基于化學成分和生物效應的栝樓桂枝湯質量評價研究

李煌+喬麗菲+張玉琴+許文+徐偉+褚克丹+林羽

[摘要] 該研究采用超高效液相色譜-串聯質譜的方法，分析測定栝樓桂枝湯中的24種化學成分，在此基礎上，結合嗎替麥考酚酯誘導的斑馬魚神經元損傷藥效模型對栝樓桂枝湯進行神經保護生物活性評價，旨在探討建立一種綜合化學成分與生物效應的栝樓桂枝湯質量評價模式，研究結果表明建立的方法可行，基本穩定可靠，可為中藥復方的質量控制研究提供參考。

[關鍵詞] 栝樓桂枝湯； 超高效液相色譜-質譜； 斑馬魚神經損傷模型

[Abstract] The paper was aimed to establish a quality evaluation model for Gualou Guizhi decoction based on the chemical compositions and biological effects. Ultra high performance liquid chromatograph-mass spectrometer was used to analyze and determine 24 kinds of chemical compositions in Gualou Guizhi decoction， and then， biological activity effect was quantitatively assessed in a zebrafish neuronal injury model which was induced by mycophenolate mofetil （MMF）. As a result， the established method for quality evaluation of Gualou Guizhi decoction based on the chemical compositions and biological effects is feasible， stable and reliable， which can provide reference for quality control of compound Chinese medicines.

[Key words] Gualou Guizhi decoction； UPLC-MS； Zebrafish neuronal injury model

在保證安全性的前提下，中藥復方的質量控制，其關鍵在于評價其有效性與可控性。然而目前的質控方法，主要通過檢測一種或某幾種有效成分來進行評價，存在一定的缺陷，如缺乏質量控制的科學性與系統性，存在非法添加對照品的風險等。隨著近年來生物活性測定法，具有整體可控，藥效密切相關等優勢的凸顯，已逐漸成為中藥質量控制和評價的重要發展方向[1-4]。

栝樓桂枝湯，處方來源于張仲景的《金匱要略》，具有解肌祛邪，舒緩筋脈之功效。在課題組前期的研究中發現，該方通過多途徑發揮對MCAO模型大鼠的腦保護作用[5-9]。目前，斑馬魚模型已被廣泛應用于中樞神經保護的藥物活性篩選[10-12]。本實驗在采用超高效液相色譜-串聯質譜分析測定化學成分的基礎上，結合斑馬魚神經元損傷模型，進行栝樓桂枝湯對中樞腦保護的生物活性檢測，初步探索建立基于化學測定和生物活性的中藥復方質量評價模式，為豐富中藥復方質量控制研究提供參考。

1 材料

1.1 儀器

ACQUITY UPLC H-Class超高效液相色譜儀，Xevo TQD三重四級桿質譜儀（美國Waters公司）；KQ-500DE數控超聲儀（昆山市超聲儀器有限公司）；解剖顯微鏡（SZX7，OLYMPUS，Japan）；與顯微鏡相連的相機（TK-C1481EC）；精密電子天平（CP214，OHAUS，America）；AZ100型熒光顯微鏡（尼康公司）；NIS-Elements D 3.10 高級圖像處理軟件（Media Cybernetics 公司）。

1.2 試劑

沒食子酸甲酯、芍藥內酯苷、2-羥基肉桂酸、酸棗仁皂苷A，購自于成都曼斯特生物科技有限公司，純度均≥98%；沒食子酸、原兒茶酸、兒茶素、對羥基苯甲酸、香草酸、芍藥苷、甘草苷、甘草素、肉桂酸、甘草酸、6-姜酚、甘草次酸、獐牙菜苦苷、山柰酚-3-O-蕓香糖苷、4-羥基苯甲酸甲酯，購自于中國食品藥品檢定研究院，純度均≥99%；氧化芍藥苷、4-羥基肉桂酸、紫云英苷、3-羥基肉桂酸、異甘草苷、甘草查爾酮A、8-姜酚、6-姜烯酚購于上海同田生物科技有限公司，純度均≥98%。

