵微生物群落結構研究基礎上，利用分離培養的各個菌株，分析菌株之間的相互作用，并且利用PCR技術初步分析了具有抑菌能力的好氧芽孢桿菌菌株的抗菌肽編碼基因，希望能為醬醅中微生物群落穩定的原因提供合理解釋及證據。

1 材料與方法

1.1 實驗所用菌種

實驗所用菌種均為從豆瓣醬醬醅中分離所得，并且由本實驗室保藏。在菌株相互作用分析實驗過程中，將所用菌株分為實驗菌和指示菌，實驗菌是指在醬醅發酵過程中的優勢好氧菌株，包括解淀粉芽孢桿菌，特基拉芽孢桿菌以及枯草芽孢桿菌；指示菌為醬醅發酵過程中，數量保持在較低水平的菌株，包括蠟狀芽孢桿菌、乳酸菌和酵母菌，具體菌種名，菌種來源以及編號見表1。

表1 實驗菌和指示菌菌種名稱及編號

1.2 培養基及培養條件

芽孢桿菌使用LB培養基進行活化和擴培，37 ℃好氧搖床培養24 h；乳酸菌使用MRS培養基進行活化和擴培，37 ℃厭氧培養24 h；酵母菌使用YPD培養基進行活化和擴培，28 ℃好氧培養48 h。

1.3 優勢好氧菌對蠟狀芽孢桿菌、乳酸菌以及酵母菌的抑制作用分析

1.3.1 濾紙片法[8]

使用中速定性濾紙，將濾紙剪成直徑1.6 cm的小濾紙片，滅菌備用。實驗菌株好氧培養，使用LB培養基，培養至OD600達到1.2。將滅菌的瓊脂培養基(芽孢桿菌用LB，乳酸菌用MRS，酵母用YPD培養基)冷卻至50 ℃左右倒板，凝固后，涂布100 μL活化好的指示菌，再用濾紙片均勻地蘸取實驗菌培養液，平坦地放置在平板上，以無菌水作為對照，37 ℃培養48 h后測量抑菌圈直徑。

1.3.2 杯碟法(牛津杯法)[9]

牛津杯使用藥典級，內徑6 mm，外徑8 mm，高10 mm，誤差0.02 mm，滅菌備用。實驗菌培養至OD600達到1.2后，12 000 r/min離心10 min，取上清液，用0.22 μm濾膜濾菌備用。將滅菌的瓊脂培養基制成平板，指示菌在菌濃達到OD600為0.7的時候涂布平板。將牛津杯豎直放在涂布有指示菌的平板上，輕輕按壓。在牛津杯中加入230 μL上述培養液上清液，并將平板放入4 ℃冰箱中預擴散8～10 h，然后放入恒溫培養箱中，適宜溫度培養48 h，觀察是否出現抑菌圈。

1.4 PCR檢測優勢芽孢桿菌基因組的抗菌肽合成基因

1.4.1 實驗菌基因組DNA的提取

各個菌株基因組的提取，采用十六烷基三甲基溴化銨法(CTAB)[10]。

1.4.2 抗菌肽基因的PCR檢測

采用TouchDown-PCR (TD-PCR)進行PCR檢測，可降低假陽性的現象[11-13]。

檢測subtilin，subtilosin，surfactin以及plipastatin的編碼基因[11-13]。編碼基因以及對應的引物如表2所示。TD-PCR反應體系為50 μL，包括25 μL Premix Taq (TaKaRa)，5 μL上游引物，5 μL下游引物，5 μL模板以及10 μL ddH2O。TD-PCR反應條件以編碼subtilin的SpaS基因為例，95 ℃預變性3 min，首先94 ℃變性30 s，60 ℃退火50 s，72 ℃延伸1 min完成第1個循環，隨后退火溫度降低0.5 ℃繼續上一個循環，循環20次，直至退火溫度降低為50 ℃，然后進行95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸50 s，15個循環，其余基因只需要改變溫度梯度的上下限和退火溫度即可，最后用1%瓊脂糖凝膠電泳驗證。