色譜純乙腈（美國Merck公司）；水為超純水。嗎替麥考酚酯（購自上海晶純實業有限公司，批號H14J6335），吖啶橙染料（Alorich，批號494-38-2）；谷胱甘肽，簡稱GSH，上海晶純實業有限公司，批號為45463；甲基纖維素（Aladdin，Shanghai，China）。

1.3 藥材

栝樓、白芍、桂枝、甘草、生姜、大棗購自福州回春中藥飲片廠有限公司，上述藥材經福建中醫藥大學中藥鑒定教研室黃澤豪副教授鑒定，均符合2015年版《中國藥典》相關要求。

2 方法

2.1 栝樓桂枝湯制備

取生姜、桂枝藥材，分別按10倍加量水，采用水蒸氣蒸餾法提取6 h，并收集其揮發油，再將上述藥渣與處方中其他4味藥材混合，按處方比例加入10倍水，煎煮2次，每次1.5 h，過濾合并藥液，濃縮藥液，置-4 ℃冰箱保存備用。

2.2 超高效液相色譜分析測定栝樓桂枝湯中的24種成分

2.2.1 UPLC的色譜條件

色譜柱：Waters CORTECS C18（2.1 mm×100 mm，1.6 μm），流動相為水（含0.1%甲酸，A）-乙腈（B），梯度洗脫，條件見表1，流速0.25 mL·min^-1。進樣量為1 μL，柱溫為 45 ℃。

質譜條件：去溶劑氣體為氮氣，碰撞氣體為氬氣，離子源溫度150 ℃，毛細管電壓3.0 KV，錐孔電壓30.0 V，去溶劑氣體流量800 L·h^-1，錐孔氣流50 L·h^-1，脫溶劑溫度200 ℃。

2.2.2 混合對照品溶液的制備

稱取 24 種待測物標準品和 3 種內標物標準品適量，精密稱定，甲醇適量超聲溶解，定容制刻度，搖勻，分別制備成濃度為1.00 g·L^-1的對照品母液和內標儲備液。

2.2.3 供試品溶液溶液的制備

精密吸取栝樓桂枝湯適量，置于25 mL量瓶中，先加50%甲醇45 mL超聲提取30 min，靜置，放冷，再用50%甲醇定容，搖勻，靜置，取一定量至EP管中，12 000 r·min^-1離心10 min，取上清液過0.22 μm微孔濾膜，取續濾液，即得。

2.2.4 系統適用性試驗

2.2.4.1 線性關系考察 取上述24種對照品的儲備液，精確配制不同濃度梯度的混合對照品溶液，在上述色譜條件下分別進樣測定，重復3 次，將各成分特征碎片離子峰面積平均值（Y）與被測組分的質量濃度（X，mg·L^-1）進行線性分析，獲得回歸方程、相關系數及線性范圍；以信噪比（S/N）等于3，計算24種待測成分的檢出限LOD，以信噪比（S/N）等于10，計算24種待測組分的定量限LOQ，結果見表2。

2.2.4.2 精密度、穩定性、重復性及回收率試驗 按照藥典的相關要求，分別進行了儀器精密度、樣品的穩定性、重復性及回收率試驗，試驗結果均符合要求。

2.2.5 3批栝樓桂枝湯樣品的含量測定

分別精密稱取3批樣品，按2.2.3項制備栝樓桂枝湯樣品溶液，按2.2.1項下色譜，質譜條件進行樣品測定，分別將各成分峰面積代入相應的回歸方程，計算獲得樣品中24種活性成分的含量，其結果見表3。

2.3 栝樓桂枝湯對斑馬魚中樞神經的保護作用

隨機選取270尾受精后1 d野生型AB品系斑馬魚于六孔板中，每孔（實驗組）均處理30尾斑馬魚，用嗎替麥考酚酯誘發斑馬魚中樞神經損傷。分別水溶給予A組60，100，130 mg·L^-1和B組924，1 540，2 000 mg·L^-1，陽性對照藥GSH 154 mg·L^-1，同時設置正常對照組（養魚用水處理斑馬魚）和模型對照組，每孔（實驗組）容量為3 mL。A組和B組分別與嗎替麥考酚酯共同處理24 h后，用吖啶橙進行染色，染色后每個實驗組隨機選取10尾斑馬魚在熒光顯微鏡下拍照并采集數據，用NIS-Elements D 3.10 高級圖像處理軟件進行圖像分析，計算斑馬魚中樞神經凋亡細胞熒光強度（S），進行定量分析，并統計。統計學處理結果用±s表示，A組和B組對斑馬魚中樞神經的保護作用計算公式如下。

中樞神經保護作用=S模型對照組-S供試品組S模型對照組-S正常對照組×100%

結果采用方差分析和Dunnett′s t-檢驗進行統計學分析，P<0.05表明具有顯著性差異。

3 結果與分析

3.1 栝樓桂枝湯中24種成分的UPLC測定

在上述色譜條件下對照品和栝樓桂枝湯的色譜見圖1，2，所有樣品在保留時間6.5 min內，均得到較好的分離；栝樓桂枝湯測定24種成分的回歸方程、相關系數及線性范圍結果見表2，3批栝樓桂枝湯含量測定結果見表3。

3.2 斑馬魚損傷模型的建立

采用0.25 mol·mL^-1嗎替麥考酚酯處理受精后1 d野生型AB品系斑馬魚24 h，建立斑馬魚中樞神經損傷模型。AO 染料染色，凋亡細胞呈熒光綠色，熒光顯微鏡下拍照觀察斑馬魚神經凋亡細胞熒光強度來判斷造模成功率（造模成功率95%），見圖3。斑馬魚凋亡細胞熒光強度定量分析可對藥物對神經細胞保護效率進行快速、可靠的評價。

3.3 栝樓桂枝湯對斑馬魚損傷模型的最大耐受濃度測定

栝樓桂枝濃縮干燥的粉末，采用養殖用水配制成2 g·L^-1母液，實驗時，現場配制成1，10，100，250，500，1 000，2 000 mg·L^-1質量濃度的樣品溶液，結果顯示在2 000 mg·L^-1時，除嗎替麥考酚酯誘導的毒性（軀干彎曲，腦袋變性）外，對斑馬魚未產生其他毒副作用，也未引起斑馬魚死亡，且2 000 mg·L^-1為最大耐受濃度檢測上限。因此確定栝樓桂枝湯對斑馬魚MTC為2 000 mg·L^-1。

3.4 栝樓桂枝湯對斑馬魚中樞神經的保護作用

將栝樓桂枝湯母液為2 g·L^-1，分別加入1 386，2 310，3 000 μL到3 mL養殖用水中，配制成低、中、高3個劑量組（924，1540，2 000 mg·L^-1）。按2.3項下方法測定栝樓桂枝湯處理下斑馬魚凋亡細胞F，計算神經細胞保護率P，結果見表4。

模型對照組斑馬魚中樞神經凋亡細胞熒光強度與正常對照組比較P<0.001，表明模型建立成功；陽性對照藥GSH 154 mg·L^-1組斑馬魚中樞神經凋亡細胞熒光強度為83 460像素，與模型對照組比較P<0.001，其對斑馬魚中樞神經保護作用為83%，說明GSH對斑馬魚中樞神經有保護作用。

栝樓桂枝湯的924，1 540，2 000 mg·L^-1組斑馬魚中樞神經凋亡細胞熒光強度分別為106 711，69 716，70 174像素，中樞神經保護作用分別為65%，93%，93%，與模型對照組比較，各組均P<0.001，提示栝樓桂枝湯在本實驗濃度條件下對斑馬魚中樞神經有明顯的保護作用，見表4，圖4。