表2 Subtilin，subtilosin，surfactin以及plipastatin的編碼基因及其引物

2 結果與討論

2.1 優勢芽孢桿菌與蠟狀芽孢桿菌的相互作用

在蠶豆醬的發酵過程中，優勢好氧芽孢桿菌的數量維持在108CFU/g水平，而兼性厭氧的蠟狀芽孢桿菌在103～104CFU/g，2者相差4個數量級。使蠟狀芽孢桿菌維持在較低水平，是該蠶豆醬發酵的特點之一。為了解析這一群落結構形成的內在機制，將所有分離的好氧菌菌株與隨機挑選的蠟狀芽孢桿菌菌株進行相互作用分析。根據初篩結果，所有的優勢芽孢桿菌中，有3株具有較為廣譜的抑菌能力的細菌，分別是BacillussubtilisHYM05，B.amyloliquefaciensHYM24和B.tequilensisHYM42，后續實驗均以這3株菌為實驗菌。指示菌所用的蠟狀芽孢桿菌均為醬醅中分離所得，隨機挑選其中5株作為實驗指示菌，編號分別為HYM79，HYM88，HYM89，HYM78和HYM77。實驗中，3株實驗菌對指示菌均表現出較好的抑制性能，抑菌實驗結果如表3所示。濾紙片法和杯碟法的結果相一致(表4)，而濾紙片法可以更為直觀地通過抑菌圈直徑來判斷實驗菌抑菌能力的強弱。3株實驗菌對不同蠟狀芽孢桿菌菌株的抑菌效果不同，HYM05不能抑制HYM78的生長，而對HYM77的抑制效果較為明顯，抑菌圈直徑達到了2.27cm，如圖1A所示。HYM42能夠抑制5株蠟狀芽孢桿菌中的4株，且產生較明顯的抑菌圈，如以HYM78為指示菌時，抑菌圈最大，直徑為2.33cm，如圖1B所示。由以上結果可知，HYM05、HYM24和HYM42之間存在不同的抑菌機制，此外，所有分離培養的蠟狀芽孢桿菌菌株均被1株或多株好氧芽孢桿菌菌株所抑制。所以，蠟狀芽孢桿菌在蠶豆發酵過程中維持在較低水平，可能與好氧芽孢桿菌的抑制作用相關。其實，這種芽孢桿菌之間的相互作用，也在其他傳統發酵過程中被發現，如韓國豆醬[14]和西非的發酵調味品等[15]。

圖1 濾紙片法分析B. subtilisHYM05，B. amyloliquefaciensHYM42對B.cereusHYM77和HYM78的抑菌作用Fig.1 The inhibitory effect of HYM05 and HYM42 on HYM77 and HYM75 respectively

BacillussubtilisBamyloliquefaciensBtequilensisHYM05HYM24HYM42蠟狀芽孢桿菌BacilluscereusHYM79+--BcereusHYM88++++BcereusHYM89++++BcereusHYM78-+++BcereusHYM77++++乳酸菌WeissellaconfusaHYM106+--WconfusaHYM105---WparamesenteroidesHYM109+--WparamesenteroidesHYM157-+-StreptococcusmacedonicusHYM119--+SmacedonicusHYM136+--酵母菌Zygosaccharomycesrouxii4#--++