4 討論

4.1 色譜條件的優化

考慮到栝樓桂枝湯中，可能存在著同分異構體易造成干擾的問題，如桂枝藥材存在2，3，4-位，3種不同位置的羥基肉桂酸；白芍中芍藥苷與芍藥內酯苷，結構上僅差1個酯鍵；甘草藥材中的甘草苷與異甘草苷等成分，其母離子和子離子完全一樣，若未能選擇好色譜條件，則可能影響質譜檢測。因此，本實驗首先對流動相的進行了優選，預實驗中考察了乙腈-水、甲醇-水、乙腈-0.1%甲酸、甲醇-0.1%甲酸、乙腈-0.02 mol·L^-1乙酸銨、乙腈-0.02 mol·L^-1乙酸銨-0.1%甲酸水等流動相條件。結果發現：①甲醇體系的分離度不如乙腈體系；②甲酸或乙酸銨對色譜分離及峰形改善均有作用，但其對質譜響應與峰形改善程度與單用甲酸相差不大，故本實驗選擇乙腈-0.1%甲酸作為流動相。

其次，實驗中篩選了不同類型的色譜柱Waters CORTECS C18，Waters HSS T3 C18，Phenomenexkintecx，結果發現1.6 μm的超高效液相色譜柱，其分離效果和檢測的靈敏度均高于其他色譜柱，且達到基線分離的分析時間縮短，分離的效率較高，所以本實驗中選擇Waters CORTECS C18色譜柱。

4.2 質譜條件優化

結合文獻研究，栝樓桂枝湯中主要成分為白芍萜苷類及甘草三萜酸類成分。實驗中分析比較了正、負離子檢測模式等質譜條件，發現上述2類成分在負離子模式條件下檢測靈敏度顯著高于正離子模式，并且其他化合物在該模式下也有穩定的子離子和較高的響應度，故最終選擇負離子模式。

4.3 栝樓桂枝湯化學成分與藥效相關性

中藥復方質控評價體系的建立其指標選擇是關鍵問題，本文選擇的分析測定成分主要基于以下方面考慮，一是前期研究發現的復方中具有透過血腦屏障的作用成分如：如沒食子酸、芍藥苷、甘草素、甘草苷等[7]；或已有文獻報道具有神經保護作用成分芍藥內酯苷[13]、6-姜酚[14]、甘草酸[15]；此外，還包括了構成復方各味藥材的藥典主要測定指標。

4.4 斑馬魚中樞神經保護藥效學實驗

目前缺氧缺血再灌注腦損傷的模型，通常選擇大鼠、豬、羊，鑒于造模后的大鼠往往沒有任何精神、運動障礙的表現，而采用羊、豬胎兒模型則實驗成本較高[16]。因此，建立一個新型、經濟、簡便且能大量繁殖的動物模型，對缺氧缺血再灌注腦損傷的研究，具有重要的意義。

斑馬魚作為一種新型模式動物，具有易于飼養、發育快速、胚胎透明、繁殖力強等特點，已在藥物活性篩選中廣泛應用[17-18]，特別是在神經系統疾病領域，如，李曉穩等[10]建立了采用斑馬魚神經元損傷模型評價養血清腦顆粒神經細胞保護作用的模式。陳衍晨等[11]研究發現，缺氧會導致斑馬魚腦細胞內c-fos基因表達上調，可能是導致缺氧后期腦細胞凋亡激增的機制之一。Buenafe等[19]發現丹參丙酮粗提物能夠抑制戊四氮誘導的斑馬魚胚胎癲癇發作。

[致謝] 斑馬魚中樞神經保護實驗得到了杭州環特生物科技有限公司的技術支持。

[參考文獻]

[1] 馮偉紅，李春，信偉梅，等.生物測定法用于中藥質量評價的探索研究——以夏枯草抗氧化活性與總酚酸含量相關性的研究為例[J]. 中國中藥雜志，2016，41（14）：2660.

[2] 李寒冰，鄢丹，武彥舒，等. 基于抗病毒活性檢測的板藍根質量生物評價方法及優化研究[J]. 中草藥，2011，42（8）：1560.

[3] 鄢丹，肖小河. 基于道地藥材和生物測定的中藥質量控制模式與方法研究——黃連質量生物測定[J]. 藥學學報，2011，46（5）：568.

[4] 肖小河，金城，趙中振，等. 論中藥質量控制與評價模式的創新與發展[J]. 中國中藥雜志，2007，32（14）：1377.

[5] Zhang Yuqin， Li Huang， Huang Mei， et al.Neuroprotective effects of Gualou Guizhi decoction in vivo and in vitro[J]. J Ethnopharmacol， 2014， 158：76.

[6] Hu H， Li Z， Zhu X， et al. Gua Lou Gui Zhi decoction suppresses LPS-induced activation of the TLR4/NF-κB pathway in BV-2 murine microglial cells[J]. Int J Mol Med， 2013， 31： 1327.

[7] Li Huang， Ye Miao， Zhang Yuqin， et al.Blood brain barrier permeability and neuroprotection of GualouGuizhi granule in ischemia-reperfusion injury[J]. Mol Med Rep， 2015， 12：1272.

[8] Zhang Shengnan， Zhang Yuqin， Li Huang， et al. Gualou Guizhi decoction treatment of focal cerebral ischemia/reperfusion injury via its anti-oxidative and anti apoptotic effects in rats[J].Exp Ther Med，2015， 9： 2121.

[9] 李煌，許文，徐偉. GC-MS 分析栝樓桂枝湯及其入腦的揮發性成分[J].中國中藥雜志，2014，39（8）：173.

[10] 李曉穩，佟玲，李東翔，等. 斑馬魚神經元損傷模型在養血清腦顆粒質量控制中的應用分析[J]. 中國實驗方劑學雜志，2016，22（9）：1.

[11] 陳衍晨，趙丹，卿娣，等. 缺氧再灌注斑馬魚胚胎腦部細胞凋亡及c-fos基因的表達[J]. 中國組織工程研究，2013，17（37）：6613.

[12] 羅濟璇，程燕，趙丹，等. 牛磺酸對缺氧再灌注斑馬魚幼魚腦部內質網應激相關因子表達的影響[J]. 臨床兒科雜志，2015，33（3）：269.

[13] 張玉琴，李煌，許文，等.栝樓桂枝顆粒對腦缺血再灌注損傷大鼠的血腦屏障通透性及神經保護作用[J].中華中醫藥雜志，2015，30（5）：1410.

[14] 孫承銘，謝岱希，鄭文華.6-姜酚對腦缺血損傷模型小鼠的保護作用[J].山東醫藥，2011，51（52），41.

[15] 張明發，金玉潔，沈雅琴.甘草酸保護腦損傷及改善記憶功能的藥理作用研究進展[J].藥物評價研究，2013，36（1）：59.

[16] Northington F J. Brief update on animal models of hypoxic-ischemic encephalopathy and neonatal stroke[J]. Inst Lab Animal Res，2006，47（1）：32.

[17] 殷梧， 鄒蘇琪，王光輝，等. 模式動物斑馬魚在神經系統疾病研究中的應用[J]. 生命科學， 2008，20（5）： 773.

[18] 全珊珊，吳新榮. 斑馬魚人類疾病研究的理想模式動物[J]. 生命的化學， 2008，28（3）： 260.

[19] Buenafe O E， Orellana-Paucar A， Maes J， et al. Tanshinone ⅡA exhibits anticonvulsant activity in zebrafish and mouse seizure models[J]. Neuro Sci，2013， 4（11）： 1479.

[責任編輯 孔晶晶]