注：-表示沒有抑菌圈，+表示有抑菌圈且直徑在1.6～1.9 cm，++表示有抑菌圈且直徑在2.0～2.3 cm。

表4 杯碟法相互作用結果

注:-表示沒有抑菌圈，+表示有抑菌圈。

2.2 優勢芽孢桿菌與乳酸菌的相互作用分析

不同于其他傳統發酵過程，蠶豆醬發酵過程中乳酸菌的數量很少。雖然在發酵初期的鹽水能夠大量存在，多個菌株已被分離培養，但發酵10 d后往往很難被檢測。這一現象與其他豆醬發酵過程存在較大差異[4]，所以將分離培養的乳酸菌菌株與具有優勢生長的好氧菌株之間進行相互作用分析。首先是隨機選擇2株乳酸菌與所有好氧芽孢桿菌菌株進行相互作用分析，結果表明同樣的3株菌HYM05、HYM24和HYM42對乳酸菌表現出一定的抑制作用，如表3所示。牛津杯法得到的結果和濾紙片法不同，HTM24和HYM42在牛津杯法實驗中沒有表現出對乳酸菌的抑制作用，如表4所示。

3株實驗菌中，HYM05對乳酸菌的抑制作用最為明顯，如對HYM109的抑菌圈為1.97 cm，如圖2所示。根據抑菌圈大小判斷，對乳酸菌的抑制作用要小于對蠟狀芽孢桿菌的抑制作用。而在蠶豆醬發酵過程中，乳酸菌的數量明顯小于蠟狀芽孢桿菌，所以乳酸菌在蠶豆醬發酵過程中可能受到這些因素的抑制作用，難以生長。

圖2 濾紙片法分析B. subtilisHYM05對乳酸菌W. paramesenteroidesHYM109的抑菌作用Fig.2 The inhibitory effect of HYM05 on HYM109

2.3 優勢芽孢桿菌與酵母的相互作用分析

蠶豆醬發酵過程的中后期，酵母開始生長，但數量維持在103CFU/g的較低水平，表明酵母菌生長也受到一定抑制。蠶豆醬發酵過程中分離的酵母，均屬于魯氏酵母，而且根據M13-PCR指紋的基因型分析，都是同1株菌，即Zygosaccharomycesrouxii。研究中考察了上述3株菌對酵母的抑制作用，以1株從醬醅中分離得到的魯氏酵母(Zygosaccharomycesrouxii4#)為例，濾紙片法和牛津杯法的實驗結果如表3和表4所示。

由表3和表4可以看出，只有HYM42表現出了對酵母的抑制作用，抑制作用相當明顯，抑菌圈直徑達到了2.33 cm，如圖3所示。

圖3 HYM05對Zygosaccharomycesrouxii4#的抑菌作用Fig.3 The inhibitory effect of HYM05 on Zygosaccharomycesrouxii 4#

2.4 Touchdown PCR檢測優勢芽孢桿菌基因組的抗菌肽合成基因

芽孢桿菌能夠分泌多種抗菌物質，包括核糖體途徑合成的細菌素subtilin、ericin、subtilosin A等和非核糖體途徑合成的低分子量抗菌肽表面活性素surfactin、伊枯草菌素(iturin)和溶桿菌素(bacilysin)等[16-18]。根據以上菌株的相互作用分析，結果表明B.subtilisHYM05，B.amyloliquefaciensHYM24和B.tequilensisHYM42這3株菌具有較強的抑菌作用，而且存在不同的抑菌表型，所以采用TouchdownPCR檢測技術，分析這3株基因組中可能存在的抗菌肽合成基因。這種PCR檢測方法可用于初步鑒定微生物合成細菌素或抗菌肽的能力[13]。實驗結果如表5所示，結果表明HYM42以及HYM05的基因組中存在可以編碼抗菌肽的基因，而HYM24的基因組中，由于某些基因的缺失，并沒有發現能夠編碼對應細菌素/脂肽的基因，需要做進一步的研究。

表5 四種細菌素/脂肽PCR探測結果

3株實驗菌的基因組中，均沒有編碼Subtilin的spaS基因。HYM42和HYM05的基因組中，存在編碼Subtilosin的全部基因以及編碼Plipastatin的pps基因，電泳圖譜如圖4所示。Subtilosin是一種環狀細菌素，分子量較小，有特殊蛋白結構，它的抗菌譜很寬，對革蘭氏陽性、陰性、好氧菌和厭氧菌都有很好的抑菌作用[19]。Plipastatin是一種脂肽類抗生素，有較為廣譜的抑菌譜。3株菌中，編碼Surfactin的3個基因均有缺失，HYM24缺失sfp基因，而HYM42和HYM05則缺失srf/lch基因。

A:編碼抗菌肽subtilosin基因的檢測，其PCR擴增產物大小1200bp，B：編碼plipastatin基因的PCR檢測，大小1029bp圖4 Subtilosin以及plipastatin的編碼基因電泳圖譜Fig.4 The electrophoretogram of genes encoding subtilosin and plipastatin

3 結論

蠶豆醬傳統發酵過程中形成的微生物群落，是在特定生產環境下，由工藝條件控制，而自發形成的群落。這種群落結構能夠在不同發酵批次之間保持相對穩定，比如本研究的蠶豆醬發酵過程，總是由好氧芽孢桿菌主導，乳酸菌和酵母含量少。這種群落結構穩定地自發形成，應與微生物之間的相互作用相關。本次研究結果表明，多個優勢生長的好氧菌菌株能夠協同抑制兼性厭氧的蠟狀芽孢桿菌、乳酸菌以及酵母菌，表現出一定的生長優勢。其中對蠟狀芽孢桿菌的抑制作用最為顯著，表明好氧芽孢桿菌的優勢生長將其控制在較低水平，提高食品安全。好氧菌對乳酸菌和酵母菌的抑制作用相對較弱，但是后兩者的數量在蠶豆醬發酵過程中保持在十分低的水平，表明它們的生長應該受到另一些因素的抑制，有待進一步研究。

發酵過程的優勢好氧菌往往由不同菌種和多種不同基因型菌株組成，本次研究結果證實，這些菌株存在顯著的表型差異，他們之間存在協同抑菌功能。其中分離出來3株菌具有不同的抑菌能力，通過PCR檢測關鍵合成基因表明，其中兩株菌即B.subtilisHYM05和B.tequilensisHYM42可能合成細菌素Subtilosin和Plipastatin；而B.amyloliquefaciensHYM24合成的抗菌肽則需要做進一步分析。總之，本次研究表明傳統發酵過程微生物群落結果的形成，應與微生物相互作用相關，而且這種相互作用是各個微生物菌株個體之間協同作用的結果。

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Interaction analysis of the strains isolated from traditional fermented broad bean Paste

FAN Zi-hao1,2, ZHU Lin-jiang1,2, LIU Si-yuan1,2, WANG Jia-qi1,2, LI Qi1,2*

1(The Key Laboratory of Industrial Biotechnology, Ministry of Education, Jiangnan University, Wuxi 214122, China) 2(School of Biotechnology, Jiangnan University, Wuxi 214122, China)

To analyze the mechanism of the microbial community stability during the formation of broad bean paste, filter paper method and oxford cup method were used. Touch-down PCR (TD PCR) was also performed to detect the genes encoding certain antibiotics including subtilosin, subtilin, surfactin and plipastatin. Results showed that all the anaerobic bacteria and yeast could be inhibited by one or more aerobic bacteria, such asBacillussubtilisHYM05,B.amyloliquefaciensHYM24, andB.tequilensisHYM42. TD PCR detection indicated that the genes encoding subtilosin and plipastatin existed in the genome of HYM42 and HYM05.

interaction; filter paper method; oxford cup method;Bacillussp.; antibiotics

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201704005

碩士研究生(李崎教授為通訊作者，E-mail:shmily1248505604@hotmail.com)。

國家自然科學基金(No. 31601445 &No. 31571942)；國家高新技術研究發展計劃(863計劃，No.2013AA102106-03)；江蘇省第四期“333高層次人才培養工程”(BRA2012048)和江蘇省111引智計劃(No.111-2-06)

2016-10-06，改回日期：2016-11-20